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2022.03.10
体外模型
1●肿瘤靶点过表达稳转株
CAR-T细胞的作用机制是通过CAR分子的scFv特异性识别肿瘤靶点抗原，然后进行杀伤。因此，人为构建出表达肿瘤抗原的细胞，可以用来检测CAR-T的杀伤能力。例如，使用慢病毒载体将CD19基因递送至293T细胞，构建CD19-293T过表达稳转株，使293T细胞表面过表达CD19抗原，进一步验证抗原表达阳性率，并用于后期验证实验。
图1.CD19-293T细胞CD19抗原阳性率检测。
除了人为构建的肿瘤细胞模型，自然表达抗原的肿瘤细胞系也被用来检测CAR-T细胞的杀伤能力。杀伤效果的检测实验一般会用到流式细胞术、荧光素酶酶法、铬释放试验等。因此相应的，也可以构建：
荧光素酶稳转株
例如，诺华公司在2018年发表的靶向BCMA的CAR-T研究中，就使用了荧光素酶法[3]。荧光素酶可以催化荧光素氧化，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。研究者们在人多发性骨髓瘤细胞KMS-11中引入萤火虫荧光素酶（Luc）基因，构建出KMS-11-luc细胞，然后将CAR-T细胞和KMS-11-luc细胞按不同的效靶比（E:Tratio）共孵育20小时，检测细胞混合液的荧光强度，可以代表剩余的靶细胞数量。
图2.使用荧光素酶法绘制的肿瘤细胞裂解曲线[3]。
51Cr放射性标记的肿瘤细胞
2015年，在宾大和诺华的一项共同研究中，使用了铬释放法来检测CAR-T细胞的杀伤能力[4]。首先使用同位素51Cr标记U87胶质瘤细胞，然后将CAR-T细胞与肿瘤细胞按不同的效靶比共孵育，肿瘤细胞被裂解后，51Cr从细胞中释放至上清液，检测上清液51Cr的含量，可以代表裂解的肿瘤细胞的数量。
图3.使用铬释放法绘制的肿瘤细胞裂解曲线[4]。
2●Jurkat报告细胞系统
除了肿瘤细胞模型外，也可以用Jurkat报告细胞代替从PBMC分离并活化出的T细胞，来进行早期的评估试验。Jurkat细胞是人类T淋巴细胞的永生细胞系，最初在1970年代后期，从一名患有T细胞白血病的14岁男孩的外周血中建立的。在CAR-T的体外试验中，Jurkat细胞常被用于T细胞信号传导的研究。
图4.使用流式细胞术检测CAR/GFP修饰的Jurkat-RFP报告细胞的荧光表达（纵坐标：绿色荧光；横坐标：红色荧光）[5]。
体内模型
1●动物肿瘤模型
在CAR-T治疗的临床前研究中，动物肿瘤模型的药效评价尤为重要。由于小鼠基因组与人类基因组的相似程度高，并且小鼠模型的构建成本低，因此小鼠成为了研究人类疾病的最佳实验模型。而免疫缺陷小鼠对外来移植物的排斥弱，非常适合动物肿瘤模型的构建。目前国际上公认的免疫缺陷程度最高的小鼠是具有Prkdc和Il2rg基因缺陷的小鼠，这两种基因的突变使小鼠的T细胞、B细胞和NK细胞的活性完全丧失。
肿瘤细胞系异种移植模型（CellLine-DerivedXenograft,CDX）是将肿瘤细胞系移植到同种或异种动物体内形成肿瘤。肿瘤细胞系移植肿瘤保持着原发肿瘤的大部分生物学特性，成瘤效率高，实验周期短，因此很适合用于肿瘤药物的早期药效评价。在CAR-T治疗的研究中，使用含有荧光素酶基因的肿瘤细胞构建CDX模型，可以通过荧光监测肿瘤细胞的生长以及CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
人源肿瘤组织异种移植模型（Patient-DerivedXenograft,PDX）是直接用患者新鲜肿瘤组织接种于免疫缺陷小鼠建立的模型。肿瘤组织在小鼠体内环境生长并传代2-3次，可以更好地表现亲代肿瘤性状，并且维持了肿瘤的异质性。与CDX模型相比，PDX模型最大的优势是保留了亲本肿瘤的异质性和组织学特性，例如细胞形态、血管系统、基质形态等，模拟了肿瘤发生的体内环境。
图5.PDX模型的构建流程[6]。
人免疫系统重建动物模型（Humanimmunesystem-engraftedmodels,HIS）是通过异种移植人类免疫细胞或组织和/或其祖细胞到免疫缺陷小鼠中产生的。这类小鼠可以更有效地模拟人体免疫应答，为肿瘤免疫、自身免疫性疾病，以及人特异性传染疾病（例如由人类免疫缺陷病毒HIV引起的获得性免疫缺陷综合征AIDS）的转化研究提供了优秀模型。
2●荧光素酶稳转株与动物肿瘤模型联合应用
与体外模型构建表达荧光素酶的肿瘤细胞的原理一致，体内模型中，也是利用荧光素氧化发光的特性，通过活体成像仪，监测体内肿瘤的大小、分布，并通过平均荧光强度（FMI）量化肿瘤的生长。例如构建急性淋巴细胞白血病的CDX模型时，可以将荧光素酶基因递送至人急性淋巴细胞白血病细胞Nalm6，构建Luci-Nalm6细胞。将不同剂量的Luci-Nalm6接种至C-NKG和NOG小鼠中，第21天的活体成像如下图所示。
图6.活体成像检测Luci-Nalm6细胞异种小鼠肿瘤模型肿瘤生长情况（上：第21天活体成像检测；下：平均荧光强度）。