1(西南大学食品科学学院，重庆，400715)2(重庆市生物技术研究所有限责任公司，重庆，401121)
摘要通过人体粪便体外发酵试验和动物体内、体外发酵试验，研究魔芋葡甘聚糖(konjacglucomannan，KGM)和魔芋葡甘低聚糖(konjacoligo-glucomannan，KOGM)的肠道益生性对治疗乳糖不耐受症的可能性。在健康和乳糖不耐受受试者粪便菌群的体外发酵实验中，KGM和KOGM的添加降低了发酵液的pH，提高了短链脂肪酸(shortchainfattyacids，SCFA)的产量(P<0.05)。灌胃小鼠KGM和KOGM4周后，结肠粪便的pH值降低，含水量和SCFA含量均显著增加(P<0.05)。KGM和KOGM对乳糖体外发酵特性的影响研究结果显示，KGM和KOGM组发酵液的pH值降低，SCFA含量和乳糖酶活性都得到明显升高(P<0.05)。实验结果表明，摄入KGM和KOGM可以为机体提供良好的酸性环境，有效改善肠道微生物菌群代谢产生SCFA，促进结肠发酵。KGM和KOGM作为天然安全的食材，可增加乳糖酶活性，治疗乳糖不耐受症。
关键词魔芋葡甘聚糖；魔芋葡甘低聚糖；益生性；乳糖不耐受；体外发酵
魔芋葡甘聚糖(konjacglucomannan，KGM)是魔芋块茎中通过β-1,4-糖苷键连接而成的葡萄糖和甘露聚糖聚合物。临床研究表明，KGM具有缓解便秘，降低超重和肥胖人群的体重，防止糖尿病，降低癌症风险等生理功效，食用KGM对健康有益，是一种潜在的益生元[7-8]。魔芋葡甘低聚糖(konjacoligoglucomannan，KOGM)是KGM降解形成的低聚糖，避免了KGM相对分子量大、黏度高、溶解度小等缺陷。在过去的几十年里，已经有研究表明低聚糖的益生元作用[7,9]，美国等已有KOGM食品以及功能食品上市[10]。之前研究表明，KGM和KOGM可以选择性刺激双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌的生长并产生有利的短链脂肪酸(shortchainfattyacids，SCFA)[11-13]。双歧杆菌可促进小肠绒毛上皮细胞增生，分泌乳糖酶，肠道内形成“乳糖酶-低聚半乳糖-双歧杆菌”的微生态循环平衡体系，3者具有相互协同作用，维持肠道内的微生态平衡[14]。因此适量的补充双歧杆菌可以减少乳糖不耐受症的发生。
本文通过人体体外发酵实验，探究KGM和KOGM在健康受试者和乳糖不耐受受试者粪便体外发酵特性，验证其益生性。通过小鼠动物实验，以及KGM和KOGM对乳糖体外发酵特性的影响研究，讨论KGM和KOGM治疗乳糖不耐受症的可行性，为开发一款益生元治疗乳糖不耐受症的新型产品提供理论研究基础和应用参考。
1.1.1实验动物
雄性KM小鼠，购自重庆医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。
1.1.2主要实验材料
KGM，重庆康家客有限公司，符合NY/T494—2010《魔芋粉》标准质量要求，葡甘聚糖含量≥90%；β-甘露聚糖酶(食品级60000U/g)，昆明爱科特生物科技有限公司；乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸(色谱纯)标准品，北京振翔科技有限公司；思连康双歧杆菌四联活菌片，杭州远大生物制药有限公司；二糖酶试剂盒(乳糖酶)，南京建成生物工程研究所；其他试剂如未特别说明均为分析纯。
1.1.3主要仪器和设备
MAGM-Ⅱ微波快速制样系统，上海新仪公司；DZF-6020真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；RE-52旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；172F-602电热鼓风干燥箱，上海精密实验仪器有限公司；PHS-3C精度酸度计，上海大普仪器有限公司；5810台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；GC-2010Plus气相色谱仪，日本岛津公司；FFAP气相色谱柱(30m×0.53mm×0.50μm)，安捷伦科技有限公司；HXF-DY高速分散器，宁波新芝生物科技股份有限公司；SYNERGYH1MG酶标仪，美国基因公司。
