抗原(靶点)的选择一直是CAR-T领域的研究重点，在上一期已详细介绍。但是仅仅有合适的抗原，缺乏共刺激信号，T细胞往往会未老先衰，起不到抗肿瘤的作用。最新的各种证据已表明，除了CAR结构中的胞外域，其共刺激域也能够对CAR-T细胞的活性，以及最终的疗效和毒性产生很大影响。也就说在CAR-T的结构中，任何一个部件都起着关键作用，所以本期我们就来看看CAR-T结构组成及其功能。
嵌合抗原受体（CAR，Chimericantigenreceptor）-T细胞免疫疗法是一种过继性细胞免疫疗法，它是利用基因技术，在T细胞内导入一个可以将CAR表达于其表面的融合基因，并使T细胞发挥作用，克服肿瘤局部免疫抑制微环境，打破宿主免疫耐受状态，靶向杀伤肿瘤细胞。
CAR-T杀伤肿瘤的流程视频（来自Kite官网）
CAR主要由三个功能域构成，分别是胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域由负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段（single-chainvariablefragment，scFv）及一段起连接作用的铰链区（Hinge）构成。胞内结构域由共刺激结构域（CostimulatoryDomain）和信号转导结构域（SignalingDomain）构成[1]。
图1.CAR的结构组成及作用机理
01
胞外结构域
1.抗原识别结构域（scFv）
▲结构组成：抗原识别结构域是CAR特异性结合肿瘤抗原的基础，其主要结构是scFv，由单克隆抗体的轻链（VL）和重链（VH）通过多肽连接而成，保留有抗体对抗原的特异性和亲和力[2]。
▲功能：scFv赋予了T细胞特异性识别并结合靶抗原的能力，与未经修饰的天然TCR-T细胞相比，其对靶抗原的亲和力显著提高。CAR-T细胞通过scFv对靶抗原的识别结合不依赖MHC抗原呈递，一方面避免了肿瘤细胞通过调节MHC分子发生逃逸，另一方面赋予了CAR-T细胞识别非肽抗原的能力[3]。
2.铰链区（Hinge）
▲结构组成：铰链区连接scFv和跨膜结构域，大多数CAR的铰链区由IgG的铰链或CD8α/CD28胞外区衍变而来。铰链区的长度取决于靶细胞抗原表位的位置及暴露程度。
▲功能：多项研究表明，CAR-T细胞活化与铰链区长度有关。调整铰链区的长度可以使CAR-T细胞和靶细胞处于最佳距离，在抗原抗体结合过程中避免大型磷酸酶的作用减弱CAR信号。然而，在某些情况下，抗原表位可能相对不可接近，需要使用更长的铰链区，使scFv可以克服空间位阻，有效结合抗原[5]。因此，抗原表位不同，铰链区的最佳长度也不同，在靶向新抗原时，可能需要相应地调整铰链区的长度。
02
跨膜结构域
▲功能：如CD3ζ跨膜域能够使CAR形成同源二聚体或与内源TCR形成异二聚体，增强CAR-T细胞活性，但也正是由于其不需要与内源TCR结合即可高度活化T细胞，而逐渐被弃用。CD8α和CD28的跨膜域由于能够促进CAR在细胞表面表达，目前在多数临床试验中采用[7]。
03
胞内结构域
1.共刺激域（CostimulatoryDomain）
▲结构组成：共刺激域通常来自CD28受体家族(CD28，ICOS)或肿瘤坏死因子受体家族(4-1BB、OX40、CD27)。
▲功能：共刺激域可实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，使T细胞持续增殖并释放细胞因子，提高T细胞的抗肿瘤能力。如CD28共刺激域使CAR-T细胞依靠糖酵解代谢，促使CAR-T细胞向效应T细胞分化。而4-1BB共刺激域促进线粒体生成，增强呼吸作用和脂肪酸氧化，抗原刺激后，CAR-T细胞优先分化为中央记忆T细胞[1]。
2.信号转导结构域（SignalingDomain）
▲结构组成：信号转导结构域通常为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεＲIγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，ITAMs）[1]。
▲功能：发挥T细胞信号转导功能。
04
CART的发展历程与未来趋势
了解了上述各个部件后，是否对于CAR的功能更加了解呢？简单来说，当T细胞表达某种嵌合抗原受体时，它们能被特定的抗原激活，启动ζ信号，ζ信号和其他信号（CD28或者OX40的可以启动增殖或者存活信号）共同作用可以引起T细胞的激活，靶向杀伤肿瘤细胞。
目前根据CAR结构是否含有共刺激结构域，可分为3代CART，即无共激区/单共激区(CD28或4-1BB)/双共激区(CD28+4-1BB)[9]。
图2.三代CAR结构比较[9]
▲第二代CAR-T细胞：引入了共刺激域(如：单共激区CD28或4-1BB)，可使CAR-T细胞持续增殖并释放细胞因子，增强抗肿瘤活性；
如已上市的两款药物均为二代CART，如诺华的Kymriah的共刺激结构域是4-1BB，而吉利德的Yescarta的共刺激区是CD28。
Kymriah
Yescarta
所属公司
诺华
Gilead(Kite)
ScFv(CD19)
鼠源FMC63
Hinge
CD8α
CD28
TransmembraneDomain
CostimulatoryDomain
4-1BB
SignalingDomain
CD3ζ
