小曲白酒属于清香型白酒大类，具有醇香清雅、酒体柔和、回甜爽口、纯净怡然的风味和口感，深受湖北、重庆、云南等地消费者喜爱，小曲白酒的风味特征主要由酿造原料和生产工艺所决定[1]。高粱是小曲白酒主要的酿造原料，高粱中支链淀粉含量高、蛋白质含量适中、脂肪含量低，并含适量单宁、灰分及粗纤维，相对于其他淀粉质原料来说结构较疏松，蒸煮后易被酿酒微生物利用，是白酒酿造的首选原料[2-3]。
高粱品种不同，其淀粉、蛋白质、脂肪和单宁组成与含量均不同，对酿酒的出酒率、酒质和蒸煮性能均有不同程度的影响[4]，如通常糯高粱中支链淀粉的含量与比例高于粳高粱，酿造出来的白酒香气品质更优。目前，针对不同品种高粱的酿造性能及对出酒率和感官质量的影响已有较多研究[5-6]，但是不同品种高粱对于白酒风味物质的影响却鲜有报道，研究不同品种高粱对白酒风味物质的影响，对于酿造原料的筛选以提高出酒率和风格特征具有重要意义。
本研究以湖南产糯高粱(两糯一号，LNYHC)和澳洲产粳高粱(BUSTER品种)为酿造原料生产的小曲白酒为研究对象，采用液液萃取/顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(liquid-liquidextraction/headspacesolid-phasemicroextraction-gaschromatography-massspectrometry,LLE/HS-SPME-GC-MS)和气相色谱-嗅闻(gaschromatography-olfactometry,GC-O)联用技术，通过香气稀释萃取分析(aromaextractdilutionanalysis,AEDA)和香气活度值(odoractivityvalues,OAVs)解析2种小曲白酒重要的风味物质；基于2种小曲白酒重要香气物质定量结果的分类模型，进一步分析2种小曲白酒中重要风味物质和感官特征的差异，为小曲白酒酿酒高粱品种的筛选和生产工艺的优化提供数据指导。
糯高粱样品，湖南圣丰公司，共4个，编号为LNYHC-1～4；粳高粱样品为澳洲产BUSTER粳高粱品种，共4个，编号为BUSTER-1～4。
小曲白酒试验酒样共24个，全部由劲牌有限公司提供；其中12个以湖南产两糯一号糯高粱(LNYHC-1～4)为酿造原料(编号为NGL-XQJ-1～12)；另外12个以澳洲产BUSTER粳高粱为酿造原料(编号为JGL-XQJ-1～12)，每批原料对应3个小曲白酒样品，如高粱LNYHC-1对应小曲白酒样品为NGL-XQJ-1、NGL-XQJ-2、NGL-XQJ-3，依此类推。
本研究中57种标准物质均为色谱纯(乙醛纯度≥40%，其他标准物质纯度均≥98%)，上海安谱实验科技股份有限公司；正构烷烃(C7～C30)、叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基己醇、己酸乙酯-d11、辛酸乙酯-d15、己醛-d12(均为色谱纯，纯度>97%)，美国Sigma-Aldrich公司；无水乙醇、二氯甲烷，均为色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司；氯化钠(NaCl)、无水硫酸钠(Na2SO4)，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；本实验中所用水均为超纯水。
AB135-S十万分之一电子分析天平，美国Mettler-Toledo公司；FA2004万分之一天平，上海精密科学仪器有限公司；DC12H氮吹仪，上海安谱科技有限公司；7890B-5977C气质联用仪、8890气相色谱仪(配FID检测器)、DB-FFAP毛细管色谱柱(60m×0.25mm,0.25μm)、HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)，美国Agilent科技有限公司；50/30μmDVB/CAR/PDMS(1cm)自动固相微萃取头，美国Supelco公司；ODP4嗅闻仪、MPS2多功能样品前处理平台，德国Gerstel公司。
1.3.1粳高粱和糯高粱理化指标与酿造参数的测定
1.3.2感官评价
小曲的香气特征由训练有素的小组评估，感官评价小组由10名成员组成(5名男性，5名女性，其中国家级品酒委员5人)，成员均经过对57种风味物质(表2)标准品和评价酒样香气描述和香气强度的鼻前嗅闻。感官评价在恒温实验室中进行，室温为(20±1)℃。
