AMPK是一种进化保守的细胞营养状态感受器和能量稳态调节器，在ATP减少时，AMPK被激活并作为代谢检查点。当多重代谢应激产生并超出AMPK介导的适应时，会诱导细胞死亡，但AMPK调节代谢应激下细胞存活的机制并不完全清楚。
受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)是细胞死亡和炎症的关键介质。激活的RIPK1可通过肿瘤坏死因子-α(TNFα)刺激肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)来介导受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)和MLKL的依赖性坏死或caspase-8的依赖性凋亡。除了TNFR，RIPK1也在Fas死亡受体(也称为CD95)、TRAIL受体1(TRAIL-r1，也称为DR4)和TRAIL-r2(也称为DR5)的下游被激活。已知抑制RIPK1激活对缺血性损伤的保护是非常有效的，然而，RIPK1是否以及如何在缺血条件下被激活尚不清楚。
2023年6月29日，美国哈佛医学院魏文毅教授等人在Science杂志上发表了题为“MetabolicorchestrationofcelldeathbyAMPK-mediatedphosphorylationofRIPK1”的研究论文，该研究发现了AMPK通过在Ser415位点磷酸化抑制RIPK1的活性来抑制细胞死亡，实现了代谢压力下细胞存活和死亡的精细调控。
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代谢应激促进RIPK1的激活
与Ripk1D138N/D138NMEFs不同，Ripk1敲除(KO)MEFs比WTMEFs对葡萄糖饥饿诱导的细胞死亡更敏感(图S2A)。然而，在Jurkat细胞中，RIPK1缺乏减少了葡萄糖饥饿诱导的细胞死亡和RIPK3和MLKL的激活(图S2,B和C)，表明RIPK1缺乏对葡萄糖饥饿反应中细胞死亡的影响取决于细胞环境。
为了验证上述发现，接下来，作者对WT小鼠、Ripk1D138N/D138N小鼠和Tnfr1/2DKO小鼠进行肝脏缺血再灌注损伤造模。组织学分析显示，缺血的WT和Tnfr1/2DKO小鼠存在严重的炎症浸润和细胞死亡，而Ripk1D138N/D138N小鼠没有这种情况(图1E)。此外，p-RIPK1(S166)免疫荧光染色显示Tnfr1/2DKO小鼠肝组织RIPK1仍然被激活，并于WT小鼠水平相当。这进一步验证了上述发现，即存在不依赖于经典TNFa信号通路的RIPK1信号激活途径。
基于此，作者试图探究RIPK1激活的新途径。接下来，首先探索了包括Fas、DR4和DR5在内的其他死亡受体在葡萄糖饥饿时调控RIPK1活性中的可能作用。DR4或DR5的缺失，而不是FAS的缺失，减少了RIPK1的激活和细胞死亡(图S4,A至F)。葡萄糖剥夺通过激活转录因子4(ATF4)和C/EBP同源蛋白(CHOP)依赖机制激活TRAIL受体，以不依赖配体的方式促进细胞死亡。与此一致，作者观察到葡萄糖饥饿后TRAIL受体上调(图S4,D和F)。于是作者使用肝缺血损伤小鼠模型来检测Dr5的作用，Dr5是小鼠中表达的单一TRAIL受体。结果表明，Dr5缺乏抑制RIPK1激活、细胞死亡和炎症(图S4、G和H)。
因此，上述数据表明，在葡萄糖剥夺条件下，TRAIL受体是RIPK1激活和细胞死亡的上游驱动因素。
图1代谢应激以依赖RIPK1的方式促进细胞死亡和炎症
图S1能量应激促进RIPK1的激活
图S2抑制RIPK1/RIPK3MLKL可减少葡萄糖剥夺引起的细胞死亡
图S4敲除DR4或DR5可以抑制RIPK1活性的诱导
AMPK在代谢应激反应中磷酸化RIPK1
为了检测内源性RIPK1的磷酸化，作者开发了一种针对人RIPK1的p-S416的磷酸化特异性抗体，该抗体对应于小鼠RIPK1的p-S415(图S6,D和E)。作者观察到，葡萄糖饥饿后，小鼠RIPK1的内源性p-S415和人RIPK1的内源性p-S416在WT中增加，而在AmpkDKOMEFs和HT29细胞中分别没有增加(图2C和D)。