1.2.1魔芋葡甘低聚糖的制备
根据秦清娟等[15]的方法并稍作改动。采用微波辅助半干法酶解制备KOGM，称取20g魔芋粉，加入34.0mLpH6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，固液比为1∶1.7(g∶mL)，以1600U/g加入β-甘露聚糖酶，高速搅拌均匀，将样品用可透气玻璃纸密封，于55℃条件下反应3.2h。反应完全之后微波加热，使反应体系中酶的活性丧失(700W加热1min，物料中心温度达到95℃)，产物置于45℃的真空干燥箱中干燥。将干燥样品溶于10倍(g∶mL)的蒸馏水中，充分搅拌后，6000r/min离心20min，收集上清液，经旋转蒸发将上清液浓缩至原体积的1/8～1/12，得到浓缩液，逐步加入9倍体积的无水乙醇，乙醇体积分数达到90%，醇沉1h，8000r/min离心20min，得醇沉物。低温(40℃)烘干，粉碎过筛(160目)，得KOGM样品。得率达到48.4%，样品密封并于4℃低温保存，以备后续使用。
1.2.2KGM和KOGM在不同人群粪便中的体外发酵特征
1.2.2.1体外发酵实验溶液的制备
参照罗凯云[16]的方法制备体外发酵实验溶液，并在121℃高压灭菌20min后加入0.25g/L的L-盐酸半胱氨酸，于厌氧室中过夜待用。实验分为4组：空白组、葡萄糖组、KGM组、KOGM组，即准确称量(100±0.5)mg对应样品于已灭菌的50mL离心管中，加入8mL预还原的体外发酵实验溶液使样品完全水合。
1.2.2.2粪便样本的收集和处理
取健康志愿者和乳糖不耐受症志愿者(每组各2男2女，22～28岁，至少在实验前3个月没有服用抗生素类药物)新鲜粪便，将其分为2组(健康组和乳糖不耐受症组)，分别在组内将志愿者粪便样品等量混合，按质体比1∶5的比例(6倍稀释)向粪便中加入37℃的体外发酵实验溶液，混匀后过滤，收集滤液(2mL)加入到完全水合好的样品管中，氮吹密封，37℃厌氧培养箱中孵育。分别孵育0、3、6、12、24、48h采集发酵液样品。
1.2.2.4SCFA分析
气相混标液的配制：分别取乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸标准品各100μL，置于10mL容量瓶中，用蒸馏水定容，即为10mL/L的标准储备液，试验中需要稀释现配的7个稀释梯度的标准溶液做标准曲线如表1所示。
SCFA的提取和测定[17]：取人粪发酵液或小鼠粪便上清液(见1.2.3)测定其SCFA含量。配制50%酸性乙醇：取25mL无水乙醇和3.29mL38%浓盐酸混合，用50%乙醇定容500mL；0.5mL体外发酵液和0.5mL酸性乙醇混合，旋涡，超声20min(40W)，5000r/min离心20min，过0.45μm滤膜。取1μL上清液经气相色谱仪测定SCFA含量。
1.2.3动物实验
分别将3、5、7、9w龄雄性KM小鼠处死，用二糖酶试剂盒(乳糖酶)经酶标仪测定小鼠小肠乳糖酶活性，以此选择合适的实验小鼠[18]。
动物饲喂在西南大学药学院[SYXK(渝)2014-0002)]标准动物房内开展。温度保持在(25±0.5)℃，相对湿度(50±5)%，12h/12h的灯光/黑暗循环。标准饲料，自由饮水，适应性喂养1w后，小鼠随机分为4组：空白组、药物组、KGM组和KOGM组，分别经口灌胃纯水、思连康双歧杆菌四联活菌片、KGM和KOGM，灌胃剂量均为195mg/kg体重，根据实验室推荐成人每日KGM剂量(2g/60kg)和药物推荐剂量调整确定，每组9只小鼠。
灌胃28d期间，每周1次收集小鼠新鲜的粪便，立即放入厌氧袋，转移至冰块中冷冻。快速测定粪便样品的含水量、pH值[19]。另取1份小鼠粪便，按照1∶5(g∶mL)的比例加入饱和NaCl溶液，10000r/min离心10min，取上清液用于SCFA测定。
