李闯,彭志清,李寅琛,吴升山,2,3,林鹿,2,3,曾宪海,2,3
(1.厦门大学能源学院，福建厦门361102；2.福建省生物质清洁高值化技术工程研究中心，福建厦门361102；3.厦门市生物质清洁高值化利用重点实验室，福建厦门361102)
酿酒酵母是一种典型的模式微生物，在生命科学研究中发挥着重要作用.因具备生长迅速、基因操作简单、同源重组能力强等特点[1-2]，酿酒酵母成为真核基因表达中最常见的宿主系统.随着基因编辑技术的高速发展，酿酒酵母在大规模DNA片段组装等合成生物学领域已有广泛的应用[3-4].
在酵母底盘中进行基因操作，为确保其准确性，需对DNA片段引入或删除进行鉴定，常规步骤包括单菌落扩大培养、收集并裂解细胞、提取高纯度DNA模板及PCR检测[5]，在进行大规模筛选工作时，该方法往往成本高且效率低；相反，菌落PCR检测方式无需预先分离或纯化DNA，而是以菌体为模板来完成靶标序列的扩增[6]，可以有效避免上述弊端.然而与传统原核微生物不同，酿酒酵母细胞壁由复杂多糖和少量蛋白质组成，具有较强韧性.特殊的细胞壁结构使其难以被简单的高温程序破坏，因此将酿酒酵母直接作为模板进行PCR检测的成功率较低[7]，需使用预处理方式破坏细胞壁，再进行菌落PCR以增强检测效率.目前已有文献报道了酿酒酵母的多种预处理方式，如通过消解酶水解细胞壁，使用氢氧化钠、醋酸锂、十二烷基硫酸钠、曲拉通X-100处理酵母，均有效提高了检出率[8-12]，但酶制剂成本较高，酶解缓冲液以及化学试剂中金属离子的引入会干扰PCR检测的稳定性[13]，极大制约了菌落PCR在酿酒酵母中的应用.
本研究通过对比不同预处理方法，探索出一种高效酵母菌落PCR检测方法.该方法无需辅助物质的添加，使用微波结合冻融的方式处理酵母菌液，以其为模板进行PCR检测，成本低、效率高、稳定性好，不仅适用于不同基因操作模式下阳性克隆的筛选，还可用于3000bp以上长链DNA片段的检测；此外，该方法可应用于树干毕赤酵母和巴斯德毕赤酵母阳性克隆的筛选.
1.1.1菌株大肠杆菌DH5α、野生型二倍体酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YD202、单倍体酿酒酵母BY4741、巴斯德毕赤酵母(Komagataellaphaffii)GS115均由厦门大学生物质燃料与化学品团队保藏；树干毕赤酵母(Scheffersomycesstipitis)CGMCC2.3250购自中国普通微生物菌种保藏管理中心.
1.1.2培养基Luria-Bertani(LB)培养基：10g·L-1胰蛋白胨、5g·L-1酵母抽提物、10g·L-1氯化钠；YeastExtractPeptoneDextrose(YEPD/YPD)培养基：20g·L-1胰蛋白胨、10g·L-1酵母抽提物、20g·L-1葡萄糖.
分别向以上体系中添加终浓度为20g·L-1的琼脂，配制成相应的固体培养基.在制备抗性平板时，向灭菌后的LB固体培养基中加入终浓度为100μg·mL-1的氨苄青霉素，向YPD固体培养基中加入终浓度为200μg·mL-1的潮霉素B或G418.
1.1.3质粒与DNA片段酿酒酵母木糖异构酶(XI)表达质粒pRS41H-xylA、表面展示型XI表达质粒pRS41H-xylA-sag1，巴斯德毕赤酵母特异蛋白表达质粒pPIC9K-catcher、pPIC9K-xynA均由无缝克隆技术构建.酿酒酵母非特异性醛糖还原酶敲除盒gre3_U-hpt-gre3_D、δ位点整合片段δ1-xylA-KanMX-δ2，树干毕赤酵母己糖激酶敲除盒nag5_U-hpt_m-nag5_D均通过重叠延伸PCR方式构建.其中，hpt为潮霉素B抗性基因，而树干毕赤酵母属于CUG分支酵母，将常规亮氨酸密码子CUG翻译为丝氨酸[14]，故选用经过突变后的潮霉素B抗性基因hpt_m作为筛选标记[15].
1.1.4引物根据待测片段的特性共设计7组引物，均由上海生工生物工程公司合成，引物序列详见表1.
表1菌落PCR检测所使用的引物
1.1.5主要试剂与设备2×RapidTaqMasterMix、2×PhantaFlashMasterMix、DL5000DNAMarker、OneStepCloningKit购自南京诺唯赞公司；抗生素G418、潮霉素B购自上海生工生物工程公司；PEG3350购自上海新铂化学技术公司；LiAc购自上海麦克林生化科技公司.其他化学试剂均为国产分析纯.
