（石家庄职业技术学院食品与药品工程学院，河北石家庄050000）
关键词：硝基呋喃代谢物；荧光免疫层析；免疫抗原；量子点微球
本研究以量子点荧光免疫层析技术为基础，建立4种硝基呋喃代谢物残留的复合荧光免疫分析技术，通过性能测试对试纸条进行全面评价，对该多元荧光免疫层析检测技术在兽药残留领域的广泛应用具有重要意义。
BALB/c小鼠购自河北医科大学。
AOZ、AMOZ、1-氨基-乙内酰脲盐酸盐（1-aminohydantoinhydrochloride，AHD·HCl）、盐酸氨基脲（semicarbazidehydrochloride，SEM·HCl）（纯度≥99.0%）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）美国Sigma公司；量子点荧光微球美国OceanNanoTech公司；N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、无水甲醇天津永大化学试剂有限公司；邻醛基苯甲酸（2-carboxybenzaldehyde，2-CBA）、对醛基苯甲酸（4-carboxybenzaldehyde，4-CBA）阿拉丁试剂（上海）有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）南京化学试剂股份有限公司；1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimidehydrochloride，EDC）上海思域化工科技有限公司。
RF-6000荧光分光光度计日本岛津公司、NanoDrop2000紫外扫描仪、Micro17超速离心机美国Thermo公司；CR-GIII高速离心机日本Hitachi公司；MiLLi-QingegraLLo超纯水系统德国密理博公司；JA3003电子精密天平上海衡平仪器仪表厂；T-MeterI荧光免疫分析仪河北特温特生物科技发展有限公司。
1.3.1免疫抗原的制备
半抗原的合成[15]：以CPAOZ为例，合成半抗原。将0.4g4-CBA用2mL纯水溶解，缓缓加DMF至上述溶液，边滴加边搅拌，直至4-CBA完全溶解；称取0.5gAOZ缓慢倾入上述反应液中，室温反应5h，3000r/min离心，保留沉淀弃上清液，沉淀为淡黄色，再加入0.01mol/LPBS重悬沉淀，洗涤3次，50℃烘干，得半抗原CPAOZ。同理，用AMOZ、AHD·HCl和SEM·HCl置换上述步骤中的AOZ，即可得到半抗原CPAMOZ、CPAHD和CPSEM。
免疫抗原的合成[16]：称取24mg的CPAOZ，用2mLDMF溶解，缓慢加入溶有18mgNHS的PBS缓冲液，充分搅拌，反应5min；缓慢加入溶有40mgEDC的PBS缓冲液，室温搅拌2h；称取60mgBSA溶于2mLPBS中，然后将上述反应溶液缓慢加入，4℃搅拌反应过夜；0.01mol/LPBS透析3d，－20℃保存备用。AOZ抗原合成路线图如图1所示。检测原同法制备。
图1AOZ抗原合成路线图Fig.1SyntheticrouteofAOZantigen
1.3.2量子点荧光微球（quantumdotsubmicrobeads，QBs）标记抗体
采用EDC-NHS一步法[17]将QBs分别与4种硝基呋喃类代谢物偶联[18]：将1mgQBs用5mL磷酸（PB）缓冲液（含0.5%吐温-20、0.01mol/L、pH值为6.0）进行悬浮，10000r/min离心30min，收集沉淀；沉淀用5mLPB缓冲液溶解后，加入1.0μgEDC和0.8μgNHS，混匀后避光反应1h，将100μg抗体加入到混合液中，混合搅拌3h，再加入0.1mL0.3mol/L的甘氨酸封闭2h，10000r/min离心30min，收集沉淀；沉淀用750μL复溶液（含5%蔗糖、5%BSA、2%吐温-20和1%ProClin的PB缓冲液）复溶，4℃保存备用。
1.3.3QBs标记抗体偶联物的表征
1.3.4偶联pH值的优化
在1.3.2节QBs标记抗体过程中，分别选用pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的0.01mol/LPB缓冲液[20]。用标记好的抗体测试试纸条，检测不同标记pH值条件下的荧光强度变化，每个pH值重复检测5次，确定最佳标记pH值。
1.3.5饱和标记量的优化
在1.3.2节QBs标记抗体过程中，保持QBs的量不变，分别加入25、50、100、125、150、200、300μg的抗体进行偶联，测定方法同1.3.4节，结果采用Sigmaplot软件绘制曲线图，横坐标为抗体饱和标记量，纵坐标为T线荧光强度，确定最佳饱和标记量。
1.3.6试纸条的组成
QBs荧光免疫层析试纸条的组成如图2所示，其中QBs探针包被在结合垫上[21-22]，AOZ抗原、AMOZ抗原、AHD抗原和SEM抗原分别作为T线，羊抗兔二抗作为C线，依次喷涂在NC膜上。
图2荧光免疫层析试纸条示意图Fig.2Schematicillustrationofthefluorescentimmunochromatographicteststrip
