卜丹丹1,2，余丽波1,2，白雅欣1,2，杨昭颖1,2，董静1,2，余洋1,2，陈冬东1，彭涛1,*
（1.中国检验检疫科学研究院，北京100176；2.中检科（北京）测试认证有限公司，北京100176）
关键词：肉制品；亚硝酸盐；稳健统计；能力验证
亚硝酸盐一般指亚硝酸钠，为白色至淡黄色粉末或颗粒，味微咸，易溶于水，因其性质和作用机理，现被广泛用作肉制品的发色剂和防腐剂，能够保持肉制品的色、香、味，可抑制脂质氧化，起到抑菌作用[1-2]。如长期食用亚硝酸盐含量超标食物，将会诱发消化系统癌症[3-4]。若人体摄入过量的亚硝酸盐，将会使血液中的Fe2+氧化为Fe3+，使得血红蛋白转化为高铁血红蛋白，从而造成血液的携氧能力快速下降，令血液不能正常地运送氧气，严重时会导致脑部缺氧，甚至死亡[5-7]。摄入0.3～0.5g亚硝酸盐即可引起中毒，3g将导致死亡[8]。使用亚硝酸盐作为发色剂时，亚硝酸盐与肉中的胺反应生成亚硝基化合物，或在肠道的酸性环境下转化为亚硝胺[9-10]，这些亚硝基化合物均是致癌因子。世界卫生组织规定，亚硝酸盐的每日摄入安全限量为0.06mg/（kg·d）。我国对亚硝酸盐的使用也有着严格的规定，明确规定了亚硝酸盐在各类食品中的限量，其中各类肉制品中亚硝酸盐的限量（以NaNO2计）为≤30mg/kg[11]。
能力验证样品为具有代表性的鸡肉火腿肠，样品原料选用市售新鲜鸡胸肉。
亚硝酸钠标准溶液（1000mg/L）阿拉丁试剂（上海）有限公司；亚铁氰化钾、乙酸锌、硼酸钠、盐酸萘乙酸二胺（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司。
BCA-124I-1OCN型电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；KQ-100DV型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；TU-1900型紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；HWS-26恒温水浴锅上海一恒科学仪器有限公司。
1.3.1能力验证样品制备
将鸡胸肉用蒸馏水冲洗干净后，使用食品料理机绞碎成鸡肉糜。将72g食盐、18g异抗坏血酸钠、5.4g大豆分离蛋白、5.4g玉米淀粉、144g卡拉胶、144g调味料等辅料及一定质量浓度的目标物标准溶液加入36kg鸡肉糜中，搅拌混合均匀[23-25]。将制备好的鸡肉糜灌入肠衣中，扎口后，在100℃常压蒸煮30min，然后取出冷却至室温。共制备Ⅰ、Ⅱ2批样品，其中Ⅰ组样品亚硝酸盐添加量为72.5mg/kg，Ⅱ组样品亚硝酸盐添加量为43.0mg/kg，每个添加量样品各制备300根，共计600根。每根火腿肠为独立包装，规格60g，在-15℃以下冷冻保存。
1.3.2样品前处理
火腿肠样品经粉碎、匀浆，称取5g匀浆试样，置于250mL烧杯中，加12.5mL饱和硼砂溶液，加入70℃左右的水约150mL，混匀，放置在沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。定量转移上述提取液至200mL容量瓶中，加入5mL106g/L亚铁氰化钾溶液后摇匀，再加入5mL220g/L乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用。
1.3.3亚硝酸盐含量的测定
吸取40.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中，另吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、12.5μg亚硝酸钠），分别置于50mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2mL4g/L对氨基苯磺酸溶液后混匀，静置3～5min后各加入1mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用1cm比色杯，以零管调节零点，于538nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。同时做试剂空白。试样中亚硝酸钠含量按式（1）计算。
式中：X为试样中亚硝酸钠含量/（mg/kg）；m2为测定用样液中亚硝酸钠的质量/μg；m3为试样质量/g；V1为测定用样液体积/mL；V0为试样处理液总体积/mL。
1.3.4能力验证实施
1.3.4.1能力验证样品均匀性和稳定性考察
按照CNAS-GL003《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》[26]的规定，从制备分装好的Ⅰ、Ⅱ2批样品中各随机抽取10个样品（n=10），每个样品至少平行测定2次，并采用单因素方差分析方法对其进行均匀性考察。
通过模拟样品运输条件，并采用t检验法评定考察样品的短期稳定性。长期稳定性测定间隔采用先密后疏的原则设计，分别在0、15、30、60d各随机抽取3份样品进行测定，采用t检验法进行考察。
1.3.4.2能力验证样品发放
能力验证计划共设计发放2份不同浓度的样品。按照随机数表，给每个实验室随机分配不同浓度的样品各1份。Ⅰ组样品编号为Axxx，Ⅱ组样品编号为Bxxx，其中字母A、B用于区分2个样品，每个样品的标识均具有唯一性，以进一步提高样品的保密性和可溯源性。样品发放前在-15℃以下冷冻保存。
1.3.4.3结果评价原则
按照GB/T28043—2019/ISO13528：2015《利用实验室间比对进行能力验证的统计方法》[27]和CNASGL002：2018《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》[28]要求，采用稳健统计技术处理检测结果和评价结果。各种分析建立在实验结果服从单峰、近似对称分布的基础上。具体采用稳健统计技术的算法A确定指定值和能力评定标准差，即采用稳健统计的稳健均值作为指定值，稳健标准差作为能力评定标准差。对参加者的检测结果采用Z值评价，按式（2）计算。