作者于是测试了AMPK的直接药理激活是否足以诱导RIPK1的磷酸化。通过AMPK依赖性的AICAR处理可以诱导RIPK1Ser415位点磷酸化(图2E)。同样，用化合物991处理，一种直接结合并激活AMPK的小分子，足以诱导RIPK1在Ser415位点磷酸化(图2F)。一致地，RIPK1的磷酸化在二甲双胍治疗后也增加了，二甲双胍是一种广泛用于2型糖尿病的处方药，已知在体外和体内都能激活AMPK(图2G)。肝激酶B1(LKB1)是能量应激条件下激活AMPK的主要激酶。二甲双胍或葡萄糖饥饿治疗导致RIPK1的Ser415位点磷酸化，而在Lkb1KOMEFs中被消除。在这些细胞中，RIPK1S415的磷酸化与AMPK底物乙酰辅酶a羧化酶(ACC)的磷酸化是平行的(图2C-G）。在葡萄糖剥夺4小时后，用25mM葡萄糖刺激细胞，磷酸化迅速恢复到基础水平(图2H)。
因此，作者接着测试了AMPK是否可以直接磷酸化RIPK1。结果表明过表达flag标记的RIPK1和血凝素(HA)标记的AMPK之间存在相互作用。在体外激酶试验中，重组AMPK诱导flag标记的RIPK1Ser416位点磷酸化(图2I)。此外，在小鼠遭受空腹导致体内低血糖时，RIPK1p-S415在肝脏和胰腺中增加，这两个器官对禁食敏感，AMPK被激活(图2J)。
图2AMPK在代谢应激反应中磷酸化RIPK1的S416位点
图S5葡萄糖剥夺诱导RIPK1的迁移能力发生显著变化
图S6抗p-RIPK1(S416)抗体的验证
Ampk缺乏促进RIPK1驱动的细胞死亡和炎症
作者接着探究了AMPK对RIPK1的磷酸化是否代表了对葡萄糖剥夺反应的一种生存机制.
Ampk缺乏使细胞对葡萄糖剥夺诱导的细胞死亡敏感(图3A)。此外，MEF中Ampk的基因缺失促进了RIPK1的激活(图3B)。因此，在AmpkDKOMEF中，葡萄糖剥夺诱导RIPK3与RIPK1的相互作用比在WTMEF中更强，这表明Ampk缺乏促进了RIPK1驱动的坏死(图3C)。
为了确定AMPK在体内调控RIPK1活性中的作用，作者在使用他莫昔芬诱导Ampka1和Ampka2缺失的ubc-creERT2小鼠的多种组织中，通过p-S166RIPK1免疫染色检测了RIPK1的激活。Ampka1和Ampka2缺失诱导RIPK1激活，增加脾脏、肾脏和肠道等多个组织的细胞死亡(图3D)。
与AMPK介导的RIPK1磷酸化直接抑制其活性的观点一致，RIPK1S416A突变体的过表达导致p-S166RIPK1的数量增加。作者将RIPK1的WT和S415A突变体重新引入RIPK1的KOMEF中。用RIPK1S415A突变体重组的RIPK1KOMEF比用WTRIPK1重组的细胞对葡萄糖剥夺诱导的细胞死亡更敏感(图3F)。
为了进一步研究AMPK介导的RIPK1磷酸化在体内的生理病理重要性，作者构建了Ripk1S415A/S415A敲入小鼠。与上述结果一致，RIPK1S415A突变增加了细胞死亡和炎症(图3G-J)。
上述结果表明，RIPK1S415磷酸化抑制RIPK1活性并阻断细胞在能量应激下的死亡。
图3AMPK缺乏促进RIPK1驱动的细胞死亡和炎症
抑制RIPK1对髓系AMPKKO小鼠肝缺血再灌注损伤有保护作用
在上述研究的基础上，作者进一步验证了RIPK1与AMPK之间的关系。
作者首先构建了髓系Ampka1敲除小鼠，并将这些小鼠与Ripk1D138N/D138N小鼠杂交，生成Ampka1f/f;LysM-Cre;Ripk1D138N/D138N小鼠。接下来，作者对这些小鼠进行肝缺血再灌注(IR)损伤(图4A)。Ampka1fl/fl;LysM-Cre小鼠与WT小鼠相比，血清ALT和AST异常升高(图4B)。此外，Ampka1fl/fl;LysM-Cre小鼠显示炎症细胞浸润增加，而Ampka1
fl/fl;LysM-Cre;Ripk1D138N/D138N小鼠炎症细胞浸润减少(图4C)。与WT小鼠相比，作者还检测到Ampka1fl/fl;LysM-Cre小鼠肝脏中p-S166RIPK1+和TUNEL+细胞数量增加，促炎细胞因子表达增加(图4D-H）。
虽然在肝脏IR损伤后的Ampka1fl/fl;LysM-Cre小鼠的肝脏中检测到大量的TUNEL+细胞，但它们都没有出现RIPK3的T231/S232磷酸化，这表明IR损伤的肝脏中没有出现细胞程序性坏死(图S7C)。这些数据表明，在缺血应激反应中，RIPK1依赖性的细胞凋亡介导的细胞死亡和炎症的作用比坏死效应更强。
上述结果表明，抑制RIPK1对髓系AMPK敲除小鼠肝缺血再灌注损伤有保护作用。