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【关键词】生物黄酮;心血管作用;消化系统作用
1心血管系统
1.1沙苑子总黄酮沙苑子总黄酮(totalflavonoidfractionoAstra)是从豆科植物扁茎黄芪的干燥成熟种子中分离而得，早在20世纪80年代尹钟洙等［1］曾初步观察到静脉注射沙苑子水煎剂及其总黄酮可引起血压明显下降，李景新等［2］报道沙苑子总黄酮对肾血管性高血压大鼠（RHR）有明显降压作用，其机理可能与其降低血管紧张素（Ang）水平有关。吴捷等［3］认为沙苑子总黄酮能抑制心肌细胞钙离子内流。
1.2沙棘总黄酮(TFH)沙棘在许多药理作用方面与银杏相近，而银杏（TFG）抗心脑缺血作用已在临床上广泛应用，王立群等［4］实验表明，TFH和TFG对离体大鼠工作心脏缺血后心功能及血流动力学各指标有不同程度的改善作用，主要表现在能明显减轻缺血后LVPSP，+dp/dtmax下降，TFH作用明显优于TFG。
黄酮具有抗氧化、消除自由基作用。吴英等［5］研究表明沙棘总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤时能明显减轻缺血再灌损伤区超微结构的病理改变，显著提高大鼠心肌组织SOD活性并减少MDA的生成。TFH对大鼠心肌缺血再灌损伤的保护作用可能与提高自由基清除酶活性及抑制脂质过氧化反应有关。
1.3羊藿总黄酮许兰之等［6］研究了羊藿总黄酮(TFE)对肾上腺素能受体阻断作用，发现TFE选择性阻断离体及整体动物心肌β1受体，对气管β2受体和血管平滑肌α受体无阻断的作用，此研究为临床应用羊藿治疗冠心病心绞痛提供了理论依据。
2消化系统
2.1黄芩茎叶总黄酮黄芩茎叶总黄酮可剂量依赖性地抑制胆盐的吸收(P＜0.01)，其与考来烯胺的抑制胆盐吸收的作用相比，没有显著性差异(P＞0.05)。提示抑制胆盐的吸收可能是黄芩茎叶总黄酮调血脂作用机理之一。黄芩茎叶总黄酮应用于降血脂和防治冠心病可能会优于考来烯胺。但黄芩茎叶总黄酮抑制胆盐吸收的同时，脂溶性维生素的吸收会不会受到抑制尚须进一步研究［9］。
我室近来研究表明皱皮木瓜提取物依剂量抑制胃肠运动;抑制回肠自发性收缩反应和非竞争性拮抗乙酰胆碱诱导胃底平滑肌收缩的量效曲线;同时能减弱Ca2+所致兔回肠收缩，木瓜提取物对胃肠平滑肌收缩的松弛与抗钙作用有关［10］。提示皱皮木瓜具有解痉作用。
3镇痛抗炎
3.1银杏叶总黄酮
在小鼠扭体模型上，皮下注射银杏叶总黄酮20～80mg/kg，可显著减少小鼠扭体数，并且呈剂量依赖关系;在小鼠热板模型上，皮下注射和侧脑室注射银杏叶总黄酮均可显著地延长小鼠舔足潜伏期，结果表明银杏叶总黄酮有明显镇痛作用，其镇痛作用可能有中枢机制的参与［11］。
3.2芦丁宋必卫等［12］对芦丁的镇痛作用研究结果表明芦丁(6.25～100mg/kg，ip)呈剂量依赖性的抑制小鼠扭体反应；芦丁(50～100mg/kg，ip)明显提高小鼠嘶叫刺激阀值，显著延长小鼠热板舔足反应潜伏期，表明芦丁有镇痛作用。其镇痛作用比阿斯匹林强，但比吗啡弱。
3.3木瓜野木瓜系木通科野木瓜属植物，具有祛风止痛功能。野木瓜对髓鞘和轴突膜有亲和力，可引起髓鞘和轴突膜结构的变化，从而导致神经传导阻滞［13］。我室实验结果表明：资木瓜提取物对醋酸、温度所致小鼠疼痛有较好的镇痛作用，但对二甲苯所致小鼠耳肿胀消肿作用很弱［14］。
3.4荞麦叶总黄酮荞麦叶总黄酮(TFBL)能明显减轻肉芽肿的形成，降低毛细血管通透性和抑制耳肿，显示TFBL具有明显的镇痛抗炎作用［15］。其机制可能与TFBL所含的主要成分芦丁和槲皮素有关。据报道，槲皮素对12脂氧合酶的活性有很强的抑制作用，可影响花生四烯酸的代谢过程。芦丁、槲皮素镇痛机制还与钙离子拮抗有关。TFBL具有清除自由基，抗脂质过氧化作用［16］，可能也参与抗炎作用，有待深入研究。荞麦叶资源丰富，其提取的TFBL几乎无毒，值得进一步开发利用。
3.5黄蜀葵花总黄酮(TFA)黄蜀葵花总黄酮TFA(ig或ip)可不同程度地抑制小鼠扭体反应；TFA(140，280mg/kg，ig)可使福尔马林致小鼠疼痛的Ⅰ、Ⅱ相反应明显减轻，TFA(ip)对同侧ip福尔马林导致的疼痛可产生同样抑制作用，但对侧ip福尔马林致小鼠疼痛无明显影响；动脉注射TFA200mg/kg可明显减轻KCl诱发的家兔疼痛反应；连续用药可使TFA在小鼠跳跃实验中阳性率为0。以上研究结果表明TFA有一定的镇痛作用且局部给药有效，连续用药无成瘾性。TFA的镇痛机制可能既不同于阿片类药物，也不同于非甾体抗炎药，是一个镇痛机制值得进一步探讨的新型镇痛药物［17］。
3.6蜂胶总黄酮(TFP)蜂胶总黄酮具有广泛的生物活性如镇痛作用等。注射TFP后能减少小鼠扭体次数。热板实验结果也表明TFP可延长小鼠舔足潜伏期，即延缓疼痛反应。甲醛致痛模型结果表明，注射TFP后在第一时相对小鼠疼痛反应无明显影响，但可显著降低第二时相的疼痛反应。说明TFP对炎症所致疼痛反应有明显镇痛作用。icvTFP低剂量(为ip给药剂量的1/20，即5mg/kg)时，即可延长温浴致小鼠缩尾反应潜伏期，提示TFP对小鼠具有中枢性镇痛作用。已知NO在外周和中枢中以不同水平参与痛觉的调节。高剂量TFP在抑制小鼠热板反应时能降低小鼠脑组织NO的含量，提示TFP镇痛作用可能与抑制小鼠脑组织中NO的释放有关；另外，ipTFP在抑制小鼠热板反应同时，可降低脑组织、血清中MAD含量，提示TFP的镇痛作用与抑制自由基及其过氧化物产生也有一定关系。PEGz是一种非常重要的疼痛介质之一，PEG的外周致痛作用早已明确。ipTFP可降低脑组织和血清中的PEGz含量，提示TFP的镇痛作用与抑制PEG合成也有一定关系。TFP在多种疼痛动物模型中均表现出明显的镇痛作用，并可能通过降低脑组织中NO，MAD，PEG含量和血中的MAD，PEG含量而发挥镇痛作用。至于其确切的镇痛机制还有待进一步的研究［18］。
4其他
金丝桃苷、芸香苷及槲皮素等有良好的镇痛作用［19］，其作用机制与Ca2+拮抗有关，尤其是Hyp不仅在多种全身镇痛模型上有作用，而且在兔隐神经放电，兔耳K+皮下渗透等局部致痛模型上更有良好的局部镇痛作用［20］，其作用机制与吗啡和阿斯匹林皆不同，系一新型的镇痛药。
参考文献
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关键词：功能基因组；高通量数据；生物信息学
1差异显示反转录PCR技术
差异显示反转录PCR（DDRT―PCR）技术是由Liang和Pardee等提出的，以PCR和聚丙烯酞胺凝z电泳为基础的功能基因组学的传统方法。该方法的基本原理是：以1对细胞（或组织）的总RNA反转录而成的cDNA为模板，利用PCR的高效扩增，通过5’端和3’端引物的合理设计和组合，将细胞（或组织）中表达的基因片段直接显示在DNA测序胶上，从而找出1对细胞（或组织）中表达有差异的cDN断。DDRT―PCR具有周期短，功能多，灵敏度高，所需RNA的量较少并且重复性较高等优点。但是，在实际施行过程中，DDRT―PCR技术存在着假阳性率高、凝胶中单条cDNA带成分不均一、所获cDNA仅代表mRNA3’UTR（非翻译区）、一些低拷贝数mRNA不能有效呈现等问题。[1]
2基因表达序列分析
基因表达序列分析（SAGE）是Velculescu等人建立的一种快速高效地分析转录物的实验方法。其理论依据是：基因组中95%的基因可以由来自cDNA3’端特定位置的一段9―11bp长的序列加以区分。这一段特异的基因序列被记作SAGE标签。基因表达序列分析通过对cDNA制备SAGE标签，然后将这些标签串联起来并对其进行测定，可以显示出各SAGE标签所代表的基因在特定的组织中是否有表达，同时还可以将SAGE标签所出现的频率作为其所代表的基因表达程度的指标。但是，应用SAGE技术有一个重要前提条件：GenBank中必须有某一物种足够多的DNA序列的资料（特别是EST序列的资料）。[2]
3微阵列分析
4反义RNA分析
反义RNA是能与靶RNA互补配对的，用来定点分析某一段DN段（基因）功能的小分子RNA。反义RNA分析即是利用反义RNA来进行功能基因组分析的方法。该方法首先分离基因片段的mRNA，合成其mRNA的互补RNA（反RNA）。然后给反RNA加上基因表达必需的元件（如启动子等），接着插入T-DNA。将其转化到植株中，那么合成的基因就会在植株中表达，并表现出相应性状。因为反义RNA与靶RNA碱基配对的结合方式，反义RNA可以在DNA复制、转录和翻译水平上对基因表达加以调控。
