原名：Studyontoxicity/efficacyrelatedsubstancesandmetabolicmechanismofTripterygiumwilfordiiHook.fbasedonO2LPScorrelationanalysis
期刊：JournalofEthnopharmacology
IF：5.4
通讯作者：李遇伯，杨珍
通讯作者单位：天津中医药大学
实验设计
实验结果
1.生化指标及病理检查
我们在大鼠中成功构建胶原诱导的RA模型，模型（M）组大鼠脚趾体积明显高于正常（NC）组（P<0.05），TwHF处理（ML）组大鼠脚趾肿胀较M组减轻，有接近NC组的趋势，这表明给予TwHF后RA大鼠的病理状态有所改善（图1A）。与NC组相比，M组大鼠血清类风湿因子明显升高（P<0.05）（图1B），M组大鼠踝关节的组织病理学切片显示踝关节间隙变窄、炎症细胞浸润和滑膜细胞增多症（图1C）。造模第8周，M组大鼠血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平较NC组明显升高（P<0.05）（图1D），肾组织显示部分肾小球萎缩，并伴有肾间质炎性细胞浸润（图1E）。与M组相比，TwHF给药（ML）组的关节表面稍微光滑，组织结构的排列得到改善（图1C），血清肌酐和尿素氮水平显著降低（P<0.05）（图1D）。肾脏病理学观察显示，ML组大鼠肾组织的病理变化显著改善，肾小球和肾小管萎缩数量减少，炎症细胞浸润减少（图1E）。正常大鼠给药6周后，ML组大鼠血清Scr和BUN均显著高于NC组（P<0.05）（图1D），肾组织中出现一些肾小球小管萎缩和肾间质炎症细胞浸润等变化（图1E）。结果表明，TwHF对RA大鼠肾脏有保护作用，对正常大鼠肾脏也有一定的损伤作用。
图1药效学结果
图ABC是评估RA模型的指标，图DE是评估肾脏药效学的指标。（A）各组大鼠脚趾体积的变化。（表示与NC组比较，*P<0.05；与M组比较，#P＜0.05）。（B）大鼠血清中类风湿因子的水平。（与NC组比较，*P<0.05；与M组比较，#P＜0.05）。（C）踝关节病理切片（40×)。（D）不同组大鼠血清Scr和BUN水平的变化。（表示与NC组比较，*P<0.05；与M组比较，#P＜0.05）。（E）肾脏病理切片（400×)。
2.TwHF体内外成分的鉴定
TwHF提取物的基峰离子流图如图2所示（图2），共鉴定出34种成分，包括10种三萜、15种二萜、7种酚类、1种生物碱和1种其他类别（表S1）。大鼠血清和尿液的基峰离子流图如补充材料所示（图S2和3）。我们在ML组血清中共鉴定出TwHF的12种成分和10种代谢产物，在尿液中共鉴定了13种成分和19种代谢产物。我们在NL组大鼠血清中鉴定出10种成分和28种代谢物，在尿液中鉴定出15种成分和15种代谢物（表1S2）。
图2TwHF提取物的基峰离子流图
（A）TwHF提取物在正离子模式下的基峰离子流图。（B）TwHF提取物在负离子模式下的基峰离子流图。
表1大鼠血清和尿液中TwHF的成分
缩写：S：血清；U：尿液；﹢:TwHF肾保护物质；﹣:TwHF肾毒性物质。
3.血清和尿液代谢组学结果
为了观察RA大鼠给药后血清和尿液中内源性代谢产物的变化，我们对NC组、M组和ML组的血清和尿液样本进行代谢组学分析。主成分分析显示（图3），三组聚类可被区分，但没有很好地相互分离。于是我们使用OPLS-DA进一步分析。血清样品的OPLS-DA评分图和验证图（ESI+：R2X=0.625，R2Y=0.996，Q2=0.696，ESI-：R2X0.636，R2Y=0.986，Q2=0.483）以及尿液样本的OPLS-DA评分图和验证图（ESI+：R2X=0.667，R2Y=0.996，Q2=0.636，ESI-：R2X=0.0488，R2Y=0.982，Q2=0.574）（图3）显示NC组和M组之间有明显区别，表明建模后大鼠体内内源性代谢产物发生了变化，并且给药后ML组样品有向NC组样品靠近的趋势。
图3TwHF肾脏保护作用的代谢组学结果
（A）NC、M和ML组大鼠血清中正离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA正离子模式评分图；正离子模式验证图。（B）NC、M和ML组大鼠血清中负离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA负离子模式得分图；负离子模式验证图。（C）NC、M和ML组大鼠尿液中正离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA正离子模式评分图；正离子模式验证图。（D）NC、M和ML组大鼠尿液中负离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA负离子模式得分图；负离子模式验证图。
