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[关键词]褪黑素受体；再灌注损伤；肾脏
肾脏为高灌注器官，因而缺血再灌注损伤（I/R）在缺血性急性肾损伤的病理过程中起重要作用，是临床常见的一个多因素、多途径的复杂的病理过程[1]。然而，I/R的发生机制尚未完全阐明，目前认为氧自由基是I/R发病过程中的重要因素[2]。褪黑素（melatonin，MT）是松果腺分泌的神经内分泌激素，具有广泛的生理作用，如抗氧化、抗衰老、抗肿瘤及调节免疫系统等。研究证实，MT主要通过直接清除自由基和调节抗氧化酶发挥抗氧化作用[3，4]。褪黑素受体（MR）在人体器官组织中广泛分布，褪黑素与其特异性膜受体结合后发挥生物学效应。研究证实，应激状态时组织细胞中MR降低[5，6]。本实验我们建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型，通过研究MR在缺血再灌注损伤大鼠肾脏的表达水平，进一步阐明I/R的发生机制以及MR在I/R中的作用。
1材料与方法
1.1动物模型的建立及分组
选取体重为250～280g的SD大鼠24只，分为以下3组：①缺血再灌注组（n=8）：2%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠（45mg/kg体重），500u肝素钠腹腔注射，进腹后游离双侧肾脏，切除右肾，夹闭左肾动、静脉45min，然后开放，缝合腹壁。②假手术组（n=8）：手术步骤与缺血再灌注组相同，但仅切除右肾，不夹闭左肾动、静脉。③正常对照组（n=8）：大鼠正常喂养，不做任何预处理。
1.2主要仪器和试剂
Trizol试剂（美国GIBCO公司）；TaqDNA聚合酶（日本Takara公司）；10000×SYBRGreen（美国Invitrogen公司）；MMLV反转录酶和RNA酶抑制剂（美国epicentre公司）；UniCalD×C800全自动生化仪（美国Beckman公司）；ABIPRISM7900实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；MTI、MT2受体引物、U6引物由上海英俊生物有限公司提供。
1.3标本采集和处理
实验大鼠分别于手术24h后开腹经腹腔静脉采血，3000rpm/min离心15min，取上清（血清）用于血肌酐和尿素氮水平检测。处死各组大鼠，获取肾脏组织。一部分在无RNA酶的研磨器内加液氮反复研磨成粉状，然后每50～100mg组织样品，加入1mL的TRIZOL试剂，置于1.5mL微量离心管并充分混匀，置于-80°C冰箱备用；另一部分用10%中性甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋。
1.4观察指标
①肾功能检测：采用日本Olympus公司Au2700型全自动生化分析仪检测大鼠血清尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）浓度水平。②肾组织的病理学观察：取各组大鼠同一部位肾脏组织常规制成石蜡标本，切片行HE染色，200倍光镜下观察肾间质小管病变程度。
1.5RT-PCR测定MT1和MT2表达水平
MR1、MR2受体引物、U6引物由上海英俊生物有限公司提供（引物序列见表1）。①总RNA的提取：采用Trizol法提取血清总RNA，异丙醇法浓缩RNA。NanoDropND-1000测定RNA浓度并评估纯度，Agilent2100Bioanalyzer检测RNA分子完整性。②逆转录反应：使用MMLV反转录酶进行逆转录反应（按epicentre公司说明书规范操作）。③荧光定量PCR反应：将试剂按说明书要求加入于反应管中并置于PCR仪上。反应条件如下：94℃1min，55℃1min，72℃2min延伸，40个循环。扩增反应结束后继续从72℃缓慢加热到99℃以建立PCR产物的熔解曲线（每5秒升高1℃），实验重复三次。④数据采用2-ΔΔCT法（CT值定义为每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数）对MR1和MR2表达进行分析。
