本发明涉及一种淡水中地西泮的检测方法，属于水环境污染物检测技术领域。
背景技术：
地西泮，又称安定，是一种中枢神经系统镇静剂，化学名称是1-甲基-5-苯基-7氯-1,3-二氢-2h-1,4-苯并二氮卓-2-2酮，主要用于人和动物镇静、催眠、癫痫的治疗。地西泮的代谢主要是在肝脏进行，近年来，有不法分子擅自在水产动物喂养、捕捞、运输过程中非法使用地西泮，造成了地西泮在水产品中残留，人们长期摄入含有地西泮残留的水产品后，肝脏负担会加重，头脑昏沉、记忆受损，严重的会出现皮疹、白细胞减少及运动神经和肌肉功能受到抑制，为此农业部发出公告规定地西泮允许作治疗用，但不得在动物性食品中检出，相配合的，出现了较多的对动物、水产品中地西泮的残留检测研究。
然而，地西泮除了会在养殖的动物、水产品中残留，对食用的人群造成损害之外，由于水产品在喂养药物时不可避免需要与水体发生接触，进而亦无法避免的会对水体造成一定的影响，而一旦水体被影响污染，饮用、以及随着水体的浇灌等，周围的土壤以及生长的作物亦会受到影响，因此对水体中的地西泮检测也应给予足够的重视。
中国专利文献cn103323550a，公开了一种同时检测水中五种药物的方法，其中提到了可对水样中的地西泮进行检测。但是，采用该方式能够检出的地西泮定量限为100ng/l，由于水体环境中存在的药量很低，检测的难度比较大，100ng/l的检出限已经不能满足要求，因此，如何实现淡水中地西泮的更低检出限、以对水体环境的污染情况作出精确的判断预警，成为亟需解决的问题。
技术实现要素：
为解决以上技术上的不足，本发明提供了一种淡水中地西泮的检测方法，对检测前的水样处理进行了改进，可满足更低检测限的要求，地西泮定量限可达0.5ng/l，可对水体环境作出精确的判断。
本发明的技术方案如下：一种淡水中地西泮的检测方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理
a、将水样通过水相滤膜除去悬浮物，向除去悬浮物的水样中加入盐酸，使用甲醇、超纯水活化mcx固相萃取柱；
b、将a步骤处理后的水样通过活化后的mcx固相萃取柱，使用超纯水淋洗mcx固相萃取柱，用氨水甲醇洗脱mcx固相萃取柱，收集洗脱液；
c、将步骤b得到的洗脱液于40℃下氮气吹干；
d、向步骤c得到的残留物中加入定溶液；
e、将步骤d得到的溶液过滤膜后等待检测；
(2)样品检测分析
f、将步骤e得到的待检样品送入液相色谱串联质谱仪中检测地西泮的含量。
本发明的技术方案还包括：所述步骤a中，水相滤膜的孔径是0.45μm，加入5～10ml的0.2mol/l盐酸。
本发明的技术方案还包括：所述步骤a中，量取的水样量与加入的盐酸量用量比为50～100：1。
本发明的技术方案还包括：所述步骤b中，洗脱使用的是5％氨水甲醇，步骤d中，定溶液使用甲酸、乙腈与水按0.01：7:3的体积比配制。
本发明的技术方案还包括：所述步骤b中，淋洗使用的超纯水用量与洗脱使用的氨水甲醇用量相同，步骤d中，加入的定溶液量是1ml，步骤e中，滤膜孔径是0.22μm。
本发明的技术方案还包括：所述步骤f中，液相色谱条件是：
色谱柱：acquitytmuplcbehc18，1.7μm×2.1mm×100mm；
色谱柱温度：40℃；
流动相：a:乙腈，b:含有0.1％甲酸溶液；
流速：0.25ml/min；
进样量：10μl；
进样的梯度洗脱表是
本发明的技术方案还包括：所述步骤f中，质谱条件是：
电离方式：正离子esi+；
电离电压：2.50kv；
锥孔电压：48v；
离子源温度：150℃；
锥孔反吹气流速：50l/h；
脱溶剂气温度：450℃；
脱溶剂气流速：900l/h；
氩气流速：0.12ml/min；
地西泮母离子、子离子、锥孔电压及碰撞能量表：
本发明的有益效果是：对地西泮检测的前处理进行改进，通过对hlb(亲水亲脂平衡的水可浸润性交换柱)与mcx(混合型阳离子交换柱)小柱进行富集对比，发现过膜后加盐酸用mcx小柱的富集效率优势明显，其富集效率和净化效果更好，能够做到更低的检测限更好的稳定性，地西泮的检测限可达0.5ng/l，从而可快速有效的检测出水体中地西泮的含量，对水体环境的污染情况进行准确判断，便于提前建立风险预警。
附图说明
图1是不同处理条件对地西泮富集的影响图。
图2是mcx小柱不同条件下地西泮的富集效率图。
图3-1、3-2是淡水样品的定性与定量离子的空白谱图。
图4-1、4-2是地西泮的标准的定性和定量离子谱图。