参考文献[7]和ISO8586—2012《感官分析选拔、培训和管理评价员及专家评价员的一般指南》，对小曲白酒的感官特性进行讨论，确定小曲白酒的香气特征和6个感官描述属性(水果香、花香、粮食香、甜香、糟香、糠味)。小组成员以随机顺序对样品的感官属性在6点强度等级上进行打分(0=不存在，1=非常低，2=弱，3=中等，4=强，5=很强)。感官评价小组在专业品酒室[(20±1)℃]嗅闻酒样，在专用评酒杯中评价恒定体积15mL的样品，酒杯被随机编码，每次嗅闻90s后进行评价，每轮次间隔30min，每轮次5个酒样，根据10名评价人员的评价结果绘制风味轮廓图，据此分析2种不同小曲白酒酒样在感官上的异同。所有结果重复测定3次，取平均值。
1.3.3香气化合物的提取
参考文献[8]的方法稍做改进，采用液液萃取(liquid-liquidextraction,LLE)方法提取酒样JGL-XQJ-1和NGL-XQJ-1的香气物质。取100mL样品用超纯水稀释至体积分数10%，加入NaCl至饱和，再加入二氯甲烷进行提取(提取3次，每次70mL)，向合并后的有机相中加入无水Na2SO4，4℃过夜脱水，过滤后的提取液在40℃下用氮气缓慢浓缩至约2mL，所得浓缩液用于GC-MS和GC-O分析。
1.3.4GC-MS和GC-O分析
经LLE提取分离后得到的浓缩液分别在GC-MS上经HP-5MS和DB-FFAP色谱柱进行分析。
GC条件：进样口温度均为250℃，载气均为高纯He(≥99.999%)；采用DB-FFAP色谱柱进行分析时，升温程序为初温50℃，以3.5℃/min升至220℃，保持10min，再以15℃/min升至250℃；载气流速为1.42mL/min；采用HP-5MS色谱柱时，升温程序为初温50℃，保持5min，以3.5℃/min升至180℃，以30℃/min升至320℃，保持10min，载气流速为1mL/min；进样量均为1μL，不分流进样。
MS条件：电子电离源(electronionization,EI)；电子能量70eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；辅助通道加热温度280℃；扫描模式为全扫描，质量扫描范围m/z20～500。
1.3.5香气稀释萃取分析AEDA
参照文献[9]将LLE得到的浓缩液在进样分析前以2倍为稀释倍数依次进行稀释(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、……)，随后采用1.3.3所述条件进样分析，各风味物质的香气稀释因子(flavordilution，FD)为GC-O分析时能被嗅觉感知到的最大稀释倍数。
1.3.6定性分析
(1)
1.3.7定量分析
对24批小曲白酒进行定量分析，所有结果重复测定3次，取平均值。其中骨架成分采用GC-FID分析，以叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基己醇为内标物质，以待测物与相应内标物的质量浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标，建立标准曲线，定量分析乙酸、丙酸、异丁酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、仲丁醇、异丁醇、异戊醇、乙醛、乙缩醛；其他微量成分采用HS-SPME-GC-MS分析，以己酸乙酯-d11、辛酸乙酯-d15、己醛-d12为内标物质，采用选择离子扫描法测定化合物的峰面积，以待测物与相应内标物的质量浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标，建立标准曲线进行定量分析。
1.3.7.1GC分析条件
准确吸取1.0mL样品于样品瓶中，加入10.0μL内标溶液，混合均匀后进行GC分析。GC条件：采用DB-FFAP色谱柱，升温程序为：初温50℃，保持5min，以3.5℃/min升至220℃，保持10min，再以15℃/min升至250℃；载气(高纯N2≥99.999%)柱流速为1.0mL/min，恒流模式；进样口温度250℃，分流进样，分流比30∶1，进样量1μL；FID检测器温度260℃。
1.3.7.2HS-SPME分析条件