表1RT-PCR的引物序列
1.6统计学分析
采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，各组数据的组间差异的分析采用方差分析和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠血清尿素氮及肌酐浓度水平比较
正常情况下，大鼠血清BUN和Cr浓度分别为（6.87±1.54）mmol/L和（24.17±4.29）μmol/L。缺血再灌注组大鼠血清BUN和Cr浓度分别为（34.73±7.95）mmol/L和（124.65±25.33）μmol/L，明显高于正常组大鼠（P<0.01）。假手术组大鼠血清BUN和Cr浓度略有升高，但和正常大鼠相比较差异不显著（P>0.05），见表2。
2.2各组大鼠肾脏组织形态学变化观察
光镜下缺血再灌注组大鼠肾脏可见近曲小管出现上皮细胞空泡变性、坏死和管腔扩张，其中可见管型和脱落细胞，间质水肿。假手术组大鼠肾小管基底膜完整，小管上皮细胞结构清晰，未见明显损伤。采用Paller法对肾小管损伤程度评分：每高倍镜视野随机选择10个肾小管计分，肾小管明显扩张、细胞扁平1分；刷状缘损伤1分，脱落2分；管型2分，肾小管管腔内有脱落的、坏死的细胞（未成管型或细胞碎片）计1分。缺血再灌注组大鼠肾脏Paller评分结果明显高于正常组和假手术组（P<0.01），见表2。
表2各组大鼠肾功能水平和肾组织Paller评分（x±s）
注：与正常组比较，t=5.878，P<0.01；与正常组比较，t=13.469，P<0.01；与正常组比较，t=10.074，P<0.01
2.3MR1和MR2各实验组大鼠肾脏组织中的表达情况
以U6为内参基因，荧光定量PCR显示正常情况下大鼠肾脏组织中MR1和MR2mRNA表达强度分别为（0.75±0.16）和（0.64±0.10），I/R处理24h后肾脏组织中MR1和MR2的表达强度分别为（0.37±0.08）和（0.28±0.05），较正常组和假手术组显著下降（P<0.01）（图1）。
图1各组大鼠肾组织MT1和MT2表达情况
3讨论
肾脏缺血再灌注损伤的发病机制非常复杂，至今仍未完全阐明。其病理过程主要为缺血阶段和再灌注阶段：缺血阶段是指由于血流量下降而使肾组织缺血缺氧的状态；再灌注阶段则是使缺血的组织恢复血流的过程，但是再灌注的过程可以进一步加重缺血性组织的损伤。目前认为氧化应激状态是导致肾缺血再灌注损伤的重要因素之一。其通过大量产生内氧自由基（OFR）使脂质过氧化破坏生物膜，而且还可以引起蛋白质、核酸损伤而导致细胞死亡[7]。此外，缺血缺氧后引起细胞内Ca2+的增加，形成Ca2+超载。肾小管上皮细胞和肾实质细胞所产生的肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素1、6、8（IL-1、6、8）等炎性因子和活性氧族也会加重缺血再灌注损伤[8，9]。
目前研究发现褪黑素是一种作用很强的内源性抗氧化剂，能够直接清除和抑制氧自由基产生，抑制脂质过氧化反应，减少氧自由基引起的Ca2+超载，还能增强内源性抗氧化酶的作用。因此褪黑素对心、脑、肝等器官缺血再灌注损伤具有较强的保护作用[10，11]。褪黑素受体（MR）属G蛋白偶联受体超家族（GPCRs）。G蛋白系统主要分为刺激性G蛋白（Gs）及抑制性G蛋白（Gi）系统。MR为膜受体，通过特异性与褪黑素结合发挥生物学效应。目前研究证实，人体内许多组织器官都有褪黑素受体表达，其中主要为MRI和MR2两种亚型[12]。研究发现，生理状态的改变或病理状态下，人体褪黑素受体含量会随之发生改变[13，14]。有研究显示，在生理性状态下，大鼠游泳前后体内MT和MR的表达水平会发生改变，提示在应激状态下MT升高的同时而MR水平降低。王莹等[15]报道缺血性脑损伤中，大鼠肾上腺组织MT升高、MR降低，给予外源性MT可抑制缺氧缺血导致的过度应激损伤，提示MT和MR在机体抗应激过程中起一定作用。