图5-1、5-2是淡水样品中添加1ng/l地西泮后的定性和定量离子谱图。
具体实施方式
以下结合附图，通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明的淡水中地西泮检测方法，具体实施例如下：
(一)试剂与材料
a)超纯水
b)甲醇：色谱纯
c)乙腈：色谱纯
d)甲酸：色谱纯
e)mcx柱：60mg，3ml。
f)0.45μm醋酸纤维滤膜
g)0.22μmpvdf滤膜
h)0.2mol/l盐酸：取10ml优级纯浓盐酸加入到490ml超纯水中。
i)5％氨水甲醇：取25ml优级纯氨水加入到475ml甲醇中。
j)定溶液：甲酸、乙腈与水按0.01：7:3的体积比配制。
k)100mg/l地西泮标准储备液：称取10mg地西泮标准品，用乙腈定容至100ml。
l)1mg/l地西泮标准使用液：量取f)溶液1ml，用定溶液定容至100ml。
地西泮标准曲线：先将g)稀释10倍，然后分别量取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl用定溶液定容至1ml，使之最后浓度分别为1μg/l，2、5μg/l、10μg/l、20μg/l。
(二)检测仪器和设备
超高效液相色谱-串联质谱仪(micromstqs,waters,usa)，超纯水仪(milli-qgradient,millipore,france)，高速离心机(tgl-10c,上海安亭科学仪器厂)，固相萃取装置、氮吹仪(n-evaptm112,organomationassociates,usa)。
(三)测定步骤
a、水样预处理：量取500ml检测水样过0.45μm水相滤膜除去悬浮物，之后向去除悬浮物的检测水样中加入10ml0.2mol/l盐酸。在此步骤中，还需要对固相萃取柱进行处理，具体可依次用10ml甲醇、10ml超纯水活化mcx固相萃取柱。
b、浓缩富集：将步骤a处理后的检测水样过步骤a活化后的mcx固相萃取柱，之后使用5ml超纯水淋洗，5ml的5％氨水甲醇洗脱，于40℃下氮气吹干，加入1ml含0.1％甲酸的定溶液，过0.22μm滤膜后，上机检测。
如图1和图2所示，本发明在对抽滤后的水样分别直接上柱、加入盐酸后上柱、加入甲醇后分别上hlb柱与mcx柱进行对比。经过对比后发现，过膜后加盐酸且使用mcx小柱的地西泮富集效率具有明显优势，且当mcx小柱在过0.45μm的水膜后加0.2mol/l的盐酸时可以得到最高的富集，由此利用该处理方式的高富集效率，可做到更低的检测限和更好的稳定性。此外，定溶液在配制时，主要考虑到定溶液的有机相比例对上机后的地西泮在质谱上的峰型有比较大影响，而加入甲酸有利于提高地西泮在质谱上的灵敏度。
将步骤b得到的检测样品溶液送入液相色谱串联质谱仪中进行地西泮的检测，得出检测数据和谱图，具体使用的色谱条件和质谱条件如下：
ⅰ、液相色谱条件：
ⅱ、质谱条件：
(3)地西泮的定性与定量测定
按式(1)分别计算试样中地西泮的残留量(ng/l)，计算结果需扣除空白值，测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
式中：
x——试样中被测组分地西泮的残留量，单位为ng/l；
ci——试样溶液中对应的被测组分浓度，单位为ng/l；
v——试样溶液定容体积，单位为ml；
m——供试试样的体积，单位为l。
(4)地西泮标准曲线
先将地西泮使用液稀释10倍，然后分别量取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl用定溶液定容至1ml，使之最后浓度分别为1μg/l，2、5μg/l、10μg/l、20μg/l。本方法线性稳定：r2＝0.9989y＝4584.34+2174.4。
(四)检测方法的准确度和精密度验证
分别在检测水样中加入1ng/l、5ng/l、10ng/l不同量的地西泮标准品，按前述的样品处理方法处理，使用液相色谱串联质谱仪平行测定6次，分别计算回收率和相对标准偏差，结果如下表所示：
通过表格数据可知，目前一般对回收率要求为70-120％，相对标准偏差为15％以内，而以上数据明显满足这个要求。
本发明的水样检测应用：取山东某三个水产养殖场的9份实际水样，按本方法进行处理后上机检测，计算结果中，有两份水样检出地西泮，结果分别为4.25ng/l，1.68ng/l。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。