1.3.7样品预处理
1）衍生[23]：称取5.0g鱼肉样品，加入10mLHCl溶液（1mol/L），进行均质处理后放入50mL离心管中，加入500μL邻硝基苯甲醛溶液（30mmol/L），50℃混匀反应60min；
2）萃取[24]：将上述反应溶液用1mol/L的NaOH调至pH7.0，加入10mL乙酸乙酯，涡旋萃取1min，8000r/min离心20min，留取乙酸乙酯层，60℃氮气吹干；用1mL正己烷复溶，加入1mL0.1mol/L的PBS缓冲液进行萃取，8000r/min离心20min，留取缓冲液层用于检测。
1.3.8试纸条性能测试
1.3.8.1标准曲线的制作及检测限测定
分别制备4种硝基呋喃代谢物的系列标准溶液，以AOZ为例，将1mg/mL的AOZ母液稀释成系列标准溶液（质量浓度分别为0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00μg/L），进行QBs荧光免疫层析试纸条测试，每个质量浓度测定5个平行，用干式荧光分析仪进行检测，并读取数值。设定质量浓度为0μg/L时的标准溶液FIT/FIC比值为B0，其他加标质量浓度的FIT/FIC比值为B，以B/B0×100为纵坐标，质量浓度为横坐标作图，绘制竞争抑制曲线，确定定量范围、抑制率半抑制质量浓度（halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50）及检测限。
1.3.8.2准确度和精密度实验
通过鱼肉样本添加回收实验检测QBs荧光免疫层析试纸条的准确度和精密度[26-28]，在空白鱼肉组织中添加0.5、2.0、4.0μg/L3个质量浓度的4种硝基呋喃代谢物，按照1.3.7节的方法进行样品预处理，每个质量浓度重复测定5次，共测定3个批次，计算加标回收率、批内变异系数和批间变异系数。
1.3.8.3特异性实验
分别测试其中1种硝基呋喃代谢物与其他3种代谢物的交叉反应性，将4种硝基呋喃代谢物分别配制成0.5、10.0、100.0μg/L的标准溶液，用荧光免疫层析试纸条进行测试，用干式荧光分析仪进行结果判读。
1.3.8.4与LC-MS/MS法的对比实验
为验证本研究中量子点复合荧光免疫层析试纸条在鱼肉样本检测中的可用性，对来自石家庄市兽药监察所的5份已知样品分别用自制试纸条和GB/T21311—2007中描述的LC-MS/MS法（样品前处理和检测方法）进行检测。
采用SPSS统计软件进行数据处理，Origin制图软件绘制标准曲线。
由图3可知，BSA的最大吸收峰在280nm波长处，CPAOZ的最大吸收峰在330nm波长处，BSA和CPAOZ偶联后，在波长280nm和330nm处均叠加出现吸收峰，表明偶联成功。根据朗伯-比尔定律，计算出CPAOZ-BSA的分子结合比为15∶1。同理，CPSEM-BSA、CPAHDBSA和CPAMOZ-BSA的紫外扫描图如图4～6所示，均表明偶联成功，CPSEM-BSA分子结合比为13.5∶1、CPAHD-BSA分子结合比为19.7∶1、CPAMOZ-BSA分子结合比为19.6∶1。
图3CPAOZ-BSA紫外扫描图Fig.3Ultraviolet(UV)absorptionspectrumofCPAOZ-BSA
图4CPSEM-BSA紫外扫描图Fig.4UVabsorptionspectrumofCPSEM-BSA
图5CPAHD-BSA紫外扫描图Fig.5UVabsorptionspectrumofCPAHD-BSA
图6CPAMOZ-BSA紫外扫描图Fig.6UVabsorptionspectrumofCPAMOZ-BSA
图7pH值对试纸条的影响Fig.7EffectofpHvalueonthetestsrip
pH值会影响偶联过程中抗体的生物活性，通过评价pH值对荧光免疫层析试纸条检测FIT、FIC、FIT/FIC值和竞争抑制率的影响，确定最佳偶联pH值[29]。由图7可知，pH值对荧光免疫层析试纸条的FIT/FIC值影响不大，但是对FIT、FIC和竞争抑制率有较大影响。当pH值为6.5时，试纸条C线、T线荧光强度最高，且竞争抑制率最好，达69%。因此，选择pH值为6.5的缓冲液作为偶联缓冲液。
图8抗体饱和标记量的优化Fig.8Optimizationofsaturatedlabelingamountofantibody
将1mgQBs与不同量的抗体进行偶联，检测阴性样本试纸条T线的荧光强度变化[30]。由图8可知，T线的荧光强度随抗体饱和标记量的增加而增强，在100μg时强度趋于稳定。因此确定100μg/mg是最佳抗体饱和标记量。
2.4.1标准曲线的建立
为了减少基质效应，本研究采用鱼肉组织阴性样本添加系列标准品，绘制QBs荧光免疫层析试纸条定量标准曲线。得到CPAOZ的线性范围为0.1～5.0μg/L，线性方程为y=1.7831x+2.1151（R2=0.9977），IC50为1.54μg/L，IC10为0.4μg/L；CPAHD的线性范围为0.1～5.0μg/L，线性方程为y=1.6750x+1.9688（R2=0.9947），IC50为1.4μg/L，IC10为0.4μg/L；CPSEM的线性范围为0.1～5.0μg/L，线性方程为y=1.9066x+2.3236（R2=0.9961），IC50为1.75μg/L，IC10为0.5μg/L；CPAMOZ的线性范围为0.1～5.0μg/L，线性方程为y=1.9959x+2.4421（R2=0.9980），IC50为1.87μg/L，IC10为0.5μg/L。通过计算IC10得出的AOZ、AHD、SEM和AMOZ的方法检出限分别为0.4、0.4、0.5、0.5μg/L。
