取5g表面灭菌后的种子于无菌研钵中研磨成粉末,然后将粉末加入装有玻璃珠的50mL无菌水中,30℃振荡30min摇匀,即为10–1稀释液,吸取1mL10–1稀释液到9mL无菌水中,吹吸均匀,即为10–2稀释液,用无菌水稀释成10–3、10–4稀释液。然后依次从10–4、10–3、10–2、10–1稀释液中吸取100μL稀释液涂布到TSA培养基上,每个稀释度3个重复。30℃下培养3–5d。挑取不同形态的菌落平板划线并进一步纯化,并用终浓度为25%的甘油保藏菌株,于–80℃冰箱中放置。
微生物通过产生有机酸类等物质溶解土壤中植物不易吸收的无机磷化合物,促使土壤中无效磷的溶解及利用。实验方法主要参照上述标注文献中,将活化的目的菌株点接到无机溶磷培养基上,30℃培养1周左右,测量菌落直径d1,溶磷圈直径d2,将溶磷圈直径d2与菌落直径d1的比值作为评价溶磷能力的标准,比值越大即表明菌株溶磷能力越强。
色氨酸是植物生长素IAA(吲哚乙酸)的合成前体,在培养基中加入色氨酸可诱导微生物合成IAA。采用Salkowski比色法测定内生细菌分泌植物生长激素(IAA)。
依据Machuca和Milagres描述的方法进行检测目的菌株是否具备产生铁载体的能力。
将活化好的细菌点接到TSA平板上,一个平板点接4个接菌点,并在4个接菌点的中央点接病原真菌F.moniliforme,30℃培养1周并观察结果。如果对病原真菌有拮抗作用,病原真菌就不能覆盖细菌生长,即能够形成明显的抑菌圈。
在每个新鲜的血平板上划线接种4个菌,30℃培养48h后观察。溶血分为α溶血(不完全性溶血,产生草绿色溶血环)、β溶血(完全性溶血,呈界限分明、无色透明的溶血环)以及不溶血。
根据进化树及比对结果发现,有57株菌属于P.dispersa,分布在所有分离到泛菌菌株的8个水稻种子样品中,同时该种是本研究中数量最多、分布最广的一类。除Z4-1所代表的两株菌与模式菌P.dispersaLMG2603T相似性为99.78%外,其他相似性均为100%。值得指出的是,Z4-1与P.dispersaLMG2603T16SrRNA基因相似性最高,仅2个碱基的差异,而与P.cypripedii有6个碱基的差异,但是在系统进化树上却与P.cypripedii聚为一类,因而其确切分离地位还需通过多相分类方法进一步确定。
属于P.agglomerans的菌株一共有22株,各个菌株间的16SrRNA基因相似性均为100%,与P.agglomerans模式菌株DSM3493T的相似性均为99.56%,分布在5、6、19、22号种子中。
P.brenneri主要分布在19号和22号样品中,共24株菌株属于该种,其中17株分离自19号样品,菌种间16SrRNA基因相似性为100%,与P.brenneri模式菌株LMG5343T相似性为99.71%;22号样品中,分离到的7株该类群的菌株,但菌株间系统发育存在明显的分化,其中Z22-2所代表的4株菌间相似性为100%,与模式菌LMG5343T相似性为99.72%;而Z22-27、Z22-24与模式菌株LMG5343T相似性分别为99.85%和99.41%,二者各自单独成一个分支。
隶属于P.cypripedii的42株菌均来自于4号样品,且菌株间相似性为100%,与模式菌ATCC29267T的相似性为99.69%。
此外,Z19-21与P.dispersaLMG260T及P.cypripediiATCC29267T相似性分别是99.25%和99.26%,单独形成一个分支,具体是否属于新的类群还需要通过多相分类进行确定。