1.2.4KGM和KOGM对乳糖体外发酵特性的影响
实验4w后，将空白组小鼠处死，取其结肠内容物按照1∶9的比例加入9倍(mL∶g)生理盐水稀释，制备结肠内容物稀释液。采用MENKE等[20]的方法配制6份基础发酵液进行小鼠结肠内容物体外发酵。样品分组如表2所示，置于37℃、160r/min的摇床中进行酵解培养24h后，测定发酵液pH值、SCFA含量，用二糖酶试剂盒(乳糖酶)测定小鼠小肠乳糖酶活性。
表2发酵样品的分组及名称Table2Groupandnameofsamplesinfermentation
组别样品剂量/(mg·g-1结肠内容物稀释液)空白组纯水200乳糖组乳糖200乳糖-药物组乳糖药物(思连康)200100乳糖-KGM组乳糖KGM200100乳糖-KOGM组乳糖KOGM200100
1.2.5数据分析
实验测定重复3次，结果表示为实验数据的统计学分析采用SPSS23.0软件，数据间的比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)的Duncan′s法进行两两比较，显著性水平设定为0.05。作图采用Originlab2018、AdobePhotoshopCS5软件。
2.1.1人粪发酵液pH值的测定
2.1.2人粪发酵液SCFA含量的测定
由图1可以看出，KGM和KOGM酵解培养物中的乙酸、丙酸和丁酸在0～6h之间浓度显著增加，12h之后趋于稳定。6～24h内，葡萄糖组、KGM组和KOGM组的SCFA产量均显著高于空白组(P<0.05)。由此可知，KGM和KOGM可以促进人体粪便体外发酵培养物中SCFA的产生，这与之前的研究结果一致[5,25]。
a-乙酸;b-丙酸;c-丁酸图1乳糖耐受和不耐受受试者粪便菌群体外发酵中乙酸(a)、丙酸(b)和丁酸(c)的产量Fig.1Contentofaceticacid(a),propionicacid(b)andbutyricacid(c)infecalbacteriaoflactosetolerantandintolerantsubjects
健康受试者和乳糖不耐受症受试者粪便体外发酵过程中，两者的空白组间SCFA含量没有显著性差异(P>0.05)，说明SCFA产量与粪便菌群没有直接的关系；与健康组人群粪便体外发酵结果相比，KGM和KOGM能促进乳糖不耐受症组人群粪便发酵产生更多的乙酸和丁酸。由此可见，魔芋葡甘聚糖及其衍生物对促进乳糖不耐受症人群粪便体外发酵液中SCFA的产生也具有促进作用[9]。
如表4所示，随小鼠年龄增加，小肠乳糖酶活性呈下降趋势，此结果与之前研究结果一致[18]，这也符合人类肠道乳糖酶活性随年龄增长而下降的情况。另有研究表明[26]，小鼠小肠乳糖酶基因与人类同源性较高，说明选用小鼠作为乳糖不耐受症的实验动物是可行的。因此，选用5w龄成年小鼠作为本次动物实验受试对象。
表4各周龄组小鼠小肠乳糖酶活性Table4Intestinelactaseactivitiesofmiceindifferentagegroups
小鼠组别乳糖酶活性/(U·mg-1)3w0.506±0.040a5w0.179±0.016b7w0.121±0.015c9w0.116±0.002c
2.3.1小鼠粪便含水量的测定
小鼠在灌胃期间，药物组、KGM组和KOGM组结肠粪便中的水分含量显著高于空白组(P<0.05)。这表明在整个实验过程，摄入KGM、KOGM能增加小鼠粪便含水量，可以提高排泄物的体积，形成松弛的粪便[19]。这有利于结肠的健康，对控制肠道蠕动，加速有毒物质排除，维持肠道形态具有促进作用[27]。
2.3.2小鼠粪便pH值的测定