参考文献[10]的方法稍做改进，将待测样品用超纯水稀释至体积分数10%，取8mL稀释液于20mL顶空瓶中并加NaCl至饱和，加入10.0μL内标溶液充分混合并在50℃下孵育5min以达到平衡，将老化后的固相微萃取纤维头插入顶空瓶中并萃取45min，每振动10s后停止2s，萃取结束后将纤维头插入GC-MS进样口，在250℃下解吸5min，采用DB-FFAP色谱柱按照1.3.4中MS条件进行分析。
1.3.8OAV计算
各物质的OAV等于其质量浓度与嗅觉阈值的比值，本实验中化合物的嗅觉阈值主要由文献查得，一般认为，当OAV<1时，说明该物质对样品总体气味贡献不明显；当OAV≥1时，说明该物质对样品总体气味有明显贡献，OAV越大说明该物质对样品总体气味的贡献程度越大[11]。
应用SPSS22.0对不同样本之间的最小显著差异进行单因素分析，α≤0.05被认为具有统计学差异；使用Origin8.6对数据进行说明；使用Umetrics公司SIMCA14.1软件进行偏最小二乘判别分析(partialleast-squaresdiscriminationanalysis，PLS-DA)，进一步对粳高粱和糯高粱小曲白酒的定量结果进行差异性分析，筛选出显著性差异化合物(P<0.05)。
依据国家标准检测2种高粱的理化指标，结果如表1所示。粳高粱与糯高粱中粗纤维与粗淀粉含量接近，但是支链淀粉占比差异较大，糯高粱中约95%为支链淀粉，粳高粱中约84%为支链淀粉，此外粳高粱中粗蛋白含量(11.0%)高于糯高粱(9.7%)，糯高粱中单宁含量(2.0%)高于粳高粱(0.55%)，2种高粱中理化指标的差异(P<0.05)对它们的酿造参数具有重要影响。
表1两种高粱理化指标检测结果单位：%
Table1Resultsofphysicochemicalanalysisoftwosorghumsamples
2种高粱的理化指标及酿造参数的差异会对出酒率、酒质及风味特征均产生影响，其中糯高粱出酒率为59%～62%，优级酒率90%以上；粳高粱出酒率为58%～60%，优级酒率70%～80%。
感官评价剖面图，如图1所示。通过定量描述感官评价法，糯高粱小曲白酒的粮食香、甜香、水果香比粳高粱强，且存在较为显著的差异(P<0.05)；粳高粱小曲白酒的糟香和糠味则比糯高粱略强；二者在花香上无明显的差异(P>0.05)。
图1粳高粱和糯高粱小曲白酒感官评价Fig.1SensoryevaluationofXiaoquBaijiubrewedbyjaponicasorghumandglutinoussorghum
对2种小曲白酒(JGL-XQJ-1、NGL-XQJ-1)采用LLE萃取后经GC-MS全扫描。在JGL-XQJ-1中共检测出166种挥发性物质，包括酯类61种、醇类32种、酸类5种、醛类7种、酮类7种、缩醛4种、呋喃类3种、硫化物1种、酚类4种、萜烯类18种、其他类化合物24种。在NGL-XQJ-1中共检测出148种挥发性物质，包括酯类57种、醇类19种、酸类7种、醛类10种、酮类8种、缩醛类6种、呋喃类2种、硫化物1种、酚类4种、萜烯6种、其他类化合物28种。
挥发性物质通过质谱NIST谱库、RI值、香气描述、标准品比对进行鉴定确认。在小曲白酒中鉴定出FD≥2的香气物质共57种，其中包括3种脂肪酸、24种酯类、12种醇类、6种醛类、3种缩醛类、4种酮类、4种酚类、1种硫化物，结果如增强出版附件1所示。
JGL-XQJ和NGL-XQJ中FD≥16的挥发性物质均为12种，JGL-XQJ中FD≥16的挥发性物质主要为乙酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、正丙醇、异戊醇、1-辛烯-3-醇、异戊醛等；NGL-XQJ中FD≥16的挥发性物质主要为乙酸、乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇、乙醛、异戊醛、乙缩醛。对比发现，乙酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯等酯类在NGL-XQJ和JGL-XQJ中FD因子均较高，表明酯类对小曲白酒的风味具有重要影响。在NGL-XQJ中乙醛、乙缩醛具有较高的FD因子，它们对小曲白酒的放香具有重要作用；正丙醇、异戊醇等高级醇具有溶剂与指甲油气味，含量过高是引起饮用小曲白酒后头痛口干的原因之一[9]，在JGL-XQJ中它们的FD因子更高。