表1.Kymriah和Yescarta结构比较
▲第三代CAR-T细胞：包含两个共刺激域(如：CD28+4-1BB)，可使T细胞持续活化增殖，增强杀伤肿瘤细胞作用；
一些临床前研究表明，与第二代CAR-T细胞相比，第三代CAR-T细胞表现更好；然而，有些研究则没有发现差异；甚至在某些情况下，第三代CAR-T细胞的表现比第二代更差。这说明体外测量的CAR-T细胞效价并不能总是准确预测其在体内的功能[10-12]。
虽然，目前二代CAR-T技术的研发仍处于主流地位，但各大公司仍在积极探寻新的方向，例如同种异体CAR-T（UCAR-T）设计，可调控CAR活性的设计等等。随着临床研究的深入，研究者们除了研发新的识别肿瘤靶点，也在安全性、CAR-T体内持续性、识别多靶点等多个方向解决肿瘤复发、可能发生的副反应、实体瘤疗效差等诸多问题。未来，随着成本的下降和医保的逐渐纳入，相信CAR-T细胞治疗可以成为普通百姓可以用得起的治疗方式。谈癌色变的时代终将过去，人类生命健康事业已经起航！
参考文献：（向下滑动查看）
1.Stoiber,S.etal.LimitationsintheDesignofChimericAntigenReceptorsforCancerTherapy.Cells2019,8,pii:E472.
2.Bird,R.E.etal.Single-chainantigen-bindingproteins.Science1988,242,423-426.
3.Posey,A.D.etal.EngineeredCARTcellstargetingthecancer-associatedTn-glycoformofthemembranemucinMUC1controladenocarcinoma.Immunity2016,44,1444-1454.
4.Maus,M.V.etal.Tcellsexpressingchimericantigenreceptorscancauseanaphylaxisinhumans.CancerImmunol.Res.2013,1,26-31.
5.James,S.E.etal.AntigensensitivityofCD22-specificchimericTCRismodulatedbytargetepitopedistancefromthecellmembrane.J.Immunol.2008,180,7028-7038.
6.Zhang,T.etal.AnNKp30-basedchimericantigenreceptorpromotesTcelleffectorfunctionsandantitumorefficacyinvivo.J.Immunol.2012,189,2290-2299.
7.Kochenderfer,J.N.etal.EradicationofB-lineagecellsandregressionoflymphomainapatienttreatedwithautologousTcellsgeneticallyengineeredtorecognizeCD19.Blood2010,116,4099-4102.
8.Ramello,M.C.etal.AnimmunoproteomicapproachtocharacterizetheCARinteractomeandsignalosome.ScienceSignaling2019,12,pii:eaap9777.
9.June,C.H.etal.CARTcellimmunotherapyforhumancancer.Science2018,359,1361-1365.
10.Zhong,X.S.etal.Chimericantigenreceptorscombining4-1BBandCD28signalingdomainsaugmentPI3kinase/AKT/Bcl-XLactivationandCD8+Tcell-mediatedtumoreradication.Mol.Ther.2010,18,413-420.
11.Yi,Z.etal.OptimizingEphA2-CARTcellsfortheadoptiveimmunotherapyofglioma.Mol.Ther.MethodsClin.Dev.2018,9,70-80.
12.Abate-Daga,D.etal.Anovelchimericantigenreceptoragainstprostatestemcellantigenmediatestumordestructioninahumanizedmousemodelofpancreaticcancer.Hum.GeneTher.2014,25,1003-1012.
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1.CAR-T是什么
2.CAR-T的发展历程
3.CAR-T疗法中的小明星--IL7
4.ArmoredCAR-T细胞疗法--IL-18
5.肿瘤治疗前景因子--IL-15
6.IL-21联合CAR-T治疗肿瘤的新策略
7.深度分析：CAR-T细胞疗法的安全性
8.NEJM最新综述：听听免疫疗法之父CarlJune对CAR-T的看法
9.NatureBiotechnology最新综述：一文看懂基因编辑技术如何助力细胞疗法？