结肠pH的降低对人体健康有益，较低的结肠pH能抑制有害病原菌的繁殖并影响结肠微生物酶活性[19]。因此，结肠粪便pH值的改变可作为评估KGM和KOGM对小鼠结肠影响的指标之一。如图3所示，小鼠结肠粪便pH在实验开始时均为弱碱性(pH8.24)。摄入KGM和KOGM28d后，KGM组和KOGM组小鼠结肠粪便的pH值分别从(7.72±0.04)和(7.77±0.02)降低为(6.43±0.04)和(6.33±0.04)(P<0.05)，而空白组小鼠结肠粪便的pH仍保持在(7.98±0.06)，且在灌胃1～4w内没有显著性差异(P>0.05)。结果表明，KGM和KOGM的摄入可以有效降低小鼠结肠粪便pH值，这可能是由于KGM和KOGM在小鼠结肠中的酵解所致。有研究结果表明[5,21]，KGM和KOGM可以通过降低粪便pH和增加粪便中双歧杆菌和乳酸杆菌的比例来改善结肠生态，这些都对促进肠道健康有积极作用。
2.3.3小鼠粪便SCFA含量分析
由图4-a,图4-e可知，KGM对乙酸和戊酸的增加作用显著，尤其是乙酸(P<0.05)，这与CHEN等[7]研究结果一致。KOGM对促进丙酸、异丁酸、异戊酸，尤其是丁酸的作用显著(P<0.05)。因此，KGM和KOGM对SCFA含量会产生影响。
2.4.1小鼠结肠内容物体外发酵液pH值测定
在小鼠结肠内容物体外发酵过程中，微生物利用不同底物发酵的pH值变化如表5所示。
a-乙酸;b-丙酸;c-丁酸;d-异丁酸;e-戊酸;f-异戊酸图4KGM和KOGM对小鼠粪便SCFA含量的影响Fig.4EffectofKGMandKOGMonSCFAsofmicefaeces
表5不同原料酵解培养物中pH的变化Table5ChangesofpHinfermentedculturesaddedwithdifferentmaterialsatdifferenttimeduringfermentation
在发酵6～24h内，乳糖-药物组和乳糖-KGM组的发酵液pH值降低速率最快。发酵24h之后，乳糖-KGM组和乳糖-KOGM组的发酵液pH值显著低于其他组(P<0.05)。综上所述，在乳糖中加入KGM和KOGM加速了发酵液pH值降低的速率，且与其他组相比，pH值更低，这有益于机体的健康。因此，在乳糖中加入KGM和KOGM能为机体提供良好的酸性环境。
2.4.2小鼠结肠内容物体外发酵液SCFA含量分析
小鼠结肠内容物体外发酵24h后，不同底物的发酵产物SCFA含量分析如表6所示，乙酸的产生量最高，是结肠微生物群产生的最丰富的SCFA[11]，其次是丁酸，丙酸含量最低。与乳糖组相比，KGM和KOGM的添加显著提高了发酵液中乙酸和丁酸的产量(P<0.05)，且KOGM的作用更显著，这可能是由于KOGM更易被分解并吸收利用，KGM的分子量影响发酵速度[12]。KGM和KOGM在发酵24h时与其他组的丙酸产量没有差异，这与CHIU等[12]在实验中得到的丙酸含量的结果不同，这可能是由于小鼠的结肠吸收率和/或结肠细菌和代谢能力的差异所致[12]。简言之，在乳糖中添加KGM和KOGM可以促进小鼠结肠内容物发酵液中SCFA的产生，这些都可以说明KGM和KOGM对肠道健康具有积极作用。
表6酵解24h时不同原料酵解培养物中的SCFA浓度(n=3)变化Table6SCFAconcentrationsinfermentationculturesat24husingdifferentmaterials(n=3)
组别SCFA/(mmol·L-1)乙酸丙酸丁酸空白组0.9±0.1d0.3±0.1a0.8±0.1d乳糖组6.2±0.8c0.2±0.1a1.8±0.3c乳糖酶-药物组6.7±1.1c0.2±0.1a2.2±0.2c乳糖-KGM组10.3±1.2b0.2±0.0a2.9±0.3b乳糖-KOGM组18.5±2.7a0.2±0.1a3.7±0.5a
2.4.3小鼠结肠内容物体外发酵液乳糖酶活性测定
乳糖酶是动物体内消化分解乳糖的主要酶源，由图5可知，药物、KGM和KOGM的加入，使小鼠结肠内容物体外发酵液乳糖酶的活性高于其他组，且具有统计学差异(P<0.05)，可见，KGM和KOGM可促进乳糖酶的恢复和增加。实验药物的主要成分是双歧杆菌，KGM和KOGM分解产生双歧杆菌，而双歧杆菌可以产生乳糖酶[14]，故其对乳糖酶活性的增加具有显著作用。这些结果表明，KGM和KOGM可以作为治疗乳糖不耐受症的研究对象。但KGM和KOGM对乳糖在小鼠结肠内容物体外发酵特性的影响涉及其量效关系还未进行研究，值得后续深入探究。