AEDA是鉴定酒中风味活性化合物的有效工具，只能分析出样品中潜在的风味活性物质[14]。为了鉴定小曲白酒重要的风味物质，本实验对NGL-XQJ和JGL-XQJ各12批样品进行定量分析，并结合嗅觉阈值计算OAV，明确各化合物对小曲白酒风味形成的贡献大小，结果如附表2所示。
从附表3可知，JGL-XQJ中OAV≥1的化合物为28种，其中OAV≥10的风味物质为乙缩醛、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、异戊酸乙酯、乙醛、3-羟基-2-丁酮、1-辛烯-3-醇；NGL-XQJ中OAV≥1的化合物为26种，其中OAV≥10的风味物质为乙缩醛、乙酸乙酯、异戊酸乙酯、乙醛、己酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、乙酸异戊酯、1-辛烯-3-醇。酯类化合物是小曲白酒中最重要的风味物质，大部分酯类物质都具有较低的香气阈值[23]和良好的果香、花香和甜香等愉悦的香气，对小曲白酒香气特征的形成具有重要贡献。糯高粱和粳高粱小曲白酒在酯类化合物上存在显著的差异，其中乙酸乙酯、乳酸乙酯的OAV值糯高粱小曲白酒比粳高粱小曲白酒高，导致糯高粱小曲白酒的风格典型性、水果香优于粳高粱小曲白酒(P≤0.05)。
醇类物质也是小曲白酒中风味物质的重要组成部分，大多呈现果香、酒香，但是过多的高级醇则会给小曲白酒带来苦味[9]。在粳高粱小曲白酒中仲丁醇、异丁醇和异戊醇的OAV值高于糯高粱小曲白酒，这与前期的闻香结果一致。1-辛烯-3-醇具有独特的蘑菇香味,在糯高粱小曲白酒中更高。
小曲白酒中主要的醛酮类物质包括乙醛、乙缩醛、异戊醛和β-大马酮，它们主要由发酵过程中酵母细胞代谢形成[24]，其中β-大马酮给小曲白酒贡献怡人的花香；乙醛、乙缩醛、异戊醛对小曲白酒的果香有重要贡献，但是如果含量过高则会成为小曲白酒的醛异味[10]。糯高粱小曲白酒中乙醛、乙缩醛高于粳高粱小曲白酒，且含量比较适宜，这是糯高粱小曲白酒放香较好的主要原因。糯高粱中3-羟基-2-丁酮明显高于粳高粱(P<0.05)，对糯高粱小曲白酒的甜香具有重要贡献；此外二甲基三硫具有令人不愉悦的气味，在粳高粱小曲白酒中明显高于糯高粱小曲白酒(P≤0.05)。
酚类化合物作为白酒中一类重要的微量成分，对白酒的香气、口感和稳定性均起到重要作用[25]，4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚具有独特的辛香、烟熏香、草药香，虽然它们具有一定的生理活性，但是对小曲白酒香气特征的形成具有负面的影响，在粳高粱小曲白酒中明显高于糯高粱小曲白酒(P≤0.05)。
为进一步区分不同品种高粱小曲白酒间香气成分的差异，本实验采用PLS-DA方法对两者进行分析。2种小曲白酒中挥发性物质定量结果建立PLS-DA模型，结果如图2所示。
图2不同品种高粱小曲白酒PLS-DA散点图Fig.2PLS-DAscoreplotsforNGL-XQJandJGL-XQJ
通过PLS-DA模型将小曲白酒明显分成2类，模型具有良好的拟合参数(R2Y=0.992,Q2=0.977)，证明了该模型的准确性，提取的2个主成分可以解释99.2%的变量，通过该模型可成功区分糯高粱和粳高粱小曲白酒样品。PLS-DA可以预先对所需的观察变量进行分组，后根据组别性质对数据进行统计分析，从而可以精确获悉影响分组的关键变量，PLS-DA变量重要性因子(variableimportanceinprojection,VIP)可以量化每个变量对分类的贡献度，通常以VIP>1的指标作为显著性差异化合物(P≤0.05)，结果如表2所示。
表2粳高粱和糯高粱小曲白酒中差异性挥发性物质(VIP≥1)Table2DifferentialvolatilescompoundsinJGL-XQJandNGL-XQJ(VIP≥1)
续表2
本实验采用GC-MS从粳高粱和糯高粱小曲白酒中共检测出166种和148种香气成分，采用GC-O从2种小曲白酒中鉴定出57种香气活性物质，进一步通过定量分析并计算OAV，粳高粱和糯高粱小曲白酒中OAV≥1的重要香气物质分别为28种和26种，2种小曲白酒中主要香气种类基本相似，含量差异较大。基于重要香气物质的定量结果，建立2种小曲白酒的分类模型，不同高粱品种小曲白酒香气成分存在显著差异，糯高粱作为小曲白酒的酿造原料，在提高甜香、粮食香、水果香等香气特征上比粳高粱更具有优势。本研究为优选小曲白酒酿酒原料，调控小曲白酒生产工艺提供数据指导，为提高小曲白酒的风味和酒质提供了理论支持。