本标准规定了食品中酒石酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸和已二酸的测定方法。
本标准适用于果汁及果汁饮料、碳酸饮料、固体饮料、胶基糖果、饼干、糕点、果冻、水果罐头、生湿面制品和烘焙食品馅料中7种有机酸的测定。
2.原理
3.试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1甲醇(CH3OH):色谱纯。
3.1.2无水乙醇(CH3CH2OH):色谱纯。
3.1.3磷酸(H3PO4)。
3.2试剂配制
3.2.1磷酸溶液(0.1%):量取磷酸0.1mL,加水至100mL,混匀。
3.2.2磷酸-甲醇溶液(2%):量取磷酸2mL,加甲醇至100mL,混匀。
3.3标准品
3.3.1乳酸标准品(C3H6O3),纯度≥99%。
3.3.2酒石酸标准品(C4H6O6),纯度≥99%
3.3.3苹果酸标准品(C4H6O5),纯度≥99%。
3.3.4柠檬酸标准品(C6H8N7),纯度≥98%。
3.3.5丁二酸标准品(C4H6N4),纯度≥99%。
3.3.6富马酸标准品(C4H4O4),纯度≥99%。
3.3.7己二酸标准品(C6H10N4),纯度≥99%
3.4标准溶液配制
3.4.1酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸和富马酸混合标准储备溶液:分别称取酒石酸1.25g、苹果酸2.5g、乳酸2.5g、柠檬酸2.5g、丁二酸6.25g(精确至0.01g)和富马酸2.5mg(精确至0.01mg)于50mL小烧杯中,加水溶解,用水转移到50mL容量瓶中,定容,混匀,于4℃保存,其中酒石酸质量浓度为2500μg/mL、苹果酸5000μg/mL、乳酸5000μg/mL、柠檬酸5000μg/mL、丁二酸12500μg/mL和富马酸12.5μg/mL。
3.4.2酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸混合标准曲线工作液:分别吸取混合标准储备溶液(3.4.1)0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL、10.00mL于25mL容量瓶中,用磷酸溶液(3.2.1)定容至刻度,混匀,于4℃保存。
3.4.3己二酸标准储备溶液(500μg/mL):准确称取按其纯度折算为100%质量的已二酸12.5mg,置25mL容量瓶中,加水到刻度,混匀,于4℃保存。
3.4.4己二酸标准曲线工作液:分别吸取标准储备溶液(3.4.3)0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL、10.00mL于25mL容量瓶中,用磷酸溶液(3.2.1)定容至刻度,混匀,于4℃保存。
3.5材料
强阴离子固相萃取柱(SAX):1000mg,6mL。使用前依次用5mL甲醇、5mL水活化。
4.仪器和设备
4.1高效液相色谱仪,带二极管阵列检测器或紫外检测器。
4.2天平:感量为0.01mg和0.01g。
4.3高速均质器。
4.4高速粉碎机。
4.5固相萃取装置。
4.6水相型微孔滤膜:孔径0.45μm。
5.分析步骤
警告:实验人员在使用液氮时,应佩戴手套等防护工具,防止意外洒溅,造成冻伤。
5.1试样制备及保存
5.1.1液体样品
将果汁及果汁饮料、果味碳酸饮料等样品摇匀分裝,密闭常温或冷藏保存。
5.1.2半固态样品
对果冻、水果罐头等样品取可食部分匀浆后,搅拌均匀,分装,密闭冷藏或冷冻保存。
5.13固体样品
饼干、糕点和生湿面制品等低含水量样品,经高速粉碎机粉碎、分装,于室温下避光密闭保存;对于固体饮料等呈均匀状的粉状样品,可直接分装,于室温下避光密闭保存。
5.1.4特殊样品
对于胶基糖果类黏度较大的特殊样品,现将样品用剪刀铰成约2mm×2mm大小的碎块放人陶瓷硏钵中,再缓慢倒入液氮,样品迅速冷冻后采用研磨的方式获取均匀的样品,分装后密闭冷冻保存。
5.2试样处理
5.2.1果汁饮料及果汁、果味碳酸饮料
称取5g(精确至0.01g)均匀试样(若试样中含二氧化碳应先加热除去),放入25mL容量瓶中,加水至刻度,经0.45μm水相滤膜过滤,注入高效液相色谱仪分析。
5.2.2果冻、水果罐头
称取10g(精确至0.01g)均匀试样,放入50mL塑料离心管中,向其中加入20mL水后在15000r/min的转速下均质提取2min,4000r/min离心5min,取上层提取液至50mL容量瓶中,残留物再用20mL水重复提取一次,合并提取液于同一容量瓶中,并用水定容至刻度,经0.45m水相滤膜过滤,注入高效液相色谱仪分析。
5.2.3胶基糖果
称取1g(精确至0.01g)均匀试样,放入50mL具塞塑料离心管中,加入20mL水后在旋混仪上振荡提取5min,在4000r/min下离心3min后,将上清液转移至10omL容量瓶中,向残渣加入20mL水重复提取1次,合并提取液于同一容量瓶中,用无水乙醇(3.1.2)定容,摇匀准确移取上清液10mL于100mL鸡心瓶中,向鸡心瓶中加入10mL无水乙醇(3.1.2),在80℃士2℃下旋转浓缩至近干时,再加入5mL无水乙醇(3.1.2)继续浓缩至彻底干燥后,用1mL×1mL水洗涤鸡心瓶2次。将待净化液全部转移至经过预活化的SAX固相萃取柱中,控制流速在1mL/min～2mL/min,弃去流岀液。用5mL水淋洗浄化柱,再用5mL磷酸-甲醇溶液(3.2.2)洗脱,控制流速在lmL/min～2mL/min,收集洗脱液于50mL鸡心瓶中,洗脱液在45℃下旋转蒸发近干后,再加入5mL无水乙醇(3.1.2)继续浓缩至彻底干燥后,用1.0mL磷酸溶液(3.2,1)振荡溶解残渣后过0.45μm滤膜后,注入高效液相色谱仪分析。
5.2.4固体饮料
称取5g(精确至0.01g)均匀试样,放亼50mL烧杯中,加40mL水溶解并转移至100mL容量瓶中,用无水乙醇(3.1.2)定容至刻度,摇匀,静置10min
准确移取上清液20mL于100mL鸡心瓶中,向鸡心瓶中加人10mL无水乙醇(3.1.2),在80℃士2℃下旋转浓缩至近干时，再加入5mL无水乙醇（3.1.2）继续浓缩至彻底干燥后，用1mL×1mL水洗涤鸡心瓶2次。将待净化液全部转移至经过预活化的SAX固相萃取柱中,控制流速在1mL/min～2mL/min,弃去流岀液。用5mL水淋洗净化柱,再用5mL磷酸-甲醇溶液(3.2.2)洗脱,控制流速在lmL/min～2mL/min,收集洗脱液于50mL鸡心瓶中,洗脱液在45℃下旋转蒸发近干后,再加入5mL无水乙醇(3.1.2)继续浓缩至彻底干燥后,用1.0mL磷酸溶(3.2.1)振荡溶解残渣后过0.45μm滤膜后,注入高效液相色谱仪分析。
5.2.5面包、饼干、糕点、烘焙食品馅料和生湿面制品
称取5g(精确至0.01g)均匀试样,放入50mL塑料离心管中,向其中加入20mL水后在15000r/min均质提取2min,在4000r/min下离心3min后,将上清液转移至100mL容量瓶中,向残渣加入20mL水重复提取1次,合并提取液于同一容量瓶中,用无水乙醇(3.1.2)定容,摇匀。