本发明属于食源致病菌快速定量检测技术领域，更具体地，涉及一种副溶血性弧菌的定量检测，特别是涉及活的不可培养状态的副溶血性弧菌的快速定量检测。
背景技术：
对于vbnc状态的致病菌的检测，目前常用叠氮溴化丙锭（pma）和荧光定量pcr（qpcr）相结合的方法，但是，该方法仍具有一些不足：1、对于污染水平低的样品，现有检测方法很难将其准确检测出，因此需要在检测前进行增菌处理，但在增菌的过程中一些干扰微生物同样会进行繁殖，为检测结果带来较大的影响。2、pma能够在qpcr反应中抑制死菌的扩增，能够有效地区分出活菌和死菌，但是它并不能够完全排除来自死细胞dna的pcr产物，从而带来潜在的“假阳性”结果。针对上述污染水平低，检测准确性差以及“假阳性”等问题，我们提出一种新颖的检测方法，将免疫磁珠分离技术（immunomagneticseparation,ims）、pmaxx染料和荧光定量pcr三者相结合，应用于vbnc状态致病菌的检测。
ims是一种免疫学分离技术，磁珠表面活化与活性蛋白质偶联形成免疫磁珠，能够与目标致病菌表面的抗原特异性结合，并在磁场的作用下形成ims-目标菌复合物，从而达到富集分离的效果。对于一些污染程度较低的样本，采用免疫磁珠富集技术能够准确有效地捕获到目标致病菌，从而达到富集的目的。因此，不需要离心、过滤和增菌的过程，就可以从食品基质溶液中富集食源致病细菌，ims是一种快速、特异、高效、操作简单富集方法。pma的
改良结构pmaxx染料同样可以穿透死菌或者受损菌的细胞膜并与其dna进行结合，在强光条件下能使dna构象发生改变，从而抑制了pcr的扩增，并且，pmaxx能更高效的抑制死菌dna的扩增，从而具有更高的准确性。通过结合qpcr建立一种利用生物代谢活性作为活菌判断标准的检测技术，对活菌（包括vbnc菌）进行定量检测分析，能克服pma-qpcr方法在原理上的不足，有效检测出活细胞和vbnc细胞，对于膜完整或膜损伤的死细胞不检测，这也符合致病菌检测的根本要求。因此和常用的检测方法相比，将mis-pmaxx-qpcr三者相结合，不仅可以检测污染水平低的样本，快速高效的富集目标致病菌而避免其他非目标微生物的干扰，而且能够成功的应用于vbnc状态致病菌的检测，有效地减少了“假阳性”结果的出现，提高了检测的准确性。
技术实现要素：
本发明针对于现有技术的不足，提供一种快速定量检测vbnc状态副溶血性弧菌的方法。
本发明首先采用免疫磁珠分离技术进行副溶血性弧菌富集处理，排除海产品中其他食品基质对检测的干扰；其次，结合新型pmaxx染料，最后通过结合qpcr进行检测，建立了一个快速、便捷、高效的海产品vbnc态vp检测新技术。
本发明采用以下技术方案实现上述技术目的：
一种快速定量检测vbnc状态副溶血性弧菌的方法，包括如下步骤：
s1.在-20℃条件下诱导副溶血性弧菌进入vbnc状态；
s2：生物素化多克隆抗体和免疫磁珠的制备：将灭活（0.4%甲醛、37℃处理24h）得到的副溶血性弧菌抗原注射入新西兰大白兔体内进行免疫反应得到兔多抗血清，然后经proteing/a亲和纯化至效价大于1:50000，最后标记生物素得到生物素化的副溶血性弧菌多克隆抗体；将链霉亲和素磁珠用无菌pbst溶液洗涤2~3次后，再加入上述生物素化的副溶血性弧菌多克隆抗体，孵育制备免疫磁珠；
s3.免疫磁珠富集：将步骤s2中经过处理的免疫磁珠与步骤s1中进入vbnc状态的副溶血性弧菌菌液进行混合，得到富集液，其中，免疫磁珠的浓度为0.5~1mg/ml，副溶血性弧菌菌液的浓度为104~106cfu/ml；免疫磁珠的体积为10μl~200μl，副溶血性弧菌菌液的体积为0.5~1ml；
s4.pmaxx染色：在步骤s3得到的富集液中加入pmaxx使其终浓度达到10~20μmol/l，染色后进行检测。
作为一种优选，pmaxx的浓度为0.5~1mg/ml。
作为一种优选，步骤s4经过染色后，将染色后的混合溶液进行总dna提取，然后采用荧光定量pcr进行检测。