5蛋白质组分析
蛋白质组分析方法主要涉及两个步骤：蛋白质的分离和蛋白质的鉴定。用于蛋白质分离的技术主要是双向凝胶电泳（2-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE），其原理是细胞抽提物在电泳过程中蛋白质个体首先依据所带电荷然后依据分子大小被分离。这种方法的最大缺点是重复性差，使得几乎不能同来自其他实验室的资料进行比较。
6生物信息学
7小结与展望
随着发展，基因组学由结构基因组学向功能基因组学发展，由此也产生了大量应用于功能基因组研究的工具和方法。这些方法从不同的角度和方向挖掘基因本身蕴含的丰富信息资源。功能基因组学无论是应用于获取大量基因功能信息，亦或是针对特定基因的研究都取得了突破性的进展，发展速度迅速。但随着各类研究的不断深入进行，这些方法的精确性和准确性会渐渐不再满足条件，同时各项技术尚未解决的一些问题也会被放大，单个方法或技术可能难以对新的问题有较好的应用。结合各种方法，扬长避短，综合应用各种技术可以对功能基因组有更全面、深入的研究。[4]
功能基因组学的应用十分广泛，从动物、植物到微生物群落分析都可以取得较好的研究成果，也可以应用于医药、毒理等领域。随着计算机技术的发展，将生物信息学应用于功能基因组学，借助计算机强大的计算能力，功能基因组学将能取得更大的突破。
[1]赵锦荣，阎小君，苏成芝.差异显示反转录PCR技术研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2000，27（1）：28-32.
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关键词：生物信息学；合作式教学；教学模式；教学改革
作者简介：刘庆坡（1976-），男，河北曲阳人，浙江农林大学农业与食品科学学院，副教授。（浙江临安311300）
基金项目：本文系浙江农林大学“农学类核心课程教学团队”项目（项目编号：TD1201）、浙江农林大学研究生优质课程建设项目《生物信息学》的研究成果。
生物信息学是20世纪90年代由多学科知识相互渗透、融合而兴起的一门新兴交叉学科，现已成为当今生命科学和自然科学的重大前沿领域之一。[1]基于本学科在现代生命科学研究中的重要地位，现在国内外许多高校都纷纷设置了生物信息学专业或开设了“生物信息学”课程。[2]为培养具有创新精神和创业能力的应用型、复合型人才，浙江农林大学近年来面向农学等本科专业及作物、森林培育、林木遗传育种等研究生专业开设了“生物信息学”选修课程。
生物信息学是理论概念与实践应用并重的学科，具有开放性、发展性、交叉性、综合性、应用性等特点。鉴于此，尽管国内的生物信息学科学研究开展得如火如荼，但由于受到师资、教材、授课对象、教学条件、教学法等因素限制，[3，4]开设该课程的高校尚未真正形成一套成熟的、科学的教学体系。近年来，各高校根据自身特点，不断探索将CM法、PBL法、探究性、启发性教学、双语教学等教学法与手段引入课堂，并革新教学内容及考核方式等，取得了不错的课程教学效果。[3，5-9]
现代教学改革与实践证明，在教学过程中必须要突出“学生是教学活动的主体”，既要注意张扬学生“个性”，更要强化学生团队合作意识及创新、创业能力培养，以保证人才培养质量。杨瑞等[10]调查发现，现在大部分学生比较“独”，不愿意与人合作，这导致学生间人际关系淡漠，学习、做事效率低下。随着各种“组学”计划的开展，产生了数以万、亿计的序列数据，生物信息学得到了空前发展。在这种情况下，传统的“填鸭式”、“布道式”教学模式已与当前社会快速发展的局面格格不入，迫切需要变革。合作式教学法是20世纪70年代兴起于美国的一种参与式或协作式教学法，它以学生为中心，在教师恰当的组织、引导和有效调控下，使学生成为教学过程中的积极成分，通过“师生”、“生生”积极合作完成教学任务。[11]为激发学生的学习积极性和教学参与热情，在采用启发式、案例式和研讨式教学基础上，尝试将合作式教学法引入“生物信息学”教学课堂。
一、开展合作式教学的必要性
一是学生的重视程度不够。有些学生对该课程的认识比较偏颇，不清楚其教学目的及学后有何用处，因而学习目的不明确，学习动力不足。
二、合作式教学的组织与实施
1.教学目标与设计
（1）教学目标。根据现代教育教学规律，以“生物信息学”优质课程建设为依托，以课堂建设为抓手，以培养“两创型”高素质应用人才为根本任务，以多媒体、网络、教学平台为载体，深化改革，通过师生、生生间相互影响与合作，突显学生教学主体地位，切实提高课堂教学效果。
2.教学组织与实施
合作式教学的关键是调动学生学习兴趣，使其积极参与其中，即教师应用灵活多样的教学手段，鼓励学生积极参与教学过程，并通过实践演练、课堂报告、研讨、课上和课下实时交流等为载体强化教学效果。经过近几年教学实践，总结调动学生学习积极性的基本要素，主要围绕以下几方面开展合作式教学：
（5）全员参与，分类评价。本课程为专业选修课。课程成绩以平时成绩70%，期末考试（开卷）30%来计算。平时成绩主要由学生出勤、课堂参与度、实验报告、课堂报告等组成，其中实验及课堂报告环节均以小组形式进行，重点考查学生的学习态度和完成质量等。在涉及到分组考核时，要求小组间分别评分，教师采取一定措施保证各组间打分相对客观、公平，实现全员参与评价。
3.教学效果与评价
经在2010级2个自然班55名农学专业学生中进行合作式教学试点发现，学生最终成绩中最低72分，最高95分，平均为86.1±5.08分。经T检验分析，显著高于27名2008级学生的平均成绩（83.2±5.13分；p=0.023）。因此，在“生物信息学”课程开展以课堂活动为特征的合作式教学，不仅活跃了课堂气氛，增强了学生的参与意识，还极大地调动了学生主动学习的积极性，明显提高了学习成绩，培养了学生的科研创新能力和团队合作意识。“教学结合实际”、“讲课时经常会举些有关知识的例子，很能提高同学的学习热情”、“老师时常会讲授有关的科学前沿知识，很能调动同学积极性”、“注重培养学生自主学习能力”、“上课与其他老师的方式不一样，利于我们听课”、“始终让我保持上课兴趣”、“上课有活力！”等是学生对“生物信息学”课程教学模式与教学效果的客观评价。
三、结束语
生物信息学是一个不断发展中的学科。实践证明，只有紧跟学科发展步伐，及时更新、丰富教学内容；坚持“以生为本”，立足授课对象的实际需要，不断调整和革新教学模式与教学方法，改进和完善学科教学体系，才能稳步提升本课程课堂教学效果，保证教学质量，从而为我国农业现代化培养更多高素质、强能力的应用型人才。
参考文献：
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关键词：品种真实性鉴定分子标记
1、农作物品种真实性鉴定分子检测技术的研究进展
目前在品种真实性鉴定中使用的主要分子检测技术是分子标记技术。自从1980年Botstein等首次提出RFLP作为遗传标记构建遗传连锁图谱以来，分别出现了20多种分子标记技术。目前在品种真实性鉴定中应用到的分子标记为RFLP、AFLP、RAPD以及SSR标记技术。
1.1RFLP技术是1974年Grodzicker发明，是以Southern杂交为核心的分子标记技术，该技术原理是检测DNA由限制性内切酶切后形成的DN段的大小差异。RFLP标记技术的优点是标记量大，等位基因间共显性可区分纯合子和杂合子；缺点是工作量大，成本高，要求的DNA量大且纯度要高。
1.2AFLP技术是1993年Zabeau等发明，通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性。结合了限制酶切和PCR技术，可在一个反应内检测大量的限制性片段，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。但是AFLP技术操作复杂，成本较高，并且该项技术受到专利保护，只能用于非盈利性的科学研究。