本实验研究结果显示，正常情况下大鼠肾组织中褪黑素受体MR1和MR2mRNA表达强度分别为（0.75±0.16）和（0.64±0.10），缺血再灌注应激可以导致大鼠肾组织中褪黑素受体表达水平明显下调，I/R处理24h后肾脏组织中MR1和MR2的表达强度分别为（0.37±0.08）和（0.28±0.05），较正常组和假手术组显著下降（P<0.01）。假手术组大鼠肾脏组织中MR表达水平较正常略有下降，但是并不明显。以上的研究数据提示，MR表达水平的下降与应激状态下肾脏组织损伤程度有关。即应激导致的损伤程度越重，MR的表达水平越低。这与前面的文献报道是一致的。
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个人的租房协议书(1)
出租方：___________(甲方)
法定代表人：________________
承租方：____________(乙方)
甲、乙双方依据中华人民共和国有关法律法规，在自愿、平等和互利的基础上，就___________房租赁事宜达成如下协议。
一、租赁标的及面积
租赁标的及面积：租赁标的为____________，租赁建筑面积______平方米;
甲方保证：
(1)其业已依法取得租赁标的所有权证，租赁标的不存在权属争议，有完全的权利和能力从事本合同项下的租赁标的的出租业务;
(2)租赁标的符合安全标准以及公安、环保、卫生等主管部门的有关规定，且不存在违法建筑情形;
(3)租赁标的上不存在抵押、保证及可能影响承租人按本合同正常使用租赁标的的其他限制(包括但不限于司法机关和行政限制)，也未将租赁标的的产权转移给其他单位或个人。
二、租赁用途
乙方向甲方承诺，房屋使用用途为____________。
三、租赁期限
甲方不可撤销地同意给予乙方______个月的免租期，由乙方完成租赁房屋的装修和改造，免租期自乙方实际进入租赁房屋现场开始装修之日起算(乙方保证在______年______月______日前进场装修)，乙方在免租期内无需向甲方支付租金。
免租期届满，以双方共同书面确认的日期为准作为本合同的正式起租日，本合同的租赁期限为______年，乙方在此期间内应当按本合同第四条的规定支付相应的租金、费用。
四、租金及付款方式
租金：该房屋日租金为______元人民币/建筑平方米/天(每月以30天计)，租金中含物业管理费。
1.租金付款方式：租金支付方式为每个月支付一次。首期租金应于起租日之前的日内支付，其后每个月支付一次，在每月期满前的______日内，支付下个月租金。即：每个月支付租金人民币______元整(____________元)。
4.在合同有效期限内因市场变动、物价变动、经营风险等不可预料的因素引起的房屋楼内附属物租赁的贬值、升值，不影响房屋及楼内附属物租赁费的支付及双方对合同所约定的其他权利义务。
5.乙方应按下列甲方指定的银行帐户支付到期应付的租金：
开户行:__________________
帐号名:__________________
银行账号：_______________
五、房屋设备、设施
甲方为乙方提供服务于该房屋的硬件设备和附属设施如下：
供暖：市政热源集中供暖，室内安装铜铝复合散热器;
供电：双路10kv供电，a区内配置有两台1600kva变压器;
消防：房屋内有运转正常的烟感报警系统和灭火设备，房屋整体消防系统符合国家有关规定;
餐饮：餐厅提供每日三餐服务;
车位：甲方承诺在租赁期内向乙方所属车辆免费提供充足的停车位，其中包括配送_____个固定车位，其停车位具置将以乙方就近使用为原则，由园区物业管理部门安排;
供水：市政直供和变频稳压供水;
排水：分质排水，优质排水处理回用;
空调：分体式空调由客户安装;
六、保证金
1.乙方同意于本合同生效之日起_____个工作日内向甲方支付保证金人民币_____元整(_____元)。
2.合同期满，双方交接完毕，结清甲乙双方的各项费用后，甲方应将该保证金全额退还给乙方(该保证金不计利息)。
七、合同双方的变更
1.甲方如将该房屋转让给任何第三方，甲方应当给予乙方合理的书面通知，该第三方即成为本合同的当然甲方，享有原甲方的权利，承担原甲方的义务。
2.本合同期内，乙方如将该房屋的部分或全部转租或分租给第三方需事先通报甲方。取得使用权的第三方即成为本合同的当然乙方，享有原乙方的权利，承担原乙方的义务。
