本发明涉及一种用于治疗难治性癌症和/或复发性癌症的组合物，所述组合物包含抗体分子和药剂。本发明还涉及一种治疗难治性癌症和/或复发性癌症的方法，所述方法包括施用抗体分子和药剂。还描述了试剂盒，所述试剂盒包括所述抗体分子和药剂。
背景技术：
治疗性抗体已经使癌症治疗发生转变，从而通过结合免疫系统而开启了新的作用机制。举例来说，抗体可以发挥治疗作用的机制是通过募集天然效应系统，如细胞毒性细胞(例如巨噬细胞)和酶(例如补体)，然后所述天然效应系统靶向与抗体分子结合的细胞以刺激癌细胞和其它有害细胞的去除。
CD20特异性单克隆抗体(mAb)利妥昔单抗(rituximab)是被批准用于癌症免疫治疗的第一种抗体，并且因而已经被广泛地施用于患有表达CD20的B细胞癌症的患者，所述癌症包括滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、以及套细胞淋巴瘤(MCL)(Lim,S.H.等,《抗CD20单克隆抗体：历史观点和未来前景(Anti-CD20monoclonalantibodies:historicalandfutureperspectives)》,Haematologica95,135-143(2010)中所综述)。
尽管抗体治疗是有效的，但是在一些情况下，患者将获得对抗体治疗的抗性，这将导致治疗变得无效以及癌症恶化。在其它情况下，癌症可能根本不对癌症治疗作出响应。
令人遗憾的是，有效的治疗性抗体治疗对于复发性癌症和/或难治性癌症来说仍是缺乏的。随着正被开发用于治疗几种类型的癌症的抗体治疗的数量不断增加，正日益需要了解癌细胞对这些治疗的抗性以及开发药物来克服这样的抗性。
举例来说，在利妥昔单抗响应性淋巴瘤内，一些个体在首次治疗时表现出抗性或变得对含有利妥昔单抗的联合治疗具有抗性。除了利妥昔单抗之外，淋巴瘤还可以对其它抗体治疗显示出抗性；例如，抗体分子奥法木单抗(ofatumumab)(它结合CD20)或阿仑单抗(alemtuzumab)(它结合CD52)。
在该背景下，本申请的发明人已经惊人地鉴定出包含抗体和阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂的治疗可以用于治疗复发性癌症和/或难治性癌症。
先前已经证实的是，抑制FcγRIIb与治疗性抗体利妥昔单抗之间的相互作用可以减少抗体的再循环，并且提高利妥昔单抗治疗慢性淋巴细胞性白血病和套细胞淋巴瘤的功效(Lim,S.H.等,《靶B细胞上的Fcγ受体IIb促进利妥昔单抗内化并且降低临床功效(FcgammareceptorIIbontargetBcellspromotesrituximabinternalizationandreducesclinicalefficacy)》,Blood(2011)和WO2012/022985)。
还已知的是，治疗性抗体的活性部分地取决于它们与Fcγ受体(FcγR)的相互作用。确切地说，它是解释了IgG的大部分治疗活性的FcγR的相对表达水平、亲和力以及活性(Nimmerjahn,F.和Ravetch,J.V.,《健康和疾病中的FcγR(FcgammaRsinhealthanddisease)》,CurrTopMicrobiolImmunol350,105-125(2011)；以及Nimmerjahn,F.和Ravetch,J.V.,《作为免疫应答的调节因子的Fcγ受体(Fcgammareceptorsasregulatorsofimmuneresponses)》,Naturereviews8,34-47(2008)中所综述)。
技术实现要素：
然而，本发明的发明人现在已经惊人地证实包含抗体和阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂的联合治疗可以用于治疗复发性癌症和/或难治性癌症。因此，本发明提供了用于治疗患有复发性癌症和/或难治性癌症的患者子组的方法和用途。
换句话说，本发明的发明人已经证实包含受试者的癌症不作出响应(即具有抗性)的抗体与阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂的组合的联合治疗可以用于通过降低和/或克服所述癌症对所述抗体的抗性来治疗复发性癌症和/或难治性癌症。
在第一个方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含：
(i)特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域；以及