1.3RAPD技术是Willims、Welsh、McClelland等分别独立建立。用一种由10个核苷酸组成的随机引物，采用PCR技术对基因组的几个区域进行扩增，产生大小不同的DNA，即为随机扩增多态性。RAPD标记技术的优点是仅需少量DNA，简单快速，成本低；缺点是稳定性差，重复性不好，显性，不能鉴定杂合子。
1.4SSR技术室根据微卫星重复序列两端的保守序列设计引物，用PCR来扩增重复序列的多态性。SSR主要依赖于基本单元次数的变异，而这种变异在生物群体中是大量存在的。SSR标记的优点是具有大量的等位差异，多态性十分丰富，并且操作简便，稳定可靠。此外，maizeGDB、PANZEA等数据库不断提供和共享SSR引物，主要农作物如水稻等的基因组测序计划已经完成以及其他作物的基因组测序计划将陆续实施，生物信息学软件以及高通量分子技术的开发等都为SSR标记在品种真实性鉴定上的应用开拓了更广阔的空间。
2、水稻、玉米、棉花、小麦及等主要农作物品种真实性鉴定分子检测技术研究进展
2.2玉米品种真实性分子检测技术研究中，北京市农林科学院玉米研究中心赵久然、王风格等已经建立了SSR技术鉴定玉米品种真实性的标准实验体系，并提出了SSR核心引物理论，已构建2000多个玉米品种（或组合）和自交系标准指纹，初步形成DNA指纹库的管理和查询计算机管理系统。
2.3相对于水稻和玉米，小麦和棉花品种真实性分子检测技术的研究相对滞后，但也已取得了初步的进展。小麦已经建立部分品种的DNA指纹图谱数据库。棉花SSR引物的开发正在快速进行，仅在CMD上公布的引物已有9000多对，且仍在不断的增加中，这为利用SSR标记技术进行棉花DNA指纹图谱的构建和应用奠定了良好的基础。
张鹏，中国科学院深圳先进技术研究院转化医学研究与发展中心执行主任，师从我国著名骨科专家戴尅戎院士，主攻类风湿性关节炎发病机理和治疗。
“老药新用”，攻坚类风湿
目前，基于神经内科用药GTS-21（胆碱能受体激动剂）探讨其治疗RA的研究已经获得国家自然科学基金的支持，进展顺利。该项目是张鹏博士倡导的骨关节炎症“老药新用”策略的具体实施之一。
研究小组基于传统中药在RA治疗中的特殊疗效，从祖国医学理论出发，结合现代药理学的开发，从具有“舒筋活络，祛风除湿”的中药品种中提取若干有效成分，用于对RA疗效的观察。从临床前研究的角度，采用体外细胞及动物模型为研究对象，进行了前期实验。目前已经筛选到了若干有效的中药活性成分，推进下一步的机理研究，最终期望将有活性的成分开发成RA治疗中的疗效确切的药用品种。
本项目应用研发团队核心成员杨家安博士具有自主知识产权的“蛋白质折叠码”技术，可将复杂的蛋白空间三位信息转成具有一维结构的编码，并对药物结合靶点特性以及药物数据库进行扫描比对，具有高效准确的特点。张鹏博士主导联合杨家安博士等核心人员建立了一整套“基础研究靶点—蛋白质折叠码技术扫描分析—临床用药数据库比对筛选—生物学有效性验证”的“老药新用”研发策略体系。
据张鹏介绍，该研究策略在目前原创性化学新药研发遇到巨大挑战的大背景下，可为新药研发提供重要借鉴。“老药新用”的策略可为新药（1.6类新药）的研发提供捷径。由于“老药”已经在临床中广泛应用，在安全性上具有保障，可避免药物上市后因不良反应而“退市”的情况，同时可大大降低药物研发成本及临床用药价格，进而惠及大众。
致力转化医学，打造人才梯队
关键词：水稻（OryzasativaL.）；OsVDAC5；可溶性表达；亲和层析
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.054
在体外以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞内凝集，形成包涵体。以包涵体形式存在的蛋白质分子无定形，呈非水溶性，无生物活性，为后续研究带来诸多不便[18]。VDAC蛋白为线粒体外膜蛋白，在原核表达时由于无法形成正确的次级键，大多以包涵体形式存在。虽然可以通过包涵体蛋白变性、复性等方法获得可溶性蛋白，但蛋白质的复性效率低，得到的可溶性蛋白常常会在结构上发生改变，不利于后期进一步研究蛋白质的功能[19]。研究表明，全长的OsVDAC5基因在体外表达时以包涵体形式存在[20]，因此，本研究拟通过生物信息学分析，将OsVDAC5基因截短为可溶性肽段，构建pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）基因片段的原核表达载体进行体外表达，以获得可溶性目的蛋白，为OsVDAC5互作蛋白的研究及其在水稻生长发育过程中的生物学功能分析奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验材料原核表达载体pGEX-4T-1、大肠杆菌菌株DH5α、BL21（DE3）以及pET-32a-OsVDAC5质粒均由中南民族大学武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室提供。
1.1.2试验试剂限制性内切酶QuickCutTMBamHⅠ、QuickCutTMXhoⅠ，T4-DNA连接酶，ExTaq酶，DL15000和DL2000DNAMarker，GSTFusionProteinPurificationKit均购自Takara公司。DNA凝胶回收和清洁试剂盒均购自Axygen公司。PageRulerTMPrestainedProteinLadder购自Thermo公司。GSTTagMouseMonoclonalAntibody及二抗羊抗鼠购自Abbkine公司。超敏ECL化学发光即用型底物购自武汉博士德生物工程有限公司。引物合成及测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
1.1.3试验仪器C1000TouchThermalCycler型PCR仪和凝胶成像分析仪，购自美国Bio-RAD公司；Model1000分子杂交箱，购自美国RobbinsScientificCorporation；752N型紫外可见分光光度计，购自上海精科公司；Centrifuge5415D、5417R和5810R离心机，购自德国Eppendoff公司；CR22G型高速离心机，购自日本Hitachi公司；Soniprep150型超声破碎仪，购自日本SANYO公司；半干式碳板转移电泳槽、DYY-5型稳压稳流电泳仪和胶片观察灯，购自北京六一仪器厂。
1.2方法
1.2.2pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表达载体的构建根据OsVDAC5基因序列，以BamHⅠ和XhoⅠ作为酶切位点设计引物，以pET-32a-OsVDAC5质粒为模板，扩增目的片段。引物为Fw（5′CGCGGATCCATGAGCAAAGGCCCAGC3′）、Rv（5′CCGCTCGAGAGATTCACTATCAATCTTGACATCA3′）。采用20μL体系进行PCR反应，各反应物浓度：15.3μLddH2O，2μL10×ExTaqBuffer，1μLdNTP（2.5mmol/L），0.3μLFw（10mmol/L），0.3μLRv（10mmol/L），1μL稀释100倍的pET-32a-OsVDAC5质粒，0.1μLExTaq酶。
PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，重复34个循环；72℃延伸5min。PCR扩增反应完成后使用AxyPrepDNA清洁试剂盒对PCR产物进行清洁回收，详细操作参考试剂盒说明书，并进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ同时双酶切目的片段和pGEX-4T-1空载体，37℃酶切3～4h，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒对酶切产物进行切胶回收。用T4连接酶连接双酶切后的目的基因和pGEX-4T-1载体，16℃连接过夜并转化DH5α感受态细胞，涂LB（含Amp+）平板，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆，采用碱裂解法提取质粒，进行PCR扩增和双酶切鉴定，将对应阳性克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析。
