目前已报道的有机磷降解菌中只含有一种有机磷降解酶基因，而本研究从一株有机磷农药降解菌施氏假单胞菌PseudomonasstutzeriYC-YH1中同时克隆到两种有机磷降解酶基因mpd和ophc2。将两种基因分别连接到表达载体并转化大肠杆菌进行表达，研究了这两种降解酶各自的酶学特性及二者联合的酶学特性。
甲基对硫磷（Methylparathion，纯度>99%）购自上海市农药研究所。对硝基苯酚（p-Nitrophenol）（分析纯）购自天津市凯通化学试剂有限公司。4×SDS凝胶上样缓冲液低分子量标准蛋白、限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、IPTG、DNA片段纯化试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）。氨苄青霉素购自Amresco公司。细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，去离子水1L，121℃灭菌20min。上样缓冲液：Na2HPO4·12H2O1.78g，NaH2PO4·2H2O1.38g，NaCl29.22g，Imidazole2.0g，去离子水至1L，pH7.4。洗脱缓冲液：Na2HPO4·12H2O1.78g，NaH2PO4·2H2O1.38g，NaCl29.22g，Imidazole34.0g，去离子水至1L，pH7.4。
本研究所用菌株为本实验室分离的有机磷降解菌施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）YC-YH1，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCCNo.9624。E.coliBL21（DE3）购自天根生化科技有限公司。质粒pET-32a购自Novagen公司。
AKTAavant蛋白纯化系统配Ni柱（HisTrapTMFFcrude1mL），Tecaninfinite200酶标仪，Bio-Rad（PowerPacTMHVPowerSupply）蛋白质电泳仪，BRANSON超声波仪器（DIGITALSONIFIER250）。
根据施氏假单胞菌PseudomonasstutzeriYC-YH1全基因组测序结果，用PrimerPremier5.0设计引物（表1），引物P1和P2PCR扩增mpd基因，引物P3和P4PCR扩增ophc2基因。以YC-YH1菌株基因组DNA为模板，扩增目的基因。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min20s，进行30个循环；72℃延伸10min；10℃保存。扩增产物用DNA片段纯化试剂盒纯化。
将纯化后的mpd和ophc2用BamHⅠ和SacⅠ酶切，同时酶切载体pET-32a，用DNA片段纯化试剂盒回收，用T4DNA连接酶将酶切后mpd和ophc2分别与pET-32a质粒于16℃过夜连接，将连接产物转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞，在含有100mg/L氨苄青霉素的抗性平板上筛选阳性克隆，提取质粒进行验证。
将已验证正确的E.coliBL21（pET-mpd）和E.coliBL21（pET-ophc2）分别取300μL接种到30mL液体LB培养基中，37℃下振荡培养12h。将培养后的菌液取4mL接种到400mL液体LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养至菌液OD600达到0.8，加入IPTG至终浓度1mmo/L，在30℃，200r/min下振荡培养，诱导3h。然后5000r/min离心8min收集菌体，用30mL上样缓冲液悬浮菌体后进行超声破碎。超声功率为20%，超声频率：超声3s，暂停5s，共超声破碎20min。破碎完成后12000r/min离心10min，收集上清液进行纯化。
用AKTAavant蛋白纯化系统对蛋白进行纯化，流速1mL/min，上样26mL，用洗脱缓冲液进行洗脱，从第4mL开始收集，收集2mL蛋白洗脱液。