式中：x为参加者检测结果/（mg/kg）；X为指定值/（mg/kg）；σ为能力评定标准差/（mg/kg）。以下列准则评价参加者的检测结果：|Z|≤2.0为满意结果；2.0＜|Z|＜3.0为可疑结果，警告信号；|Z|≥3.0为不满意结果（离群值），行动信号。
本次能力验证计划采用稳健统计方法统计各参加实验室测试结果。本研究涉及的统计量包括结果数、稳健平均值、稳健标准差和变异系数。
2.1.1均匀性检验
依据CNAS-GL003：2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》，采用单因子方差统计分析法，通过采用F检验对2个批次样品进行均匀性检验。由表1可知，在0.05显著水平时，F值＜F临界值，表明能力验证样品中的亚硝酸盐含量均匀。
表1均匀性检测结果Table1Resultsofhomogeneitytestmg/kg
2.1.2稳定性检验
表2短期稳定性检验结果Table2Resultsofshort-termstabilitytestmg/kg
表3短期稳定性检验结果分析Table3Analysisofshort-termstability
表4长期稳定性检验结果Table4Resultsoflong-termstabilitytestmg/kg
表5长期稳定性检验结果分析Table5Analysisoflong-termstability
本次能力验证向42家实验室发放样品，42家实验室按照要求反馈结果，参加单位来自全国20个省、自治区和直辖市，行业涉及食品企业实验室、海关系统、食药监系统和第三方检测等。具体地域和行业分布情况见表6和图1。
表6参加实验室地区分布Table6Regionaldistributionofparticipatinglaboratories
图1各行业参加实验室比例分布图Fig.1Industrydistributionofparticipatinglaboratories
图2实验室测定结果分布情况Fig.2Distributionoflaboratoryresults
本次能力验证回收42家实验室的检测结果，共计84个检测结果，对测定数据的频数进行统计，根据频数绘制分布直方图进行正态拟合，采用稳健统计技术的算法A对数据进行分析。由图2可知，本次能力验证检测结果近似服从对称分布。
表7检测结果统计量汇总表Table7Statisticsofthetestresults
能力验证共回收42家实验室的检测结果，将42家实验室反馈的测定结果采取算法A进行统计，即稳健平均值作为指定值，稳健标准差作为能力评定标准差。由表7可知，能力验证实验室内稳健变异系数较小，表明各实验室检测结果离散性不大，实验室的整体检测分析水平较高，检测水平差异较小。
对反馈结果进行分析，42家单位共84个结果，其中，34家实验室双样检测结果均为满意，结果总体满意率为81.0%；7家实验室有不满意结果，不满意率为14.3%；1家实验室有可疑结果，可疑率为2.4%。实验室能力验证结果汇总见表8，实验室满意结果分布见表9，可疑和不满意实验室代码见表10。
表8检测结果汇总表Table8Summaryofthetestresults
表9检测结果满意情况汇总Table9Summaryofthesatisfactoryresults
表10结果可疑及不满意实验室代码Table10Codesoflaboratorieswhichprovidedsuspiciousorunsatisfactoryresults
图3各行业实验室检测结果对比Fig.3Comparisonofresultsoflaboratoriesindifferentindustries
由图3可知，各行业参试实验室结果满意率均高于60%，可见我国具备肉制品中亚硝酸盐检测资质的机构具有较高的检测能力。
图4样品I亚硝酸盐含量检测结果Z值Fig.4ZvaluesoftestresultsofnitriteinsampleI
图5样品II亚硝酸盐含量检测结果Z值Fig.5ZvaluesoftestresultsofnitriteinsampleII
将同一组检测结果按Z值绘制柱状图，可直观得到本次能力验证结果分布。由图4～5可知，本次能力验证计划出现不满意结果的Z值均属于Z≤-3.0这一情况，表明实验室检测结果均出现负偏离，如代码007、016的实验室，样品Ⅰ、Ⅱ检测结果均偏小。
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ProficiencyTestingforDeterminationofNitriteinMeatProducts
BUDandan1,2,YULibo1,2,BAIYaxin1,2,YANGZhaoying1,2,DONGJing1,2,YUYang1,2,CHENDongdong1,PENGTao1,*(1.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100176,China;2.CAIQ(Beijing)TestingandCertificationCo.Ltd.,Beijing100176,China)
Keywords:meatproducts;nitrite;robuststatistics;proficiencytesting
收稿日期：2022-10-09
基金项目：“十四五”国家重点研发计划重点专项（2022YFF1100805）；中国检验检疫科学研究院基本科研业务费项目（2020JK034；2020JK039）
第一作者简介：卜丹丹（1990—）（ORCID:0000-0002-5704-750X），女，助理研究员，硕士，研究方向为理化领域能力验证。E-mail:budd@acas.com.cn
*通信作者简介：彭涛（1976—）（ORCID:0000-0002-4596-2946），男，研究员，博士，研究方向为食品安全。E-mail:caiq_pengtao@126.com