1.2.3GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白诱导表达
2）融合蛋白的SDS-PAGE检测。将诱导表达的菌液转入10mL离心管中，5000r/min离心10min，弃上清液，向菌体中加入1mL预冷的1×PBS（pH7.4）缓冲液，缓慢用枪头吹打菌体使菌体重悬，冰水混合物中进行超声波细胞破碎，每管破碎10s，间隔10s，共破碎2～3min，收集空载体混合液。其余蛋白混合液于4℃，12000r/min离心15min，分别收集蛋白上清液。向蛋白沉淀中加入1mL蛋白沉淀变性液（10mmol/LNaH2PO4，10mmol/LTris-HCl，8mol/L尿素，pH8.0）室温放置1h，期间混匀2～3次，4℃，12000r/min离心15min，收集蛋白上清液，即为沉淀液。取出各样品200μL，加入适量的5×SDSPAGELoadingbuffer混合均匀，100℃煮沸10min，80V恒压进行12%SDS-PAGE检测。考马斯亮蓝染色液染色3h后换脱色液，进行脱色观察。
3）融合蛋白的WesternBlot检测。对15、25、37℃条件下诱导8h的蛋白上清液和沉淀液点样进行WesternBlot检测。半干式转膜仪80mA恒流转膜2.5h后，加入40mL蛋白封闭液室温封闭1h，按1∶5000的比例（V/V）向封闭液中加入GST抗体，4℃振荡过夜，第二天按1∶10000的比例（V/V）向封闭液中加入二抗羊抗鼠，孵育箱内25℃振荡孵育1.5h后进行ECL化学发光检测。
1.2.4GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白的纯化采用金斯瑞GSTFusionProteinPurificationKit对蛋白进行亲和层析。向层析柱中加入2mLGlutathioneResin悬浮液，用10mL预冷的1×PBS（pH7.4）缓冲液平衡层析柱，将3mL破碎后蛋白上清液加入层析柱，4℃缓慢振荡孵育过夜。第二天收集流出液，加入32mL预冷1×PBS（pH7.4）缓冲液洗脱未和谷胱甘肽结合的蛋白，每次加入4mL，孵育3min，收集最后一次洗脱液。最后加入7mL10mmol/L还原型GSH洗脱柱子上的蛋白，每次加入1mL，孵育5min，收集洗脱液。取出各样品100μL，加入适量的5×SDSPAGELoadingbuffer混合均匀，100℃煮沸10min，80V恒压进行12%SDS-PAGE检测。考马斯亮蓝染色液染色3h后换脱色液，进行脱色观察。
2结果与分析
2.1OsVDAC5跨膜结构预测
前期构建了全长OsVDAC5基因原核表达载体，但是表达的蛋白以包涵体的形式存在，因此本研究利用生物信息学软件预测了OsVDAC5的跨膜方式，将PRED-TMBB和BOCTOPUS这两个专门预测蛋白质二级结构中β折叠结构的生物学软件的预测结果进行对比（图1）。预测结果表明，OsVDAC5在线粒体外膜上可能分别以十二次跨膜（PRED-TMBB）或十八次跨膜（BOCTOPUS）的结构存在，而且OsVDAC5蛋白的N端和C端有可能均位于线粒体双层膜之间的膜间隙内。因此，仅保留OsVDAC5蛋白75个氨基酸残基，构建只含N端75个氨基酸的pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表达载体。
2.2pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表达载体的构建
PCR扩增鉴定pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）重组质粒，检测到目的基因的大小为250bp。利用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒，检测到大小为5000、250bp的两个条带，与预期的条带大小相同。将构建好的载体测序，测序结果100%匹配，表明pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表达载体构建成功（图2）。
2.3SDS-PAGE检测GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白诱导表达
将阳性重组质粒热激转化BL21表达菌株，经过IPTG诱导后，用12%SDS-PAGE检测表达产物，经过考马斯亮蓝染色，可观察到在10、15、25、37℃诱导表达条件下，4、6、8h时在35kDa的上清液和沉淀中均有蛋白表达，其大小与预测的GST-OsVDAC5（1-75aa）的蛋白产物大小相同，且不同温度在8h时蛋白的表达量较4、6h高，15℃时上清液中的表达量较沉淀高。结果表明，OsVDAC5（1-75aa）基因在pGEX-4T-1系统中得到了高效表达，其表达产物为部分可溶性蛋白（图3）。
2.4Westernblot检测GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白诱导表达
用GST单抗对10、15、25、37℃诱导表达条件下诱导8h的蛋白进行Westernblot检测，IPTG诱导后的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白在35kDa左右处的上清液和沉淀中均出现单一的信号条带，而未加IPTG诱导的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）和空载体蛋白样品在35kDa左右处未见表达（图4）。此结果进一步表明pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）载体构建成功，且GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白可在上清液中高效表达。
2.5GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白的纯化
GST融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价亲和，利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶（GST）之间酶和底物的特异性作用力，使得带GST标签的GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白能够与凝胶上的谷胱甘肽结合，从而将该蛋白与其他蛋白分离开。由于GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白在上清液中高效表达，因此通过10mmol/L还原型GSH洗脱后进行SDS-PAGE检测，在35kDa处可观察到较为单一的蛋白条带，得到纯化的可溶性GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白（图5）。
3小结与讨论
在植物中VDACs高度保守，但对不同VDAC的特定功能知之甚少。OsVDAC5互作蛋白的研究对揭示OsVDAC5蛋白的功能有重要意义。同时，进行体外Pull-down试验时通常需要可溶性的VDAC蛋白。因此，获得外源表达的可溶性蛋白至关重要。
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关键词：高性能计算；应用；中医药
Abstract：Highperformancecomputing（HPC），asanewandimportantresearchtool，hasbeenappliedinmanyfieldssuccessfully.ApplicationofHPCintheTCMfieldisstillintheexploratorystage.HPCinthefuturemaybeinnovativelyappliedinthefieldofgenomicsChineseherbalmedicine，virtualmedicinescreeningofnewTCM，TCMdataminingandbigdataanalytics，modelingandsimulationandsoon.