使用SDS-PAGE对纯化的蛋白进行纯度测定。配制浓度为12%的分离胶，浓度为5%的浓缩胶，固定染色液为考马斯亮蓝R-250（含异丙醇25%，乙酸10%），脱色液含乙酸10%和乙醇5%。未诱导及诱导后的全细胞蛋白处理方法：lmL菌体细胞沉淀加入20μL4×SDS凝胶上样缓冲液及60μLH2O，100℃加热10min以充分裂解细胞，12000r/min离心10min使细胞碎片及DNA等沉淀，取适量溶液上样。纯化的MPH和OPHC2分别取60μL加入20μL4×SDS凝胶上样缓冲液混匀，取适量溶液上样。
取1μL甲醇配制的浓度为1×104mg/L的甲基对硫磷母液，1μL酶液，加入到98μLTris-HCl（50mmol/L，pH9.0）中混匀，28℃反应2min，然后用酶标仪检测溶液在405nm下的吸光度值。
有机磷降解酶的一个活性单位（U）定义为：在28℃条件下，每分钟降解1μmol甲基对硫磷所需酶量。在甲基对硫磷的降解过程中，甲基对硫磷的消耗量与其降解产物对硝基苯酚的生成量之间为11的关系，所以本研究通过检测产生的对硝基苯酚的量而得到甲基对硫磷被降解的量。
分别以纯化的MPH、OPHC2以及二者按11比例混合的混合酶为材料，在不同温度、pH及不同金属离子下检测酶对甲基对硫磷的降解效率，测定了其最适反应温度、最适pH及金属离子对酶活性的影响。
取4μL甲醇配制的浓度为1×104mg/L的甲基对硫磷母液，1μL酶液，加入到995μLTris-HCl（50mmol/L，pH9.0）中混匀，在不同温度（20、30、40、50、60、70和80℃）下保温30min，检测溶液在405nm下的吸光度值；在不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10、11和12）下进行酶促反应，测定了其最适pH，取0.5μL酶液，1μL甲醇配制的浓度为1×104mg/L的甲基对硫磷母液，加入到98.5μLTris-HCl（50mmol/L，pH9.0）中混匀，28℃反应30min后检测405nm下的吸光度值；在酶促反应体系中分别加入不同金属离子及化学试剂，各种化合物的终浓度为1mmol/L，28℃下反应30min后检测405nm下的吸光度值，以研究不同金属离子及化学试剂对酶反应的影响。
将不同浓度的甲基对硫磷（25、50、100、200和400mg/L）作为底物，加入到50mmol/LTris-HCl（pH9.0）缓冲液体系中，在28℃下测酶反应速度，按双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）求Km和Vm。
对几种常见的有机磷农药降解酶基因基因进行分析，用MEGA5.2构建系统进化树；用Swiss-PdbViewer4.1.0对MPH和OPHC2蛋白结构进行分析。
以PseudomonasstutzeriYC-YH1的基因组DNA为模板，扩增获得两个目的基因，其大小与基因组测序基因大小一致（图1-A）。将扩增获得的mpd和ophc2基因片段纯化后，用BamHⅠ和SacⅠ双酶切，与载体pET-32a连接并转化E.coliBL21（DE3），在含有100mg/L氨苄青霉素抗性平板上筛选转化子，提取质粒酶切验证，并分别以pET-mpd和pET-ophc2为模板进行PCR验证，与预测结果相符（图1-B、图1-C）。
将未进行诱导的全细胞蛋白、诱导后的全细胞蛋白及纯化后的MPH和OPHC2蛋白同时进行SDS-PAGE电泳，结果证明纯化后的酶为单一条带（图2）。对纯化的酶进行蛋白定量，得到MPH浓度为1.012mg/mL，OPHC2浓度为1.0289mg/mL。
温度对酶活力有重要影响，太高的温度会使得蛋白变性，从而使酶失活，太低的温度又会降低酶的活性，因此只有在最适温度下纯化酶才能发挥出最高活性。MPH酶在不同温度下具有不同的活性，MPH对甲基对硫磷的最适反应温度为40℃左右。温度低于40℃时，酶的活性随着温度的升高而逐步上升，但超过40℃酶活力迅速下降，到80℃时酶已经失活。结果表明此酶在室温下有较高的活性，但耐热能力较差，高温时降解能力明显较弱。OPHC2酶的最适反应温度为30℃左右。在20-30℃的温度范围内，酶的活力没有明显的变化，超过30℃以后，酶的活力开始下降，当超过40℃后，酶活力会急剧下降，在50℃时只有室温时的60%。混合酶的最适温度也在30℃左右，混合酶在室温时有较高的酶活，温度上升到50℃时，酶活力下降到60%，这与单一纯化酶相类似（图3）。
