人肝癌细胞系购于中国科学院细胞库；壳寡糖购自大连格莱克生物科技有限公司；棕榈酸(Palmiticacid，PA)购自美国OCROS公司；MEM培养基及青霉素/链霉素购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自北京康源世纪有限公司；BCA蛋白定量试剂盒及油红O染液购自西安赫特生物科技有限公司；RNA抽提试剂盒及UltraSYBRGreen试剂盒购自Promega公司。
几丁寡糖(NACOS)由实验室制备，主要流程如下：1)取5.0g壳寡糖(分子量为300-1700Da，脱乙酰度为90%)，溶于50mL水中，分别加入3mL甲醇及0.1g4-二甲氨基吡啶，再加入乙酸酐4.37mL，于60℃下反应4h；2)在反应液中加入5倍体积的丙酮，得到灰白色沉淀，过滤后用丙酮洗涤2-3遍，置于真空干燥箱中干燥2h，得到灰白色NACOS；3)经LC-MS及核磁共振分析，确定NACOS的乙酰度为97%，聚合度为3-10。
HepG2细胞用MEM常规培养基培养(含10%FBS胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素及1%非必需氨基酸)，培养温度37℃，5%CO2浓度。细胞融合度达80%后，以0.125%胰酶消化传代(含0.02%EDTA)。
1)收集对数生长期HepG2细胞，调整细胞悬液的浓度为104/mL，接种于96孔培养板，每孔150μL；2)细胞融合度达到80%左右时，弃上清，以无血清培养基洗涤2次；3)加入不同浓度的NACOS和/或PA，进行药物处理；4)处理完毕，弃上清，以无血清培养基洗涤2次；5)加入100μL含MTT(5mg/mL)的新鲜培养基，继续培养3h；5)弃上清，每孔加入100μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶充分溶解；6)使用酶联免疫检测仪，于490nm处测量各孔的光吸收值；7)计算细胞活力，活力%＝(给药OD-空白OD)/(对照OD-空白OD)×100%。
1)HepG2细胞接种于六孔培养板中，待细胞融合度为80%左右时，进行药物处理；2)药物处理完毕，弃上清，以预冷PBS清洗2次；3)4%多聚甲醛固定30min；4)PBS漂洗1min后，60%异丙醇冲洗15s；5)油红O工作液染细胞1min后，PBS漂洗3次，每次3min。
本研究所用实验动物由北京维通利华科技有限公司提供，系4周龄清洁级雄性C57BL/6小鼠，体重18-20g。高脂饲料(蛋白:碳水化合物:脂=20:35:45，Kcal%)及基础饲料(蛋白:碳水化合物:脂=20:70:10，Kcal%)均购自北京维通利华科技有限公司。饲养条件控制在20-25℃，自然照明，自由饮水和摄食。
小鼠随机分为4组(n=5)，具体分组及药物处理如下：1)正常对照组(Normalchowdiet，NCD)，饲以基础饲料+正常饮水；2)高脂模型组(Highfatdiet，HFD)，饲以高脂饲料+正常饮水；3)NACOS组：饲以基础饲料+NACOS(1mg/mL)水溶液；4)NACOS+高脂模型组：饲以高脂饲料，以浓度为1g/L的NACOS替代正常饮水。饲养20周后，麻醉后杀死小鼠，分别提取肝脏组织中的mRNA和蛋白质进行实验检测。
RNA提取流程如下：1)称取40mg新鲜肝脏组织，加入800μLTrizol，放入1.5mL离心管中，研磨均匀；2)每毫升匀浆液加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；3)4℃、12000r/min离心15min，将上层无色水相转移至一新的离心管中；4)加入等体积异丙醇，颠倒均匀，室温放置10min；5)离心10min，条件同上；6)弃上清，加入75%乙醇800μL，洗涤沉淀，涡旋3s；7)离心3min，条件同上；8)弃上清，室温放置2-3min，加入50μLDEPC水溶解；9)确定各样品RNA浓度，并使用cDNA逆转录试剂盒合成cDNA。细胞样品RNA提取及逆转录步骤同上。
1)HepG2细胞种于六孔培养板中，经不同浓度的药物处理后，预冷PBS清洗1次；2)加入RIPA裂解液，用细胞刮刀轻轻刮下细胞，收集到1.5mL离心管中；3)4℃条件下离心15min(12000×g)，收集离心上清液；4)经BCA法定量各组蛋白样品后，加入适量上样缓冲液，混匀后95℃变性；5)样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离目的条带，以湿转法将目的条带转移至PVDF膜上；6)经5%脱脂牛奶室温封闭1h后，加入p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-Akt、Akt及β-actin一抗，4℃孵育过夜；7)TBST漂洗3次，每次5min；8)加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗，室温孵育1h；9)TBST漂洗3次，每次5min；10)免疫反应复合物用ECL化学发光试剂盒检测。
实验数据应用SPSS软件进行统计学处理，资料以均数±标准差(x±s)表示。
机体内葡萄糖的代谢主要通过胰岛素依赖的PI3K/AKT信号通路进行。胰岛素受体通过酪氨酸的磷酸化激活其受体激酶，与胰岛素受体底物(IRS)发生作用。磷酸化的IRS与PI3K发生作用，促进其活化和Akt的磷酸化，随后通过激活葡萄糖转运载体-4(GLUT4)的跨膜转运，完成对葡萄糖的吸收和利用。当出现胰岛素抵抗时，此通路受到抑制，胰岛素作用出现障碍，使其无法发挥正常生物学功能。本实验表明，无论PA诱导所致的HepG2细胞抑或发生脂代谢紊乱的小鼠肝脏组织，其增加的Akt磷酸化均可被NACOS有效地抑制(P＜0.05或0.01)，提示NACOS将可能通过PI3K/AKT信号通路抑制胰岛素抵抗的发生。