基因扩增仪、电泳仪、化学发光凝胶成像系统、电穿孔系统购自美国BIO-RAD公司；微型高速离心机购自德国Eppendorf公司；荧光倒置显微镜购自德国Leica公司；700W微波炉购自广东美的公司.
1.2.1质粒及DNA片段的转化酿酒酵母醋酸锂/聚乙二醇转化参照Gietz[16]的方法进行，并适当优化.完成感受态酵母细胞的制备和转化体系的配制后，于30℃温浴30min，42℃热激25min，在500μLYPD培养基中复苏2h，吸取100μL培养液涂布选择性平板，培养2～3d后，挑选单菌落检测阳性克隆.
毕赤酵母使用电转化法进行DNA的转化[17].转化时使用0.2cm电转化杯，电穿孔系统设置电压2000V、电容25μF、电阻200Ω，转化完成后在选择性平板上涂布相应菌液.
1.2.2酵母质粒及基因组DNA的获取在抗性平板上挑选单菌落，接种至20mLYPD培养基上，培养至对数生长后期(D600nm=8～10)时，收集菌体.分别使用北京天根生化公司的酵母质粒提取试剂盒和基因组DNA提取试剂盒进行酵母质粒及基因组DNA的提取.
1.2.3预处理酵母制备PCR模板的方法直接法：使用无菌牙签从筛选平板上挑取少量菌体直接用于PCR检测.
水浴法：挑取单菌落接种至20mL抗性YPD培养基中，过夜培养(D600nm=4～5)，取1.5mL菌液，于12000r·min-1离心15s，弃上清，用200μLddH2O重悬菌体，于12000r·min-1再次离心15s，弃上清，用200μLTE缓冲液重悬菌体，沸水浴10min，于12000r·min-1离心5min，取1μL上清作为PCR模板.
水浴冻融法：使用与水浴法同样的方式收集菌体，沸水浴10min，于-80℃冷冻处理10min，完成后再次沸水浴10min，于12000r·min-1离心5min，取1μL上清作为PCR模板.
微波法[18]：使用无菌牙签挑取菌体至PCR管壁，用700W微波炉全功率处理5min，于-20℃快速冷却至室温后作为PCR模板.
微波冻融法：取单菌落接种至含2mL抗性YPD培养基的5mL无菌离心管中，过夜培养(D600nm=1.5～2.0)，取10μL菌液至PCR管中，用700W微波炉全功率处理5min，于-80℃冷冻10min，快速解冻，再次用微波炉全功率处理2min，取1μL菌液作为PCR模板.
1.2.4PCR检测按照试剂使用说明配制20μL反应体系进行PCR检测.以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.
为了比较不同预处理方式对酵母形貌的影响，以野生型酿酒酵母为研究对象，按照“1.2.3”中的方法处理菌体.显微镜下观察的结果(图1)显示：未经处理的酵母轮廓清晰，并展现出芽特性；水浴法处理后，部分酵母细胞体积膨胀，有少数胞体破裂；酵母经过水浴冻融和微波冻融处理后的效果相似，部分细胞内容物溢出且细胞质壁分离明显；与水浴法、水浴冻融法、微波冻融法不同，微波法处理后酵母整体呈降解趋势，大量细胞以碎片形式存在.表明以上4种处理方式均可在不同程度上破坏酵母细胞，与其他3种方法相比微波法的破胞效率最高.
a：原始酵母细胞；b：水浴处理；c：水浴冻融处理；d：微波处理；e：微波冻融处理.
通过醋酸锂转化法将木糖异构酶游离表达质粒pRS41H-xylA转化至野生型酿酒酵母中，使用潮霉素B抗性平板进行克隆子的筛选，结果见图2a.随机挑选5个单菌落经过5种预处理方式制备模板进行菌落PCR检测，其琼脂糖凝胶电泳图谱如图3所示.当以试剂盒提取质粒为PCR模板时(图3a)，电泳条带与XI开放阅读框长度1320bp保持一致，表明重组质粒均已成功转化.然而，直接以菌体为模板(图3b)或采用水浴法(图3c)和微波法(图3e)制备模板，电泳图谱显示无条带或微弱目标条带，难以实现检测目的.采用水浴冻融法(图3d)和微波冻融法(图3f)处理菌体后进行PCR检测，电泳图谱均显示出与质粒PCR检测结果相吻合的目标条带，但微波冻融法表现出更高的稳定性.
a：酿酒酵母pRS41H-xylA；b：酿酒酵母Δgre3∷hpt.
a：质粒模板；b：直接模板；c：水浴模板；d：水浴冻融模板；e：微波模板；f：微波冻融模板(M：DL5000Marker；1～5：单菌落).