Keywords：highperformancecomputing（HPC）；application；TCM
科学计算作为科研方法变革的产物，已经发展成为与传统的理论、实验并驾齐驱的第三种科研方法，并且日益成为越来越重要的科研方法。科学计算方法的运用，是高性能计算应用的基础和前提条件，而使高性能计算真正发挥作用主要取决于高性能计算的应用研究水平[1]。本文对于促进高性能计算未来在中医药领域的应用、丰富中医药信息学的研究内容及由此产生的中医药科研方法的创新具有推动作用。
1高性能计算应用概况
1.1我国在高性能计算应用领域仍处于落后水平
在高性能计算的研发和应用领域美国一直处于世界领先水平，日本和欧洲国家紧随其后长期位居世界先进行列。近年来，我国在高性能计算硬件的研发方面取得了突破性进展，通过自主创新逐步掌握了一批硬件研发的关键技术。中国国防科技大学研制的天河系列超级计算机连续多次在世界超级计算机排行榜中名列首位，标志着我国高性能计算的硬件研究水平目前已经接近国际先进水平。但在应用软件方面的发展严重滞后于硬件的发展水平，自主开发的高性能计算应用软件严重匮乏，需要大量购买和引进国外开发的应用软件，重要和关键部门的应用受制于人[2]。应用软件是高性能计算应用的基础，由于应用软件研发水平的严重落后，目前我国在高性能计算应用领域仍处于落后水平。
1.2国内外高性能计算主要的应用领域
高性能计算作为崭新和重要的科研工具，目前已经在众多的领域得到了成功应用，各种前沿科学研究、技术开发和工程设计都越来越多地使用了高性能计算，高性能计算已经日益成为科技创新的重要力量。目前主要的应用领域包括气象数值模拟与预报、地震预报、纳米技术、生物医学、环境科学、空间科学、材料科学、计算物理、计算化学、流体力学、地震三维成像、石油勘探、天体星系模拟、大气与海洋模拟、固体地球模拟、工业设计、核武器研究、全球气候模型、湍流分析、飞行动力学、海洋环流、流体力学和超导模型等[1]。在生物医学领域的应用目前主要集中在人类基因组学、蛋白质组学、药物设计、分子动力学模拟等方面。
1.3高性能计算应用的瓶颈
高性能计算虽然已经在众多领域得到了成功应用，但由于技术难度等的限制，仍然属于高投入高产出的非普及型应用。目前制约高性能计算应用的主要问题包括软件开发的技术难度非常大，系统使用成本过高，不仅体现在软硬件购置费用昂贵，而且系统运行维护成本过高，大型系统的年电费需上千万元[2]。比较高精尖的应用范围、非常高的技术要求和过高的使用成本，这些都限制了高性能计算的广泛应用。
2高性能计算在中医药领域应用的可行性分析
2.1高性能计算在领域应用的前提条件
高性能计算在领域应用的条件首先需要应用领域具有较高的科研水平，特别是能够通过科学计算的方法建立相应的数学物理模型和应用软件来解决实际问题，利用高性能计算才有可能促成应用领域研究水平的大幅度提高。通过对高性能计算应用领域的最高学术奖戈登奖获奖项目的分析，这些获奖的应用项目绝大多数都具有多学科交叉融合的背景，这反映了高性能计算的应用需要应用领域与计算机科学、数学等学科的跨学科合作[3]。随着高性能计算的应用，近些年高性能计算与应用学科的交叉学科不断涌现，产生了计算化学、计算物理学、计算生物学等许多新兴学科，这些交叉学科的产生标志着高性能计算在这些领域得到了高水平应用。
2.2计算生物学的启示
计算生物学是一门以生命科学中的现象和规律作为研究对象，以解决生物学问题为最终目标，通过模拟和仿真的方法对生物学问题进行定量和定性研究的新兴学科。计算生物学与生物信息学比较，最大的不同之处在于生物信息学侧重于生物信息的采集、存储、处理和分析，而计算生物学侧重于对生命现象进行研究、解决生物学问题[4]。目前计算生物学领域的研究主要集中在蛋白质行为的模拟、药物分子的筛选、基因测序等方面。
虽然目前中医药领域还不满足高性能计算的应用条件，但通过借鉴计算生物学的研究方法，未来有可能在中医药领域开展具有创新性的高性能计算的应用研究。
3高性能计算在中医药领域应用的展望
3.1中药植物药的基因组学
基因组学是遗传学的一个分支，研究生物基因组和如何利用基因，涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析，研究内容包括以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学。基因组学是高性能计算应用的一个重要方向，没有高性能计算人类的基因组计划就不可能实现，高性能计算已经成为基因组学研究不可或缺的科研工具。随着基因组学研究的深入、技术的成熟和成本的大幅度下降，使得基因组学的研究逐渐由人类的基因组学扩展到动物、植物等多个相近领域。利用高性能计算在基因组学方面成熟的应用软件开展中药植物药的基因组学研究未来有可能是高性能计算在中医药领域的重要应用。
3.2中药新药的虚拟药物筛选
利用高性能计算进行虚拟药物筛选目前已经成为西药新药开发的一条崭新和重要的途径。新药研发的核心工作之一是从大量的化合物样品库中发现有药理活性的化合物，计算机虚拟筛选辅助新药开发是利用统计学和分子模型化技术来指导新的先导结构的发现或设计，从而减少实验室的工作量，缩短开发周期、降低开发成本。近年来对多靶点药物的研究已经成为国际上新药开发的一个重要的研究热点，中药是天然的多靶点药物，蕴含着巨大的新药创制的潜力[5-6]。应用高性能计算开展中药新药的虚拟药物筛选有可能成为中药新药开发的崭新途径。
3.3中医药数据挖掘和大数据分析
数据挖掘是从大量的、不完全的、有噪声的、模糊的、随机的实际应用数据中，提取隐含在其中的、人们事先不知道的、但又是潜在有用的信息和知识的过程。大数据分析是指对规模巨大的数据进行分析，目前世界各国对大数据分析技术高度重视，大数据被视为国家重要的战略资源。数据挖掘和大数据分析是高性能计算应用的重要领域之一。目前中医药领域的数据挖掘和大数据分析主要集中在对方剂配伍规律、中医证治规律等的研究，现有的研究水平还不能构成对高性能计算的迫切需求。随着数据挖掘和大数据分析在中医药领域应用水平的提高，数据研究的内容、方法和结果的日趋丰富，随着数据量的积累和研究方法复杂度的提高，中医药数据挖掘和大数据分析未来有可能成为高性能计算在中医药领域富有潜力的应用。
3.4模拟与仿真
计算机模拟方法在生命科学中已经得到了迅速的发展和广泛的应用。高性能计算应用领域的最高学术奖戈登奖获奖项目“在20万CPU核和异构体系结构上的千万亿次持续性能血流模拟”，该项目模拟了血液流动状态，可以辅助血栓的早期病理学诊断及抗血栓药物的研究。另一项获奖项目“呼之欲出的猫：包含109规模神经元、1013规模突触的大脑皮质模拟”，对神经元和突触规模与猫大脑相当的大脑皮质功能进行了模拟，并以此为基础开展了认知计算的研究[3]。此外国内外大量的高性能计算被用于分子动力学模拟，分子动力学模拟是一种数值模拟方法，通过将分子抽象为由化学键连接的质点按照基于牛顿力学的数学模型迭代求解分子体系的行为。利用高性能计算进行分子动力学模拟已经成为化学和生物学研究中与实验手段相当的标准研究方式[7-8]。模拟和仿真技术在中医药研究中的应用未来有可能成为高性能计算在中医药领域创新性的应用。
4小结
高性能计算的应用是使高性能计算真正发挥作用的软实力，是高性能计算领域重要的研究内容。高性能计算的应用需要多学科的交叉与合作，计算生物学的产生标志着高性能计算在生物医学领域得到了成功应用。
高性能计算在中医药领域的应用目前还处于探索阶段，尚不具备大规模应用的条件和基础。未来有可能通过借鉴计算生物学的研究方法在中药植物药的基因组学、中药新药的虚拟药物筛选、中医药数据挖掘和大数据分析、模拟与仿真等领域进行开创性的应用研究。高性能计算在中医药领域的应用将会对中医药科研方法的创新与发展产生深刻的影响。
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关键词：统计遗传学；在线开放课程；创新人才