pH值能够对蛋白质的空间构象产生显著影响，过低或过高的pH值均能够降低酶的活性甚至使酶失活，不利于降解酶活性的发挥。降解酶通常只能在特定的pH值范围内具有活性。不同pH下酶活性测定结果表明，两种酶都是在碱性环境中酶的活性较高，同时都有很宽的pH酶解范围。MPH的最适反应pH为9，在pH8-12的范围内酶的相对活力均在70%以上，pH为7时酶活力只有40%左右。OPHC2酶的最适pH为10，在pH3-10范围内，随着pH值的增加，酶活一直呈增长状态，在pH为10时到达最高值。在pH8-12的范围内，OPHC2的酶活均在70%以上，而当pH为7时，酶活只有50%左右。混合酶活力较高的pH范围仍是8-12，pH8-10范围内酶活力在90%以上，pH为7时酶活力下降到50%（图4）。
以甲基对硫磷为底物，分别测定MPH、OPHC2及混合酶的动力学参数，利用双倒数作图法，求取Km和Vm值，结果见表2。
不同的金属离子和有机试剂会对酶组分产生不同的影响，从而促进或抑制酶的作用。由表3可以看出，有机试剂SDS和EDTA对酶活的影响最大，是MPH和OPHC2的强变性剂。SDS是一种表面活性剂，它是两亲性分子，会使蛋白质变性，所以加入后酶会失活；EDTA是一种络合剂，可与金属离子形成络合物，MPH和OPHC2均金属酶，加入EDTA会与酶活性中心的金属离子螯合，从而降低了酶的活性。不同的金属离子会对酶的活性产生不同的影响。Co2+对MPH的活性有一定促进作用，但同时会对OPHC2的活性产生抑制作用。其他各种金属离子对MPH和OPHC2均表现出抑制作用，其中Zn2+的抑制作用最强。已有文献报道，MPH活性中心的金属离子为Zn2+，晶体状态时每个活性中心的一个Zn2+可被Cd2+取代。OPHC2的活性中心有Zn2+还可能有Co2+或者Fe2+。加入Zn2+可能使得Zn2+过量从而对酶的活性产生强烈抑制。混合酶活性相对稳定，受各种金属离子的影响较小，能够降低添加的金属离子对酶活力的抑制作用。
对常见的几种有机磷农药降解酶基因进行比较分析，用MEGA5.2构建系统进化树（图5）。可见mpd和ophc2相似性较高，亲缘关系较近。
MPH与OPHC2都属于β-内酰胺酶，属于典型的β/α（TIM）折叠桶结构，活性位点均有两个金属离子，其催化机制也类似。MPH的晶体结构为同源二聚体，包含A，B两条链；OPHC2的晶体结构有A、B、C、D和E5条链，其中包括两个二聚体和一个单体（图6）。MPH每个单体中含有45个氢键和8个盐桥。OPHC2单体的N端与另一单体相互作用，单体间相互作用强烈，有29个氢键和15个盐桥，涉及61个氨基酸残基。同时OPHC2的每个单体还有一个二硫键（Cys110-Cys146），可能使OPHC2有更好的热稳定性。
MPH每个单体通过Asp151、His152、His302、His147、His149、His234和Asp255与两个金属离子相连，一个H2O分子桥与两个金属离子相连，还有一个H2O分子只与一个金属离子配位。OPHC2单体中的两个金属离子α和β，His294、His144、Asp143、Asp247与α金属离子作用，His226、His139、His141还有一个H2O分子与β离子作用。用Swiss-PdbViewer4.1.0对MPH和OPHC2的单体进行分析（图7），其三维结构相似性很高，与之前的报道一致。由图7中可以看到，MPH的Gln173-Phe178，Gln182-Asp186，Phe196-Ala210形成3个α螺旋，Lys214-Phe216形成β折叠，此段区域在OPHC2中不存在，可能会对酶的性质有一定影响。
株有机磷降解菌施氏假单胞菌PseudomonasstetzeriYC-YH1中产生的两种降解酶MPH和OPHC2性质相似，共同作用时混合酶比单一的降解酶具有更好的温度和pH适应性，对金属离子和有机试剂的抑制作用也具有较强的抗性，同时最高反应速率也显著增大。