乙方与该第三方之间的转租合同应符合以下约定：
1)房屋用途：该第三方应保证在本合同规定的房屋用途范围之内使用该房屋;
2)转租合同的终止日期不得超过本合同规定的终止日期;
3)转租期间，乙方除可享有并承担转租合同规定的权利和义务外，还应就被转租方履行本合同承担连带保证责任;
4)转租期间，本合同发生变更、解除或终止时，转租合同也应随之相应变更、解除或终止。
八、甲方的权利、责任、义务
1.甲方是出租房的合法经营者，有权签署本合同。甲方保证出租物业的合法产权并且有权出租物业。
2.合同签订后，甲方应在合同约定期限内，将该出租房屋交付给乙方。
3.甲方定期检查和及时修缮以保证该出租房屋处于完好、适租状态。
5.按合同规定期限，向乙方收取房租及其他费用(列明)，除上述费用外，甲方不再向乙方收取任何其他费用。与租赁标的有关的房产税、土地使用费及其他费用由甲方负担。
九、乙方的权利、责任、义务
1.乙方自主经营、自负盈亏、遵守国家法律法规、独立承担各种经济及法律责任和义务。
2.乙方对房屋进行装修必须经甲方书面同意，并将房屋所需改造申请书、保证书及平面图、水、电图及国家有关部门批件提交给甲方备案。乙方对该房屋的装修不应损害该房屋主体结构、外墙颜色和造型及承重结构，装修费用由乙方自行解决，对于由乙方负责施工、安装或提供的该房屋硬件设备和附属设施，由乙方负责维修、更新，费用由乙方承担，甲方应予以积极协助。由于乙方改造或使用不当造成的房屋及房屋设施损坏，乙方应负责按甲方要求恢复原状，修理的费用由乙方负担;
3.按期交纳房屋租金及水、电、暖等费用;
4.乙方自行负责出租房屋内部的消防、保安、卫生清洁管理工作，并承担全部责任。
十、合同的延续
本合同租赁期满前二个月，若乙方书面确认同意续租，甲方应当同意乙方的续租要求，甲方有权根据市场情况适当调整租金，租金涨幅不高于_____%。
十一、违约责任
1.出租人在租赁期限内，确需提前收回房屋时，应当事先商得承租人同意，给承租人造成损失的，应当予以赔偿。租赁期间，如乙方确因特殊情况需要退房，必须提前2个月书面通知甲方，解除合同。
3.若乙方未能按期交纳租金，每逾期一日，应按日租金的万分之五向甲方支付滞纳金，逾期三十(30)日未交纳房租，甲方有权解除本合同。甲方有权自保证金中扣除乙方应交纳的房租金额，同时向乙方追缴滞纳金、违约金部分。
4.电费、水费、集中供暖费(如发生)由甲方代收代缴，乙方应于收到甲方缴费通知后七(7)日内缴纳。如乙方逾期缴纳，每逾期一日，则按照逾期支付额的万分之五向甲方缴纳滞纳金。
5.租赁期间，若乙方发现房屋损坏并提出维修要求，甲方应在收到乙方书面通知之当日开始维修，但房屋或设施损坏系由乙方故意毁损的除外。如甲方未按约定及时维修，乙方有权自行维修，有关维修费用将在乙方支付给甲方的租金中抵扣。如甲方逾期十(10)天仍未开始维修房屋，或一次维修超过三十(30)天仍未完成，造成乙方不能正常使用该房屋的，乙方可以退租或要求甲方减少租金或变更有关合同租金条款。甲方因未及时履行本合同约定的维修、养护责任，致使房屋损坏，造成乙方财产损失或人身伤害的，甲方承担赔偿责任。
6.任何一方违反本合同的约定，给守约方造成实际损失的，违约方应赔偿由此而给守约方造成的一切损失。
十二、免责条件
十三、合同期满
合同期满，如甲方的租赁房屋需继续出租或出卖，乙方享有优先权。合同期满未续租或合同解除，乙方必须按时搬出全部物件，搬迁后十五(15)日内房屋如仍有余物，视为乙方放弃物件所有权，由甲方处理。
十四、合同争议的解决方式
本合同在履行过程中发生的争议，应通过甲乙双方协商解决，协商或调解不成，任何一方均可根据《中华人民共和国合同法》的规定，向该房屋所在地人民法院提起诉讼。
十五、违约责任
十六、免责条件
十七、合同期满
十八、合同争议的解决方式
十九、合同生效
2.本合同未尽事宜，一律按《中华人民共和国合同法》的有关规定，经双方协商，做出补充规定。
3.本合同一式肆份，双方各执二份。
二十、通知
依据本合同发生的任何通知应为书面形式，以专人递交、公众认可的快递、挂号信或传真方式发送到：
出租方(甲方)：________________
联系人：________________________