随着科技竞争的日趋激烈和人才国际化程度的不断加快，我国拔尖人才日益紧缺。当前高等教育工作的根本问题是人才培养质量问题，其核心是学生创新精神和创新能力的培养。建立拔尖创新人才培养的有效机制，促进创新人才脱颖而出，促进高校探索创新型人才培养的新模式，促进高校探索并建立以问题和课题为核心的教学模式，倡导以学生为主体的本科人才培养和研究型教学人才改革，调动学生的学习积极性、主动性和创造性，激发学生的创新思维和创新意识，是建设创新型国家，实现中华民族伟大复兴的历史要求，也是当前对教育改革的迫切要求。
一、统计遗传学在线开放课程建设的必要性和重要性
二、统计遗传学在线开放课程建设的主要平台
（一）统计遗传学在线开放课程的资源库平台建设
（二）统计遗传学在线开放课程的学生测试平台建设
建设统计遗传学在线开放课程的学生测试平台，调用数据集库中的数据，应用学到的统计遗传学知识解决实际问题，通过理论和实验的方式进行测试，考核学生对基本理论知识的掌握程度，及时发现问题，弥补知识欠缺。使统计遗传学在线开放课程在教学中得到很好的实践应用。
（三）统计遗传学在线开放课程的实践与创新平台建设
建设统计遗传学在线开放课程的实践与创新平台，定期留一些具体分析实例的题目，让学生自由分组，开展自主探究活动，各组自行设计方案，最后对应的各个题目进行分组汇报，激发学生的主动探究精神，培养团队精神，提高学生的创新和实践能力。
三、统计遗传学在线开放课程建设具体思路及实施方案
（一）组建团队建设统计遗传学在线开放课程资源库
（二）组建统计遗传学在线开放课程技术团队
为了取得更好的统计遗传学在线开放课程设计效果，聘请专业人员给课题组人员进行视频录制、页面设计等方面的技术培训。让统计遗传学在线开放课程平台更具特色、更吸引人眼球。同时对课程内容及环节进行整体设计，使其内容丰富、精彩、精练，知识体系衔接紧密、结构合理，提高课程吸引力和授课效果，给人一种耳目一新的感觉，激发学生的学习兴趣。
（三）建立统计遗传学在线开放课程的实践与创新平台
关键词：分子生物学；植物抗性基因；基因组
1植物抗性基因研究现状
1.1植物自身抗性基因以等位基因系和基因簇形式存在
经典遗传学研究表明，在不同植物品系的同一基因位点上可能具有等位基因，这些等位基因对各种病原具有不同的特异性。此外，抗性基因往往在某一特定区域成簇存在。事实上，在特定的染色体区域常常不能分辨抗性基因位点上真正的等位基因和有关联的成簇基因。利用具有不同抗性基因的植物进行杂交可以澄清这一问题。
1.2植物抗性基因的作用机制
1.3植物抗性基因克隆
植物抗性基因的克隆目前主要采用转座子标记和定位克隆的方法，迄今为止，用这2种方法已克隆出22种抗性基因，其中用定位克隆方法得到16种，用转座子标记法得到6种。最近，有人又提出利用抗性基因类似序列（resistancegeneanalogs）通过PCR来特异扩增抗性基因的方法。
1.4转基因改良植物胁迫耐性的困难及改进措施
尽管转基因改良植物胁迫耐性已取得一些进展，目前仍存在以下困难：目的产物表达量不够或时空表达不协调；目的产物翻译后修饰（加工或折叠）不适当，影响功能表达；目的酶所催化的代谢反应前体物质不足；细胞内目的酶活性受制于pH、温度及盐离子浓度等因素；有些目的表达产物对宿主细胞产生毒副作用等。进一步改进措施有以下几方面：①选用来自近缘物种的目的基因；②构建高效表达体系；③表达产物的胞内区域化；④增加目的酶催化的前体物质含量；⑤目的产物翻译后修饰的调控；⑥抑制目的产物的副效应。
2植物抗性基因研究趋势
基因组学（Genomics）的出现，使生物学研究进入一个新的时期，即由仅对一个基因的研究转向在基因组规模上同时对大量基因的结构和功能进行系统的研究。无论从思想上还是技术方法上，基因组学已经影响生命科学的各个领域，植物的抗逆性研究也不例外。利用基因组学的方法，不但可以挖掘大量的抗性基因，对其功能进行详细的研究，而且有助于全面理解植物的抗逆机理，为利用遗传工程提高植物抗性提供基础。
3展望
我们正经历一个快速发展的阶段，与几年前相比，已有许多那时想都不敢想的工具与能力。目前已开始从单个抗性基因的鉴定克隆转移到抗性基因表型的全面分析。可以预测，在不久的将来，不用通过实验鉴定，我们在计算机上通过序列比较和功能模拟分析，就能预测新克隆的抗性基因的功能。大规模的新方法、新技术的应用，将为我们获取新抗性基因并使之变成可操作利用提供机会。
1阎隆飞，张玉麟.分子生物学[M].中国农业大学出版社，1997
【摘要】抗生素的大量使用和滥用所造成的细菌广泛的耐药性迫使科研人员要加速寻找结构新颖的抗生素。抗生素作用靶点的发掘对药物发现非常重要，本文综述了近几年来国际上运用基因组学、基因芯片等现代生物信息学技术，利用细菌体内的各种酶反应与理化特性，发掘抗生素传统作用新靶点如脂肪酸合成酶、非传统作用新靶点如双信号转导调控系统、群体感应器等的研究进展，这对新抗生素的发现具有一定的指导意义。
【关键词】抗生素；新靶点；耐药性；基因组学
ABSTRACTWidespreadbacterialdrugresistanceoriginatedfrommassiveusesandabusesofantibioticsdrivesdrugdiscoveryinaremarkablespeedpath.Atthesametime，findingfunctionaltargetofantibioticswasextremelyimportanttothedrugevaluation.Noveltargetscanbefoundthroughmodernbiologicalinformationtechnologysuchasgenechiptechniqueandgenomics，alongwithbacterialenzymaticreactionsinvivoandthephysiologicalcharacteristics.Inthispaper，wesummarizedsomenovelantibiotictargetsfromtraditionalbacterialfunctionalityandnontraditionaldomainsintheselastfewyears，includingfattyacidsynthases，two-componentsignaltransductionsystemsandquorum-sensingsystems.Thesenewresearchprogressesonnoveltargetswillbeapositivestrengthinnovelantibioticdiscovery.
KEYWORDSAntibiotics;Noveltarget;Drugresistance;Genomics
1941年人类首次实现青霉素的工业生产，启动了抗生素应用的历史。随后30多年的研究先后发现了β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类和多肽类、多烯类等几大类抗生素，并成功地应用于治疗各种病原微生物感染。科学界一度乐观地认为，持续不断地发现新抗生素药物将最终使人们彻底摆脱感染性疾病。然而，随后的40年，尽管药物研究的投入越来越大，却很少有新碳骨架化合物作为临床药物得以开发。近些年来，由于过度使用抗生素，特别是滥用抗生素，病原菌日益广泛的耐药性已成为药物治疗中越来越常见的问题［1～3］，人们迫切需要寻找新的抗生素药物。
为了克服细菌的耐药性，特别是多重耐药性问题，人们需要运用新的思路去发掘新的抗生素。20世纪90年代以来，随着基因组学、蛋白组学和生物信息学的迅猛发展，人们获得了丰富的基因信息与数据，阐明了上千个蛋白新靶点。一些影响细菌生长和致病的关键基因的发现以及以此为靶点的相应筛选模型的构建是发现抗耐药细菌的新抗生素的关键。本文综述了近年来科学家们发掘抗生素作用新靶点所采取的方法、主要靶点类型和有关作用机制。
1运用基因组学来开发抗生素新靶点
1.1寻找细菌致病开放阅读框