作为一种优选，步骤s2中，pbst制备方法为100ml的0.01mpbs加入50μl吐温20。
作为一种优选，步骤s3中，用免疫磁珠捕获vbnc状态的副溶血性弧菌，捕获率计算方法为：ce（%）=（1-b/a）*100%，其中a是样品中总菌数，单位为cfu/ml；b是未连接到免疫磁珠的致病菌数量，存在于上清液中。
作为一种优选，荧光定量pcr检测反应体系包括：总体积为25μl含有1μl的10μm的每种引物f/r和0.5μl的10μmprobe，12.5μlaceqqpcrprobemastermix和5μldna模板，5μl无菌水，振荡混匀。
作为一种优选，步骤s4中，荧光定量pcr检测程序为：在95℃热启动10min，然后进行45个循环的95℃热解离15s和50℃-60℃下退火延伸1min-3min。
本发明提供了一种快速定量检测vbnc状态副溶血性弧菌的方法，首次将免疫磁珠技术、pmaxx染料以及qpcr定量检测技术相结合应用于实际样品免前增菌增菌条件下vbnc状态菌的检测中。通过实验能够证明，该方法对vbnc状态副溶血性弧菌的检测线为1.05cfu/g，该方法不仅灵敏度高且特异性好。
与现有技术相比，本发明具备以下优点及有益效果：
（2）本发明将链霉亲和素和生物素相结合形成的免疫磁珠创造性地应用于vbnc状态菌的富集。
（3）本发明创造性地利用免疫磁珠结合pmaxx特异识别vbnc状态副溶血性弧菌，检出率和特异性水平提高。
（4）本发明mis-pmaxx-qpcr技术，对vbnc状态副溶血性弧菌富集效率高达85%，检测限达到1.05cfu/g，实现实际样品免前增菌条件下vbnc状态副溶血性弧菌的高灵敏度识别，尤其适用于污染程度较低的样本。
附图说明
图1为免疫磁珠和免疫磁珠捕获vbnc副溶血性弧菌扫描电镜图。
图2总、活和可培养的副溶血性弧菌细胞计数。
图3为标准曲线图。
图4为纯培养物检测灵敏度图。
图5为特异性扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
本发明中利用的菌株信息如下：
副溶血性弧菌标准菌株（atcc17802、scaufhsm001、scaufhsm002、scaufhsm003、scaufhsm004、scaufhsm005、scaufhsm006、scaufhsm007、scaufhsm008、scaufhsm009、scaufhsm010）、溶藻弧菌（atcc33787、cmcc1833）、创伤弧菌（atcc27562）、哈氏弧菌（scaufhsm011）、大肠杆菌o157：h7（atcc35150）、大肠杆菌（cicc10662）、肠毒素大肠杆菌（cicc10667）、大肠杆菌o127：k63（cicc10411）、结肠炎耶尔森杆菌（cmcc(b)52204）、单核细胞增生李斯特氏菌（atcc19115）、鼠伤寒沙门氏杆菌（atcc14028）、金黄色酿脓葡萄球菌（atcc25923）、阪崎肠杆菌（atcc29544）、绿浓杆菌（atcc15442）、蜡样芽胞杆菌（cmcc63303）、痢疾志贺氏菌（cmcc(b)51105）。
实施例1：
1、菌种的复苏与增菌：
将储存在-80℃甘油管中的副溶血性弧菌在3%nacltsa平板上划线，并放置于37℃下恒温培养18-24h。挑取平板上的单菌落接种于3%nacl碱性蛋白胨水中，37℃下培养12h。
2、vbnc状态副溶血性弧菌的诱导：
取培养至对数期的副溶血性弧菌增菌液50ml，离心5min。弃上清液，收集沉淀用无菌生理盐水反复充分洗涤两次后，将细菌沉淀重新悬浮在无菌0.9％生理盐水中，使得菌液初始浓度为106cfu/ml。然后将菌液置于-20℃条件下诱导成vbnc状态。
3、平板培养计数法测定细菌可培养数：
将诱导菌液用无菌生理盐水10倍梯度稀释，选择两个合适的稀释梯度，每个梯度设3个平行，吸取100μl涂布于固体培养基上，37℃下培养24h后进行菌落计数。当平板上无菌落生长时，连续计数3d。若无菌落生长，则将接种菌液扩大至1ml，连续计数3d，若平板依然无法检测到菌落生长，则认为此时细菌进入不可培养的状态。