溶解无机磷的菌株通过分泌一些酸性物质,并向周围的培养基中扩散,使菌落周围的磷酸盐溶解,通过溶磷圈的直径d2和菌落的直径d1的比值确定溶磷能力大小,比值越大即溶磷能力越强,溶磷能力d2/d1值在1.0–2.0属于溶磷能力中等菌株。通过培养1周后发现,共55株菌具有溶磷能力,占总筛选菌株的83.3%。另外,有43菌株d2/d1在1.0–2.0,属于中等溶磷能力菌株;d2/d1≥2.0的菌株共计有11株,属于强溶磷能力的菌株,这些菌分别属于P.dispersa、P.agglomerans、P.cypripedii以及P.brenneri,即所分离到4个种中均有较高溶磷能力的菌株。在P.brenneri中,溶磷能力最高的菌株为Z19-38,其d2/d1为3.15;P.dispersa中,菌株Z19-90的溶磷能力较高,d2/d1为2.85;P.agglomerans中,能力较高的菌株为Z6-7,d2/d1为2.39;P.cypripedii中Z4-11菌株的溶磷能力较高,比值为2.00。
加入Salkowski比色液后,溶液颜色变为粉红色即为具有分泌IAA能力的菌株,颜色越深即分泌IAA能力越强,经过初筛发现46株菌具有IAA产生能力。在定性检测基础上,通过比色法进行定量检测,发现菌株分泌IAA浓度为29.74–431.11mg/L。其中,P.agglomeransZ6-7分泌IAA能力最强,IAA的含量为431.11mg/L;P.cypripediiZ4-12、P.brenneriZ19-80及P.DispersaZ19-33均具有较强的分泌IAA能力,分别为428.65、388.42和391.32mg/L。
铁载体检测通常采用定性初筛及A/Ar比值的相对定量实验,认为A/Ar为0–0.6时产铁载体能力较强,0.6–0.8中等,0.8–1.0为较弱。经过定量和定性检测结果发现,水稻种子内生菌具有产铁载体功能的菌株数量并不多,仅有7株菌具有产铁载体的功能。其中A/Ar是0.6–0.8的菌株分别为P.brenneriZ19-39、P.cypripediiZ4-10、P.dispersaZ2-7、P.brenneriZ19-76以及P.brenneriZ19-37,表明这些菌株产铁载体能力属于中等水平,其中P.brenneriZ19-39相比于其他种来说产铁载体能力更强,即比值为0.62;P.cypripediiZ4-23和P.cypripediiZ4-11的A/Ar分别为0.82和0.86,具有产铁载体能力,但是活性相对较弱;此外,本研究中未发现产铁载体能力较强的菌株。
对所有菌株进行拮抗病原菌F.moniliforme的实验,并未发现抗菌活性的菌株。
对66株菌进行溶血实验,结果发现有3株菌呈现阳性,分别为P.dispersaZ19-19、P.dispersaZ19-35和P.agglomeransZ19-77,可以初步说明这3株具有人畜致病的风险。除溶血性之外,菌株对植物的致病风险尚需我们进行进一步深入的评价。
Walterson和Stavrinides对Pantoea这一类群进行了十分详细的综述性报道,Pantoea的分布极其广泛,功能具有多样性:分离自水体和土壤中的Pantoea可以修复和降解农药残留和其他有毒物质;Pantoea作为多种植内生菌具有固氮和促生功能,有些对植物病原菌具有生防作用;近年来从病人的血液尿液中分离到很多Pantoea菌株,但是其对人的致病性还存在很大的争议。已有的研究中对种子中Pantoea的组成及功能研究十分有限。
P.brenneri已有报道均分离自临床材料如伤口、痰液中等,但未发现对人或者其他动植物的致病性。本研究从两个品种的水稻种子中分离到24株该类群的菌种,且发现大部分菌株具有溶磷功能,其中菌株Z19-38能力最强。同时还发现该类菌具有产IAA和铁载体的功能,并没有发现溶血现象。