图5酵解24h时不同原料酵解培养物中的乳糖酶活性变化(n=3)Fig.5Lactaseactivityinfermentationculturesat24husingdifferentmaterials
参考文献
[1]谭周进,郭抗萧,曾奥,等.肠道乳糖酶的研究进展[J].世界华人消化杂志,2013,21(28):2897-2901.
[2]缪明永,高云.乳糖不耐症与结肠代谢[J].肿瘤代谢与营养电子杂志,2016,3(4):216-219.
[3]HET,PRIBEMG,ZHONGY,etal.Effectsofyogurtandbifidobacteriasupplementationonthecolonicmicrobiotainlactose-intolerantsubjects[J].JournalofAppliedMicrobiology,2008,104(2):595-604.
[4]SAVAIANODA,RITTERAJ,KLAENHAMMERTR,etal.Improvinglactosedigestionandsymptomsoflactoseintolerancewithanovelgalacto-oligosaccharide(RP-G28):arandomized,double-blindclinicaltrial[J].NutritionJournal,2013,12:160.
[5]HET,PRIEBEMG,HARMSENHJM,etal.Colonicfermentationmayplayaroleinlactoseintoleranceinhumans[J].TheJournalofNutrition,2006,136(1):58-63.
[6]VONKRJ,PREBEMG,KOETSEHA,etal.Lactoseintolerance:analysisofunderlyingfactors[J].EurJClinInvest,2003,33(1):70-75.
[7]CHENHL，CHENGHC，LIUYJ，etal.Konjacactsasanaturallaxativebyincreasingstoolbulkandimprovingcolonicecologyinhealthyadults[J].Nutrition,2006,22(11-12):1112-1119.
[8]王敏,帅天罡,秦清娟,等.魔芋葡甘低聚糖对大鼠肠道环境的影响[J].食品科学,2016,524(7):221-227.
[9]ZENGY,ZHANGJ,ZHANGY,etal.Prebiotic,immunomodulating,andantifatigueeffectsofkonjacoligosaccharide[J].JournalofFoodScience,2018,83(12):3110-3117.
[10]王文娟,贺青华,魏芬芬,等.魔芋低聚糖对小鼠肠道菌群的调节作用[J].中国酿造,2017,36(10):135-138.
[11]CONNOLLYML,LOVEGROVEJA,TUOHYKM.Konjacglucomannanhydrolysatebeneficiallymodulatesbacterialcompositionandactivitywithinthefaecalmicrobiota[J].JournalofFunctionalFoods,2010,2(3):219-224.
[12]CHIUYT,STEWARTM.Comparisonofkonjacglucomannandigestibilityandfermentabilitywithotherdietaryfibers,inVitro[J].JournalofMedicinalFood,2012,15(2):120-125.