表2TwHF肾脏保护作用的生物标志物
缩写：a表示代谢物已被标准物质鉴定。S：血清。U：尿液。
我们比较正常大鼠给药前后血清和尿液中代谢产物的变化，对NC和NL大鼠的血清和尿液样本数据进行PCA分析，发现两组样本可以完全分离（图4）。在此基础上，我们进行了进一步的OPLS-DA分析，从血清评分图中（ESI+：R2X=0.346，R2Y=0.995，Q2=0.941，ESI-：R2X=0.656，R2Y=0.999，Q2=0.901）和尿液评分图（ESI+：R2X=0.67，R2Y=0.974，Q2=0.915，ESI-：R2X=0.411，R2Y=0.99，Q2=0.944）（图4）可以明显看出NC和NL组的血清样品具有更高的分离度，表明TwHF给药干预改变了正常大鼠血清中的代谢谱。我们对NC组和NL组之间的差异代谢产物进行筛选，以去除与肾保护生物标志物相同的代谢物，作为TwHF肾损伤作用的生物标志物。最后，我们共筛选出58种差异代谢产物，包括烟酰胺，作为TwHF肾损伤影响的生物标志物（表3）。
图4肾损伤影响的代谢组学结果
（A）NC组和NL组大鼠血清正离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA正离子模式评分图；正离子模式S-Plot；正离子模式验证图。（B）NC组和NL组大鼠血清负离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA负离子模式评分图；负离子模式S-Plot；负离子模式验证图。（C）NC组和NL组大鼠尿液正离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA正离子模式评分图；正离子模式S-Plot；正离子模式验证图。（D）NC组和NL组大鼠尿液负离子模式PCA评分的3D图；OPLS-DA负离子模式评分图；负离子模式S-Plot；负离子模式验证图。
表3TwHF对肾脏损伤影响的生物标志物
图5TwHF组分肾脏保护和损伤作用的O2PLS分析
（A）血清中TwHF组分肾脏保护作用的O2PLS评分图和载荷图。（B）尿中TwHF组分肾脏保护作用的O2PLS评分图和载荷图。（C）血清中TwHF成分对肾损伤影响的O2PLS评分图和载荷图。（D）尿中TwHF成分对肾损伤影响的O2PLS评分图和载荷图。
图7TwHF发挥肾毒性和肾保护作用的机制分析
（A）TwHF肾脏保护的活性成分、生物标志物和代谢途径的网络图。（B）TwHF肾损伤的毒性成分、生物标志物和代谢途径的网络图。（C）TwHF中有毒有效物质作用机制的网络图。（D）TwHF发挥直接肾保护作用的代谢途径分析结果。（E）TwHF发挥直接肾毒性作用的代谢途径分析结果。
代谢组学鉴定了24种肾保护作用的生物标志物和58种肾损伤作用的生物标志物。次黄嘌呤是嘌呤代谢中的重要代谢产物，嘌呤代谢异常引起高尿酸血症并以晶体依赖的方式诱导肾脏炎症。一项研究发现雷公藤甲素引起的肾毒性与次黄嘌呤代谢异常有关。Li等用氧嗪酸钾和次黄嘌呤建立高尿酸血症小鼠模型，结果显示模型组小鼠肾脏受损，血清CRE和BUN水平显著升高，肾小球萎缩。在本实验中，与NC组相比，ML组中次黄嘌呤（TwHF肾保护作用的生物标志物）水平减少，这表明TwHF可能通过调节次黄嘌呤代谢发挥其肾毒性作用。
3-羟基邻氨基苯甲酸是色氨酸的分解代谢代谢产物，以剂量依赖的方式抑制白细胞介素17的产生，因此起到抗炎剂的作用。Hou等人使用3-羟基邻氨基苯甲酸减轻实验性自身免疫性肾小球肾炎大鼠的肾损伤，发现它通过减少肾小球组织损伤和炎症细胞浸润来改善肾功能。结合本实验结果，M组3-羟基邻氨基苯甲酸含量较正常对照组下降，TwHF给药干预后3-羟基邻氨基苯甲酸含量增加，提示TwHF可能通过改变3-羟基邻羟基苯甲酸的代谢而发挥肾保护作用。
结论
本研究采用代谢组学和O2PLS相结合的方法，发现了TwHF对身体的毒性和有效物质，并解释了TwHF在不同身体状态下对大鼠肾脏的毒性和保护作用。结果表明，在大鼠病理状态下，TwHF中的3,5-dimethoxyphenyl-2-propenl-ol、kaurane-16，19，20-triol和demethylzeylasteral+O可通过色氨酸代谢途径发挥肾保护作用，以及在大鼠正常状态下通过烟酸和烟酰胺代谢途径发挥肾毒性作用，本研究可用于后续对TwHF的深入研究。本研究可为后续深入研究TwHF“毒/效”的生物学机制提供实验依据，并为解读循证用药在中医中的科学性和可行性提供新的研究思路，可以最大限度地减少药物不良反应，提高临床疗效，对中医药“毒/效”研究的现代化和国际化具有重要的现实意义。
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