4、活菌数和总菌数的检测：
根据死/活细菌检测试剂盒(live/deadbaclightbacterialviabilitykit,molecularprobes,inc.)的操作要求对活菌数和总菌数进行检测。
5、生物素化多克隆抗体的和免疫磁珠的制备：
将0.4%甲醛、37℃处理24h灭活得到的副溶血性弧菌抗原注射入新西兰大白兔体内进行免疫反应得到兔多抗血清，然后经proteing/a亲和纯化和间接elisa法检测效价，本发明采用的效价需大于1:50000，最后标记生物素得到生物素化的副溶血性弧菌多克隆抗体；将25μl链霉亲和素磁珠用无菌pbst溶液洗涤2-3次后再加入300μl生物素化的多克隆抗体，室温下孵育30min制备免疫磁珠。
6、免疫磁珠富集：
分别取制备好的免疫磁珠150μl加到1.5ml离心管中，磁分离5min后弃去免疫磁珠（浓度为1mg/ml）体系中的保护液，用无菌pbst溶液洗涤2-3次后，加入1ml，浓度为106cfu/ml的副溶血性弧菌菌液，轻微颠倒混匀置于垂直混匀仪上低速（10rpm）旋转混匀孵育45min。磁分离5min后，弃去上清液用生理盐水重悬。
7、pmaxx处理：
将100μl的初始浓度为20mmol/lpmaxx溶于900μl无菌水中制备成浓度为2mmol/l的pmaxx储备液。分别取适量的（4μl）2mmol/lpmaxx储备液于500μl经免疫磁珠富集后的副溶血性弧菌菌液中，使得pmaxx的工作浓度为16μmol/l，充分震荡均匀，室温下暗室孵育5min。然后置于hg-ema核酸光标记仪中曝光8min。
8、dna提取及荧光定量pcr（qpcr）检测体系的建立：
按照细菌基因组dna提取试剂盒说明书进行dna提取。根据ncbi中副溶血性弧菌保守的tlh基因序列，利用引物expression3.0.1软件设计了qpcr引物和探针，具体序列如表1所示。反应体系：总体积为25μl含有1μl的10μm的每种引物f/r和0.5μl的10μmprobe，12.5μlaceqqpcrprobemastermix和5μldna模板，5μl无菌水。反应条件：在95℃热启动10min，然后进行45个循环的95℃热解离15s和60℃下退火延伸3min
表1qpcr引物及探针列表
9、ims-pmaxx-qpcr和pmaxx-qpcr方法在纯培养物中灵敏度检测比较
取副溶血性弧菌vbnc诱导液0.5ml，用无菌生理盐水10倍倍比梯度稀释得到浓度为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的副溶血性弧菌vbnc菌液。分别采取ims富集pmaxx染色和直接进行pmaxx两种方法处理后，按照细菌基因组提取试剂盒说明书来提取核酸，然后经qpcr检测。
结果：
如图1为扫描电镜图，其中左图是免疫磁珠扫描电镜图右图是免疫磁珠捕获vbnc状态副溶血性弧菌电镜扫描图。用免疫磁珠捕获vbnc状态的副溶血性弧菌，捕获率计算方法为：ce（%）=（1-b/a）*100%，其中a是样品中总菌数，单位为cfu/ml；b是未连接到免疫磁珠的致病菌数量，存在于上清液中。优化后的免疫磁珠能够捕获85%的目的菌株，具有较高的捕获效率。
如图4为mis-pmaxx-qpcr灵敏度检测图，该发明方法对vbnc状态的副溶血性弧菌检测效率可达1.05cfu/g。说明本发明方法对vbnc状态副溶血性弧菌具有极高的灵敏度。
如图5为mis-pmaxx-qpcr特异性检测图，从图中能够看出本发明方法能够在27株菌株中成功的富集到副溶血性弧菌并进行扩增，说明本发明方法具有较高的特异性。
表2为ims-pmaxx-qpcr和pmaxx-qpcr纯培养物灵敏度检测，如表1可知，进入vbnc状态的副溶血性弧菌用平板法不能检出，ims-pmaxx-qpcr检测方法灵敏度高于pmaxx-qpcr，说明三种技术方法的联用具有更高的灵敏度，适用于vbnc状态副溶血性弧菌的检测。