向酿酒酵母中导入DNA片段gre3_U-hpt-gre3_D后，通过同源重组的方式敲除非特异性醛糖还原酶基因gre3，抗性筛选结果见图2b.挑选5个单菌落，使用不同预处理方式制备的模板进行PCR检测，结果如图4所示.以提取的基因组DNA为模板时(图4a)，电泳图谱显示于2100bp处存在明显条带，其中，泳道3、4更为明亮.测序结果显示，以上两条DNA片段即为扩增所得的gre3基因敲除盒.采用直接法(图4b)和微波法(图4e)制备的模板均无法完全扩增出目标条带，检测结果显示假阴性率高.相比水浴法和水浴冻融法，采用微波冻融法(图4f)制备的模板进行菌落PCR检测的稳定性更好.此外，菌落PCR仍能检测出800bp左右的待敲除片段，表明在多个单菌落中，基因敲除盒部分整合至二倍体酵母染色体中，敲除基因同源位点仍存在完整的gre3基因.
a：基因组模板；b：直接模板；c：水浴模板；d：水浴冻融模板；e：微波模板；f：微波冻融模板(M：DL5000Marker；1～5：单菌落).
使用醋酸锂/聚乙二醇转化法分别向野生型酿酒酵母和BY4741中导入δ位点整合片段δ1-xylA-KanMX-δ2和表面展示型XI表达质粒pRS41H-xylA-sag1，分别使用G418和潮霉素B平板进行筛选.在选择性平板上随机挑选单菌落，使用微波冻融法制备的模板进行PCR检测.电泳图谱(图5)显示，基因组模板和微波冻融模板在4000bp左右处有明显条带，与插入δ位点的特征序列长度相同.图6b显示，泳道1、2、3、4、6在3000～5000bp处有单一条带，与质粒PCR检测结果(图6a)一致.以上两种检测结果表明，使用微波冻融法制备的模板进行菌落PCR可用于酿酒酵母长链DNA片段的检测.
a：基因组模板；b：微波冻融模板(M：DL5000Marker；1～5：单菌落).
a：质粒模板；b：微波冻融模板(M：DL5000Marker；1～6：单菌落).
使用电转化法向树干毕赤酵母中导入己糖激酶敲除盒nag5_U-hpt_m-nag5_D，在获取转化子后采用微波冻融法制备模板，使用nag5上下游引物对基因敲除情况进行PCR检测.结果(图7)显示，以树干毕赤酵母原始基因组DNA作为对照可以扩增出2233bp的待敲除片段，而对于树干毕赤酵母nag5敲除体系，大部分筛选所得的单菌落可扩增出3456bp的nag5基因敲除盒.
C：原始基因组模板；M：DL5000Marker；1～8：微波冻融模板.
使用电转化法向巴斯德毕赤酵母中分别导入使用限制酶SalⅠ线性化处理后的质粒pPIC9K-xynA、pPIC9K-catcher，在筛选平板上获取单菌落后，采用微波冻融法制备PCR模板，使用AOX1通用引物扩增目标条带.结果(图8)显示：两种体系均可扩增得到2200bp的野生型AOX1基因，表明获得的单菌落均为甲醇利用野生型(Mut+)；同时，泳道1～4、5～10分别在1200和1700bp处有明显条带，与组合AOX1基因上下游同源序列的目的基因长度相匹配.表明微波冻融模板不仅适用于酿酒酵母菌落的PCR检测，在毕赤酵母中亦有较好的检测效果.
a：pPIC9K-xynA；b：pPIC9K-catcher(M：DL5000Marker；1～4、5～10：微波冻融模板).
培养基的组成以及培养物的生长周期均可成为影响酵母菌落PCR检测效率的因素[18]，本研究选取不同生长时期的酵母菌液进行微波冻融处理，后续的PCR检测结果并无明显差异.对于微波冻融法制备的模板，控制相同模板量，使用10μL反应体系亦可得到相同的检测结果.因此，微波冻融法受培养基以及菌体生长周期的影响较小，相比其他预处理方式更占优势.在酿酒酵母大规模DNA片段组装后的鉴定中，以长链DNA片段为靶标可以提高检测准确度，同时能够助力测序验证工作的高效运行.本研究使用微波冻融法扩增长链DNA片段，所得电泳条带明亮且单一，表明该方法的条件温和且对细胞DNA的破坏较小，适用于长链DNA片段的检测.
本研究从菌落PCR常规的物理预处理方式出发，通过对比各种方法的异同之处，提出使用微波冻融法制备的模板进行酿酒酵母菌落PCR检测，该方法操作简单、耗时短、条件较为温和、破壁效果显著，不仅可在不同基因操作体系中高效扩增短链DNA，且适用于3000bp以上长链DNA片段的检测.此外，在巴斯德毕赤酵母和树干毕赤酵母中使用微波冻融法制备的模板进行菌落PCR均可实现较好的检测效果.综上所述，微波冻融法的应用降低了检测成本，提高了检测效率，适合应用在复杂酵母菌落PCR检测.