为成功研发新药，人们不断运用各种手段来筛选抗菌药物作用靶点［4］，一般首先考虑以下三个筛选标准：①运用生物信息学寻找所有潜在药物靶细菌体内保守的开放阅读框(ORFs)；②发现一些只在原核细胞中出现，而不在真核细胞特别是高等真核细胞中出现的ORFs；③运用药物靶细菌体内功能基因敲除技术来验证这些ORFs是否决定了一个或多个病原菌的致病力。符合以上三个筛选标准的基因就是最佳的备选靶标基因。
Rosamond等［5］通过30多个微生物基因组的生物信息学分析寻找到了多个药物作用靶点，这些靶点影响微生物的生存与繁殖，在病原菌中高度保守，而在人体内或者完全缺失，或者截然不同。他们将大肠埃希菌的4289个基因与七种呼吸道疾病致病菌(包括铜绿假单胞菌、流感嗜血菌和肺炎链球菌等)的基因组进行比对，发现所有这些细菌中都有246个基因高度保守，其中68个基因人类缺失；经进一步比对发现，这68个基因中有34个功能未知，其中16个是非关键基因，另外18个则特别重要，包括喹诺酮和大环内酯抗生素的作用靶点。他们选择这18个基因中的3个作为靶点基因用于药物筛选，寻找治疗呼吸道疾病的新药，取得了很好的结果［5］。
1.2确定关键基因的功能
采用各种遗传变异方法确定未知保守基因的功能，如热敏变异、碱基标记诱变、反义RNA系统表达以及功能基因敲除等方法［6］，以及鉴定蛋白质性质，确定其是否具有用于药物筛选的潜力。
日本研究者从临床分离到耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素金葡菌Mu50(VRSA)［7］，它们有70多个代表基因(总共2600个基因)与新的毒性因子有关，这些毒性因子能增强耐药菌株对人的致病力，当然也是更为广泛的潜在抗生素靶点。
1.3阐明关键基因产物的功能
有研究者采用高通量基因组结构分析方法［8］阐明蛋白质X衍射结构，根据结构将它们进行分类，在一级结构基础上进行折叠，考察二级结构，并预测三级结构与功能。也有人使用细菌基因芯片或基因表达图谱［9］，评价不同条件下的mRNAs表达水平。通过不同浓度抗生素的作用，挑选出最敏感的基因。例如，在含有97%结核分枝杆菌基因的基因芯片上添加抗结核药物，测试药物对结核分枝杆菌基因表达的影响，了解关键基因产物的生物学功能。
1.4通过基因体内表达确定靶标基因
作为基因学方法的补充，确定关键基因后，一般还要通过实验来确定病原菌感染脊椎动物的必需基因，因为有时细菌在培养皿中生长的非必需基因可能是感染动物和人的关键基因。基因如何在体内表达和哪些基因是细菌致病所必需的，一般都要通过体内表达来确定［10］，细菌的基因虽然很多，但在感染动物时只打开特定基因来实现自我生存和繁殖，例如有的基因负责启动生物合成和指导铁离子螯合剂的重新摄取，因为所有脊椎动物宿主的胞内或胞外运铁蛋白上都螯合铁离子。除此之外还需考察筛选得到的抗生素在临床上是否真正有效，以及耐药菌株出现的速率是否降低。总之，通过对细菌基因组的深入研究，可以发现新的药物作用靶点，使药物更特异地作用于特定的位点。
2对某些典型靶点的重新发掘
随着基因组研究和对微生物细胞结构与分子机制认识的深入，新靶点不断涌现，为抗生素的研发提供了新的途径，使我们可以深入研究复合靶标的不同部位，以增强筛选的特异性，减少过筛量，提高筛选效率。在细胞壁生物合成、蛋白质生物合成和DNA复制与修复过程的传统药物靶点中还是有希望找到一些新靶点，这引起了研究者们的高度兴趣。
2.1抑制细胞壁生物合成的新靶点
细菌细胞壁生物合成，尤其是肽聚糖(PG)的合成是第一类天然化合物筛选靶点，也是传统抗菌药物最早的靶点之一，对这类靶点的合成途径和抗生素作用机制的研究比较透彻。那么，针对抑制细胞壁和细胞膜合成是否还存在新的靶点？这里展示几个具有开发价值的研究实例。
(1)葡萄球菌糖肽酶在葡萄球菌PG层的生物合成中，肽链之间不是通过Lys3和D-Ala4直接相连，而是通过五甘氨酸桥联［11］。主要的表面抗原蛋白、S.pyogenes的蛋白M、咽炎与皮肤损伤的致病因子和金葡菌的蛋白A都是通过一段保守的C端四肽(LPXT)和五甘氨酸桥共价相连。由于五甘氨酸是在fem基因指导下加入的，所以fem基因可以成为辅助药物靶点基因，阻断糖肽酶的作用，有望成为降低链球菌感染致毒的好方法。生物信息学分析表明，革兰阳性菌基因组中除了fem基因外，还有多个糖肽酶基因。糖肽酶结构阐明后，加快了基于结构的药物设计技术的发展步伐［12］。
(2)糖基转移酶多年来人们一直认为糖基转移酶在二糖酰五肽单元聚合到PG链上起着关键作用，但由于缺乏实验底物，膜的性质又不是很清楚，分离纯化和结构表征比较困难［13］，没能对之进行系统研究。基因序列分析表明，大肠埃希菌中有4种糖基转移酶，而且在初级病原菌中数量众多，有的是糖基转移/转肽复合酶，有的则是单功能糖基转移酶。
Ye等［14］采用酶联化学法，利用I型脂的类似物和糖基转移酶MurG作用，获得多种脂-二糖酰-五肽II型脂的类似物，并进行关于膜的糖基转移酶实验。如果能够合成出较大的碳水化合物库［15］，就能找到抑制糖基转移酶的特异性配体化合物。半合成的N-芳酰衍生物(如N-氯二苯-万古霉素和N-chlorebiphenyl-chloroeremomycin)对VRE菌的活性要比它们的糖肽类母体强80倍左右。由于这些N-芳酰糖肽类与N-酰基-D-Ala-D-Lac结合的强度没有万古霉素或Chloroeremomycin的牢固，有人认为，N-芳酰糖肽类进攻的是糖基转移酶［16］。
2.2抑制蛋白质合成的新靶点
在第二类传统抗菌药物靶点即蛋白质合成抑制药物的靶点中，我们也有机会发现新的抗生素靶点。这方面的研究以Belova等［17］和Huntington等［18］的工作比较突出，其中肽脱甲酰酶已经成为用于新药临床实验的少数几种抗菌靶点之一。
(1)核糖体作为抗生素的靶点抗生素一般结合的是16S或23SrRNA分子中的关键位点。23SrRNA第五结构域包含了从肽酰转移酶活性位点到初生肽链［19］的转运出口肽酰转移酶中心，还包含红霉素(erythromycin)和泰洛星(tylosin)的结合位点［20］。第五结构域还与其他抗生素如链阳菌素(streptogramin)和林肯酰氨克林霉素(lincosamideclindamycin)等的结合位点有部分重叠，所以在研究结构时可能找到与RNA中一个或多个亚基结合的新抗生素。
天然产物晚霉素(eveninomycin)的靶位也是非典型核糖体结合位点［18］。晚霉素是一种两端结合着酚酰羧基酯的糖，与23SrRNA的89号和91号螺环结合，阻止起始因子IF2蛋白与之结合，终止起始氨基酸fMettRNA的转运。
以硫链丝菌素(thiostrepton)、诺西肽(nosiheptide)和GE2270A为代表的天然抗生素硫蛋白族［21］通过阻断一种核糖体伴侣蛋白而抑制蛋白质生物合成。硫链丝菌素和诺西肽攻击23SrRNA的A1087结构域，同时阻断延长因子EF-G在肽酰转移酶位点与核糖体的结合。GE2270A通过攻击GTP酶EF-Tu因子来阻断核糖体的肽酰转移反应。从这个基础上研究EF-Tu的结构对抗生素的结构与性能优化是非常有意义的。
(2)肽脱甲酰酶与甲硫氨酸氨肽酶细菌在起始因子IF2的作用下，以fMettRNA作为起始氨酰tRNA开始蛋白质的生物合成。甲硫氨酰的N-甲酰化保证fMet在肽链形成时作为电子供体而非受体，加强了合成起始的方向性。当延长肽链出现在核糖体上时，肽脱甲酰酶(deformylase)酶解掉其N-甲酰基［18］，然后甲硫氨酸氨肽酶(methionineaminopeptidase)水解脱去甲硫氨酸的N端。通过大肠埃希菌的基因敲除分析，认为肽脱甲酰酶和甲硫氨酸氨肽酶是蛋白质合成所必需的，所以它们可以作为抗菌剂的有效靶标。肽脱甲酰酶是一种金属蛋白酶(metallopeptidase)，可被具有金属螯合作用的配体［22］譬如天然的二肽酰-羟氨酸-放线酰胺素(dipeptidylhydroxamateactinonin)中的羟氨酸所抑制。这些化合物常用作细菌抑制剂而非杀菌剂，虽然可以降低变种的适应性，但变种出现的频率仍然较快，所以寻找更广谱长效的肽脱甲酰酶抑制剂将成为研究目标。