承租方(乙方)：________________
个人的租房协议书(2)
一、甲方出租给乙方的廉租住房位于楼单元号房，该房屋建筑面积共平方米。
二、房屋租赁期自年月日起至年月日止，乙方向甲方承诺，租赁该房屋仅作为住房使用。
三、乙方承租廉租住房，需向甲方缴纳租赁保证金元(大写：)，待退出房屋时退还乙方(不计利息)。
四、房屋租金为：￥3.00元/月平方米。年租金合计元/年(人民币大写：仟佰拾元角分)。租金按月结算。
房屋租金由甲方根据《大黄山豫新公司廉租住房管理办法》确定。根据租赁房屋的结构系数、楼层系数、配套系数等进行租金调整。
七、本协议作为乙方取得房屋使用的凭证。甲、乙双方均有遵守国家房产管理法律、法规、政策的义务。
八、廉租住房只有承租权，没有继承权。如乙方已不符合廉租住房承租条件的，甲方依法按规定收回房屋，终止协议。
九、租赁期内，甲方依法享有的权利和承担的义务：
(一)甲方有权对乙方承租廉租住房的资格进行检查，有权对乙方使用房屋的情况进行检查，发现不符合廉租住房承租条件、违反房屋使用规定者，有权终止租赁协议，收回房屋。
(三)国家、省、市及企业对廉租住房政策调整，颁布与廉租住房有关的政策规定，甲方应当及时告知乙方。
(四)甲方为便于房屋功能的使用，可能对房屋及所属设施进行改造，乙方应积极协助配合。
十、租赁期内，乙方享有的权利和承担的义务：
(四)乙方应正确使用其所承租的房屋及设施、设备。不得将杂物倒入下水道和卫生间，避免堵塞管道;造成堵塞或设备设施损坏一切费用由乙方承担，不得在墙上和屋顶及其他地方另改烟道;墙面不得蹬踏;不得改变楼梯间、过道、走廊、门道等公用场所的设施，承租人之间应当本着互谅互让、维护公共利益和合理使用的原则，屋面楼梯间、过道、走廊、及室外不得堆放任何物品，保持公共场所安全畅通;楼道空间和阳台不准乱堆乱放;不得在屋内存放易燃易爆及其他危险物品等。如因使用不当或人为原因造成房屋及设施损坏的，乙方应立即负责修复并承担经济赔偿，造成的后果由乙方承担责任，如在租期内违反上述规定三次以上(含三次者)，甲方有权解除协议，收回房屋。
(五)房屋需要腾出维修时，乙方应服从甲方安排，按期迁出，若拖延不迁，发生的安全事故和一切损失，由乙方负责。
(六)乙方不得改变房屋及设施、设备状况，如果改变应立即恢复原状，造成房屋及设施、设备损坏的，应承担经济赔偿。(七)乙方不得对房屋进行装修，乙方擅自装修对房屋及邻里造成损害的，应承担全部责任。交还房屋时甲方对乙方装修费用不予赔偿。
(八)乙方不得转租、转借或私自互换承租房屋，不得违反廉租住房使用规定及进行其他法律、法规禁止的行为。
(九)房屋租赁期满或其他原因收回房屋时，乙方应将承租房屋及设施、设备交还甲方，同时交清房屋租金和其他各项费用。交还房屋时应当保持房屋及设施、设备的完好状态，不得留存物品或影响房屋的正常使用，对未经同意留存的物品，甲方有权处置。拒不交还房屋的，甲方有权按有关规定进行处理。
(十)乙方应当履行团结互助、创建和谐社区的义务。
十一、乙方有下列行为之一的，甲方有权解除协议，收回出租的房屋，追缴欠租：
(一)未如实申报家庭收入、家庭人口及住房状况的;
(二)家庭人均收入连续一年以上超出师市城镇居民最低生活保障标准的;
(三)因家庭人数减少或住房面积增加，人均住房面积超过城镇居民住房困难标准的;
(四)擅自改变房屋用途的;
(五)将租住的廉租住房转借、转租或擅自互换的;
(六)房屋闲置三个月以上的;
(七)擅自拆改变动房屋结构、改变房屋状况的;
(八)损坏承租房屋及设施、设备，不予修复或不予赔偿的;
(九)利用承租房屋存放危险物品或进行违法活动的;
(十)逾期未交纳按约定应当由乙方交纳的各项费用，已经给甲方造成严重损害的;
(十一)拖欠房租累计六个月以上;
(十二)与企业解除劳动合同及迁移者。
十二、甲、乙双方应严格遵守本协议的各项条款规定，如违约，违约方应承担违约责任。本协议下发生的争议，由双方当事人协商或申请调解;协商或调解解决不成的，可以申请仲裁或向人民法院起诉。
十三、因不可抗力原因致使本协议不能继续履行或造成的损失，甲、乙双方互不承担责任。
十四、本协议一式叁份，甲方贰份，乙方一份，自双方签章之日起生效。