(ii)阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂；
特征在于所述组合物用于治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症，并且所述受试者有表达FcγRIIb的靶细胞。
在第二个方面，本发明提供了一种组合物的用途，所述组合物包含：
特征在于所述用途是用于制造用于治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症的药物，并且所述受试者有表达FcγRIIb的靶细胞。
在第三个方面，本发明提供了一种治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症的方法，所述方法包括施用：
(ii)阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂。
特征在于所述受试者是基于其患有复发性癌症和/或难治性癌症来选择的，并且所述受试者有表达FcγRIIb的靶细胞。
在第四个方面，本发明提供了一种用于治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域；
(iii)选自由以下各项组成的组的一种或多种物质：利妥昔单抗；利妥昔单抗生物仿制药；奥法木单抗；奥比妥珠单抗(obinutuzumab)；阿仑单抗；加利昔单抗(galiximab)；托西莫单抗(tositumomab)；放射性缀合的托西莫单抗；替伊莫单抗(ibritumomab)；放射性缀合的替伊莫单抗；抗CD40抗体；抗CD19抗体；抗CD37抗体；用于治疗B细胞癌症的治疗性抗体；
特征在于所述用途用于治疗受试者的复发性癌症和/或难治性癌症，并且所述受试者有表达FcγRIIb的靶细胞。
在本发明的第四个方面的一个优选的实施方案中，所述一种或多种物质包括以下各项或由以下各项组成：利妥昔单抗(或利妥昔单抗生物仿制药)和奥法木单抗；或利妥昔单抗(或利妥昔单抗生物仿制药)和奥比妥珠单抗。
在本发明的第四个方面的一个替代性优选实施方案中，所述一种或多种物质包括以下各项或由以下各项组成：阿仑单抗和抗CD40抗体；阿仑单抗和抗CD19抗体；阿仑单抗和抗CD37抗体；或阿仑单抗和抗CD40抗体以及抗CD19抗体和抗CD37抗体。
在本发明的第四个方面的一个替代性优选实施方案中，所述一种或多种物质包括以下各项或由以下各项组成：用于治疗B细胞癌症的治疗性抗体，如加利昔单抗。
抗体分子是免疫学和分子生物学领域的技术人员公知的。抗体分子是体液免疫系统的组分，并且是由效应B细胞产生以识别和中和进入身体的异物，如细菌和病毒的蛋白质。
通常，抗体分子包含两条重链和两条轻链。抗体分子的重链包含一个可变域和三个恒定域，并且抗体分子的轻链包含一个可变域和一个恒定域。可变域(有时统称为FV区)与抗体的靶标结合，并且每一个可变域包含三个环，这些环被称为互补决定区(CDR)，负责靶标结合。
因此，通过术语“抗体分子”，我们包括所有类型和类别的抗体分子以及其功能片段，包括：单克隆抗体、或多克隆抗体、或合成抗体、或重组产生的抗体、或多特异性抗体、或双特异性抗体、或人类抗体、或人源化抗体、或嵌合抗体、或骆驼源化抗体、或单链Fv(scFv)、或单链抗体、或Fab片段、或F(ab')片段、或二硫键连接的Fv(sdFv)、或胞内抗体、或抗体重链、或抗体轻链、或抗体重链和/或轻链的同二聚体或异二聚体、或其抗原结合功能片段或衍生物、或IgG、或IgG1、或IgG2、或IgG3、或IgG4、或IgA、或IgM、或IgD、或IgE。
已知抗体分子特异性结合限定的靶分子。也就是说，抗体分子优先地和选择性地结合它的靶标而不是非靶标的分子。
评估蛋白质结合的方法是生化和免疫学领域的技术人员已知的。本领域技术人员将了解的是，那些方法可以用于评估抗体分子与靶标的结合和/或抗体的Fc结构域与Fc受体的结合；以及那些相互作用的相对强度、或特异性、或抑制、或阻止、或减少。可以用于评估蛋白质结合的方法的实例是例如免疫测定、BIAcore、蛋白质印迹、放射性免疫测定(RIA)以及酶联免疫吸附测定(ELISA)(关于抗体特异性的论述，参见《基础免疫学(FundamentalImmunology)》,第2版,RavenPress,NewYork,第332-336页(1989))。
因此，通过“特异性结合……的抗体分子”，我们包括所述抗体分子特异性结合靶标，但不与非靶标结合，或比靶标更弱地与非靶标结合(如以更低的亲和力)。