(3)氨酰-tRNA合成酶天然产物莫匹罗星(mupirocin)能通过抑制Ile-tRNA合成酶的作用使异亮氨酸不能参与蛋白质合成。莫匹罗星与金葡菌的Il-tRNA合成酶的复合物的分子结构已经阐明［23］，证明它与活性位点配位，并与Ile-AMP相互竞争。对其他细菌和真核生物tRNA合成酶进行筛选，发现有的化合物对纯化的tRNA合成酶具有一定活性，目前暂时还没有发现具有临床价值的类似物，但仍然不失为一个有潜力的靶标。
2.3DNA复制与修复的新靶点
DNA是生物的遗传物质，具有稳定、多样和自我复制的特点。DNA的双螺旋结构和半保留复制保证了DNA在进行准确地复制时，将遗传物质正确地传给下一代，同时保持核酸链的完整性。DNA实现其功能时需要一系列酶参与反应，包括DNA回旋酶。DNA回旋酶是细菌特有的一种拓扑异构酶，其抑制剂在临床上的应用也越来越广。
(1)DNA回旋酶：新喹诺酮和非喹诺酮的作用靶点DNA回旋酶是喹诺酮抗菌剂的典型靶点，也是新喹诺酮分子的作用靶点。新喹诺酮分子层出不穷，包括群体获得性肺炎中抗青霉素肺炎链球菌的抑制物左氧氟沙星(levofloxacin)等。曲伐沙星(trovafloxacin)在1998年获批，但因为肝脏毒性而限制临床使用。8-甲氧基喹诺酮莫西沙星(moxifloxacin)和加替沙星(gatifloxacin)在1999年获批，它们抗葡萄球菌活性大大增强，可以用于治疗群体获得性肺炎、支气管炎和鼻窦炎［24］。各种含有桥头N，具有2-吡喏酮环系统的喹诺酮对抗喹诺酮的变异回旋酶仍然具有抑制活性。据报道，克林沙星(clinafloxacin)和西他沙星(sitafloxacin)对回旋转亚基GyrA和拓扑异构酶第Ⅳ结构域ParC的突变型均具有抑制活性［25］。
(2)RNA解旋酶在RNA的代谢动力过程中，RNA与DNA、RNA与RNA、RNA与蛋白质之间能形成并且必须形成具有特异性和较高动力学效率的过渡态复合物。一定长度或全长RNA经过折叠、展开和重新折叠，才能实现其生物功能。能将RNA分子展开的酶称为RNA解旋酶(helicase)［26］，它利用NTP水解释放的能量来驱动譬如双链RNA的展开。RNA解旋酶有时作用于原核生物的基因转录、核糖体生物合成、翻译起始和RNA降解等过程，有时也作用于真核生物的mRNA编辑、拼接和RNA向细胞质的转运。分析认为，既然RNA解旋酶是细菌功能所必需的，那么它可以成为抑制物的作用靶标。
3其他非传统的抗生素作用新靶点
前面提到某些新靶点是通过基因组学方法寻找，或从传统靶点中发掘的，除此之外，细菌的酶系反应和生理过程也可作为抗生素的靶点［27］。目前已发现几百个新靶点，通过一系列高通量和自动化的筛选实验以及对同簇基因产物的复杂性分析(如某些基因产物在动物体内是毒性因子，在培养基上却不能产生)，可以确定其功能并用于药物筛选。以下介绍几个比较典型的非传统靶点。
3.1脂肪酸合成酶
脂肪酸的合成对细菌的生存与发育至关重要。研究结果表明，在I、II构型亚基中的脂肪酸的合成与聚酮类天然产物的生物合成途径非常相似。在真核细胞中的I型酶系中，脂肪酸合成酶(FASs)由多个亚基组成，而大多数细菌的II型酶系中FASs则为单个亚基，找到特异性抑制物是完全可能的。具有抑制FASs活性的天然产物浅蓝菌素(cerulenin)，通过烷基化作用使FASs中的酮基合成酶经过环氧化物的开环而造成亲核性Cys活性位点失活。选择性更高的抑制物对细菌酮基合成酶会更有效。
最近，有人发现三氯森(triclosan)类抗菌防腐剂可阻断大肠埃希菌烯酰-ACP还原酶FabI催化脂肪酸合成酶的烯键饱和作用，这说明FASs是较好的靶点。
3.2异柠檬酸裂解酶
3.3双信号转导调控系统
细菌通常使用双信号转导系统(two-componentsignaltransductionsystem)来感受体外瞬时化学变化(图1)，其中两个蛋白分别作为感受器(sensor)和响应控制器(responseregulator)［29］。感受器是一种典型的跨膜组氨酸激酶，响应控制器是一种DNA转录激活子(activator)。感受器的细胞周质环型蛋白和跨膜蛋白感受到配体后，引起感受器胞质组氨酸激酶结构域中组氨酸活性位点的自磷酸化，然后磷酸官能团从P-His转移到响应控制器氨基酸亚基上的一段保守的Asp-β-羧基上。响应控制器P-Asp的形成会引发DNA作用域的变构效应，然后激活子阻遏目标基因的转录(假如它的基态是阻遏物)并启动响应程序。
VRE菌的VanS-VanR双信号转导系统是一个典型的感受/传导系统，双信号转导系统对细菌毒性起
图1
双信号转导系统示意图(根据文献［30］重绘)
决定作用。有人使用基因组学的方法来表征肺炎链球菌的双信号转导系统，并检测到14个双信号基因对［30］。如果金葡菌体内双信号转导srhS-srhR基因对遭到破坏，将导致大鼠肾盂肾炎(pyelonephritis)模型中金葡菌突变株的生长降低1000倍。mRNA序列分析表明双信号基因对关系到病原菌的生长能力，特别是当病原菌从氧浓度低的环境转向厌氧代谢时。金葡菌兼性厌氧的特征，使得它能进入深层组织进行持续的感染。这些结果为分析8对双信号感受/传导基因在致病机制中的特殊作用提供了基础，包括黏附和自融过程等等，并能帮助我们优选出最佳的双信号基因对作为抗菌靶标。
3.4群体感应器的生物合成
细菌使用群体感应系统(quorum-sensingsystems)来感受群体的密度，做出基因介导的信号响应并产生毒性因子，包括抗生素。金葡菌的agr基因座构成了全面毒性响应的一个方面。如图2所示，由5个基因组成的agr操纵子指导合成的AgrC和AgrA蛋白，分别是跨膜感受激酶和响应控制器［31］。AgrB是一个多肽输出泵，作用于蛋白水解过程和自诱导肽(AIP)的成熟前体肽(agrD基因产物)的分泌。蛋白水解和分泌后，AIP就成为了AgrC的外来配体，开启发育细胞和临近发育细胞agr基因座的进一步转录。密度依赖型群体感应作用是由AIP分泌浓度及其特异受体AgrC的多少来决定。
当细菌群聚生长为生物膜，譬如在住院患者的各种导管内，群体感应系统就会成为细菌形态和信号转导的决定因素。在这种情况下，使用抗生素都难以控制细菌，因为此时细菌多糖被膜的渗透性极差［32］。所以，更直接有效的抑制作用就是阻断群体感应器(quorum
图2
金葡菌的群体感应系统(根据文献［32］重绘)sensor)的生物合成，一些信号分子可激发生物膜的形成。如果一个多肽起信号分子作用，那么它就是产生自诱导前体肽的AgrD酶，或具有AgrB输出泵的蛋白酶活性。一般情况下，革兰阳性菌以酰基高丝氨酸(acylhomoserine)［33］内酯为细胞间群体信号感应分子，所以可将LuxI族合成酶作为靶标。Pseudomonasstewartii内酯合成酶的X衍射结构已经阐明，为药物的结构设计提供了好的开端。
3.5外排泵作为靶点
为降低氟喹诺酮(fluoroquinolone)的外排，有人针对铜绿假单胞菌的MexA-MexB-OprM、MerC-MexD-OprJ和MexE-MexF-OprN外排泵(effluxpump)系统和大肠埃希菌的AcrA-AcrB-TolC外排泵，开展了外排泵阻遏剂的筛选。能阻遏外排泵的抑制物，可以降低细菌的内源性耐药和获得性耐药，也可以降低回旋酶耐药变种出现的速率［34］。植物天然产物5′-甲氧基大风子素D(methoxyhydncarpinD)就是这种具有阻断氟喹诺酮泵出的活性阻遏物［35］，由于改变了外排泵的结构而引起功能与活性的变化。类似地，四环素的结构修饰物氯丙硫(chloropropylthio)四环素，可以阻遏Tet外排泵蛋白。新出现的甘氨酰四环素(glycylcycline)也是Tet外排泵蛋白阻遏物，它们甚至对具有核糖体保护蛋白因子TetM和TetO的菌株都有抑制活性［36］。同样我们还可以开发出其他抗生素外排泵阻遏物。
4展望
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