2.4.2准确度及精密度
表1准确度及精密度测定结果Table1Resultsofaccuracyandprecisiontest
添加物添加量/（μg/L）批内批间±s回收率/%变异系数/%±s回收率/%变异系数/%AOZ0.50.42±0.0284.24.750.43±0.0486.89.222.01.83±0.1691.58.741.79±0.1489.57.824.03.89±0.2997.37.463.74±0.1893.54.81AHD0.50.41±0.0481.29.850.44±0.0488.49.052.01.86±0.1893.29.681.91±0.1195.55.764.03.59±0.2289.76.133.59±0.2189.85.85SEM0.50.42±0.0383.47.190.40±0.0380.47.462.01.89±0.1694.58.471.85±0.1492.57.574.03.87±0.2396.75.943.68±0.2392.06.25AMOZ0.50.41±0.0382.47.280.41±0.0382.47.282.02.03±0.13101.56.401.80±0.1890.010.004.03.75±0.1993.75.073.75±0.2493.86.40
通过加标回收实验对批内和批间重复性和准确度进行评价。由表1可知，该QBs荧光免疫层析试纸条的批内检测回收率为80%～110%，批内变异系数在15%以内，批间回收率为80%～100%，批间变异系数在15%以内，表明该试纸条具有较好的精密度和准确度，符合《食品中兽药残留检测指南》规定的兽药残留检测方法的回收率为80%～120%、变异系数在15%以内的要求。
2.4.3特异性
用QBs荧光免疫层析试纸条分别测试4种代谢物的系列标准溶液，结果表明，某1种硝基呋喃代谢物对其他代谢物的测试未出现阳性结果，4种硝基呋喃代谢物AOZ、AHD、SEM和AMOZ之间的交叉反应率小于0.1%，表明试纸条具有较好的特异性[31-32]。
2.4.4与LC-MS/MS法的比较结果
表2QBs荧光免疫层析试纸条与LC-MS/MS法的检测结果对比Table2ComparisonofresultsofQB-ICAandLC-MS/MSforthedeterminationofnitrofuranmetabolites
注：N.阴性。
药物名称方法样品测定结果/（μg/L）12345AOZLC-MS/MSN5.67±0.476.47±0.512.35±0.06N试纸条N5.59±0.456.96±0.382.08±0.12NAHDLC-MS/MSN3.46±0.324.39±0.340.98±0.14N试纸条N3.24±0.364.35±0.531.06±0.18NSEMLC-MS/MSN3.74±0.295.42±0.410.73±0.06N试纸条N3.59±0.125.39±0.440.64±0.05NAMOZLC-MS/MSN4.34±0.297.88±0.211.23±0.11N试纸条N4.39±0.297.67±0.271.27±0.08N
通过EDC-NHS一步法将QBs分别与AOZ、AHD、SEM和AMOZ偶联，得到相应的QBs探针，在此基础上结合多元检测体系和QBs荧光免疫检测层析技术，制备硝基呋喃代谢物复合荧光免疫层析试纸条。通过绘制标准曲线，得出AOZ、AHD、SEM和AMOZ的LOD分别为0.4、0.4、0.5、0.5μg/L；通过加标回收实验对批内和批间的重复性和准确度进行评价，得出试纸条的批内检测回收率为80%～110%，批内变异系数在15%以内，批间回收率为80%～100%，批间变异系数在15%以内；且4种硝基呋喃代谢物AOZ、AHD、SEM和AMOZ之间的交叉反应率小于0.1%。
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GUOHuican(SchoolofFoodandDrugEngineering,ShijiazhuangUniversityofAppliedTechnology,Shijiazhuang050000,China)
Keywords:nitrofuranmetabolites;fluorescentimmunochromatography;immunogen;quantumdotmicrospheres
收稿日期：2019-03-22
作者简介：郭会灿（1976—）（ORCID：0000-0002-3209-6794），女，副教授，硕士，研究方向为生物制药。E-mail：guohuican@126.com