[13]HARMAYANIE,APRILIAV,MARSONOY.CharacterizationofglucomannanfromAmorphophallusoncophyllusanditsprebioticactivityinvivo[J].CarbohydratePolymers,2014,112:475-479.
[14]焦强,刘智勇,郭毅.乳糖酶制剂的研究进展[J].河南预防医学杂志,2019(4):275-278.
[15]秦清娟,邓利,徐小青,等.魔芋葡甘聚糖及其衍生物肠道益生性的体外发酵评价[J].食品科学,2015,34(15):243-246.
[16]罗凯云.膳食纤维-淀粉拟谷粒结构体的构建及其对肥胖抑制和血糖平衡作用机制的研究[D].无锡:江南大学,2019.
[17]张琪,孙瑞,贾晓倩,等.体外模拟发酵探究KGM和KOS与不同胃肠段微环境的影响[J].食品与发酵工业,2020,46(6):25-32.
[18]何伟,吕斌,黄承钰.不同年龄BALB/c小鼠乳糖酶及基因调控水平研究[J].四川大学学报(医学版),2005(4):71-73.
[19]胡婕伦.大粒车前子多糖体内外消化与酵解特征体系构建及其促进肠道健康的作用[D].南昌:南昌大学,2014.
[20]MENKEKH,STEINGASSH.Estimationoftheenergeticfeedvalueobtainedfromchemicalanalysisandinvitrogasproductionusingrumenfluid[J].AnimalResearchandDevelopment,1988,28(7):55-55.
[21]秦清娟,徐小青,张媛,等.魔芋葡甘低聚糖毒理学及肠道益生性评价[J].食品科学,2014,35(21):244-248.
[22]吕娇,苏昕峰,方国珊,等.果胶改善辣椒素对肠道发酵环境的影响[J].食品科学,2013,34(17):273-277.
[23]HAMERHM,JONKERSD,VENEMAK,etal.Reviewarticle:Theroleofbutyrateoncolonicfunction[J].AlimentaryPharmacology&Therapeutics,2008,27(2):104-119.
[24]SCOTTKP,MARTINJC,DUNCANSH,etal.Prebioticstimulationofhumancolonicbutyrate-producingbacteriaandbifidobacteria,invitro[J].FEMSMicrobiologyEcology,2014,87(1):30-40.
[25]ARIESTANTICA,SEECHAMNANTURAKITV，HARMAYANIE,etal.Optimizationonproductionofkonjacoligo-glucomannanandtheireffectonthegutmicrobiota[J].FoodScience&Nutrition,2019,72(2):788-796.
[26]何伟.长期多代饮奶对鼠小肠乳糖酶活性及mRNA水平的影响研究[D].成都:四川大学,2004.
[27]包辰.薏苡仁抗性淀粉结构特性及其对肠道菌群调节机制的研究[D].福州:福建农林大学2017.
[28]卢旭.莲子低聚糖制备及其对肠道益生菌和病原菌调节机制的研究[D].福州:福建农林大学,2015.
ZHANGDongxia1,ZHANGQi1,DENGLiling1,2，ZHONGGeng1*
1(CollegeofFoodScience，SouthwestUniversity，Chongqing400715,China)2(ChongqingInstituteofBiotechnologyCo.Ltd.,Chongqing401121,China)
Keywordskonjacglucomannan;konjacoligo-glucomannan;prebioticeffect;lactoseintolerance;invitrofermentability
第一作者：硕士研究生(钟耕教授为通讯作者，E-mail：zhongdg@126.com)
基金项目：重庆市自然科学基金项目(cstc2018jcyjAX0527)；重庆市教委科研基金(XDJK2020D031)
收稿日期：2020-02-18，改回日期：2020-03-08
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023678
引用格式:张东霞，张琪，邓丽玲，等.魔芋葡甘聚糖及其衍生物治疗乳糖不耐受症[J].食品与发酵工业,2020,46(11):112-118.ZHANGDongxia,ZHANGQi,DENGLiling,etal.Konjacglucomannananditsderivativesintreatinglactoseintolerance[J].FoodandFermentationIndustries,2020,46(11):112-118.