我们还包括以下含义，即所述抗体分子与所述靶标特异性结合的强度是与非靶标结合的强度的至少两倍、或至少五倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少500倍、或至少约1000倍。
此外，我们包括以下含义，即如果所述抗体分子以如下的Kd与所述靶标结合，那么所述抗体分子与所述靶标特异性结合：至少约10-1的Kd、或至少约10-2的Kd、或至少约10-3的Kd、或至少约10-4的Kd、或至少约10-5的Kd、或至少约10-6的Kd、或至少约10-7的Kd、或至少约10-8的Kd、或至少约10-9的Kd、或至少约10-10的Kd、或至少约10-11的Kd、或至少约10-12的Kd、或至少约10-13的Kd、或至少约10-14的Kd、或至少约10-15的Kd。
抗体分子的另一个值得注意的部分是Fc结构域(另外被称为可结晶片段结构域)，它包含抗体分子重链中的每一条的恒定域中的两个。Fc结构域负责抗体分子与Fc受体之间的相互作用。
Fc受体是常常存在于免疫系统的细胞的细胞表面上的膜蛋白(即Fc受体存在于靶细胞膜上，所述膜另外被称为质膜或细胞质膜)。Fc受体的作用是经由Fc结构域结合抗体，以及使抗体内化到细胞中。在免疫系统中，这可以产生抗体介导的吞噬作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
本发明中所包括的Fc受体的实例是FcγRIIb(另外被称为CD32、CD32B、CD32B1、CD32B2、FcRII、FcγRII或FcRIIB)，它是负责结合和再循环抗体的抑制性Fc受体。
因此，通过“能够结合FcγRIIb的Fc结构域”，我们包括本发明的抗体分子的Fc结构域能够结合FcγRIIb并且优选地，所述结合的强度是所述抗体分子与另外的蛋白质、或肽、或多肽、或Fc受体结合的强度的至少两倍、或至少五倍、或至少10倍、或至少约20倍、或至少50倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少500倍、或至少1000倍。
本发明的药剂阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合，这阻止或减少抗体分子被内化到细胞中。
对于分子生物学领域的技术人员来说将容易显而易见的是，什么可以构成本发明的药剂，以及如何能够鉴定本发明的药剂。举例来说，本发明的药剂可以通过筛选阻断FcγRIIb的刺激或信号转导的药剂来鉴定，如通过蛋白质印迹法所检测的在细胞内免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)中酪氨酸-293的磷酸化所指示。举例来说，可以在存在或不存在抗FcγRIIb测试剂的情况下将Raji细胞与针对细胞表面抗原的抗体分子，例如抗CD20利妥昔单抗一起培养，之后针对磷酸化的FcγRIIb进行免疫印迹法(WO2012/022985)。
Neubig等(2003)Pharmacol.Rev.55,597-606(以引用的方式并入本文)描述了可以被筛选以鉴定阻止或减少FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域结合的药剂的各种类别的分子。
本发明的药剂可以是小有机部分、或小无机部分、或肽、或多肽、或拟肽、或核酸、或肽核酸(PNA)、或适体、或脂质、或碳水化合物、或抗体分子。
通过“阻止或减少FcγRIIb结合的药剂”，我们包括所述药剂完全阻断FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域的结合、或部分阻断FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域的结合。
通过“完全阻断”，我们包括在FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域之间没有可检测的结合。通过“部分阻断”，我们包括在所述药剂存在下在FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域之间的可检测的结合低于在不存在所述药剂的情况下FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域之间的可检测的结合。
所述药剂可以通过位阻、和/或通过与抗体分子结合、和/或通过与Fc结构域结合、和/或与FcγRIIb结合、和/或通过与抗体分子结合并且阻断与FcγRIIb接触、和/或通过与Fc结构域结合并且阻断与FcγRIIb接触、和/或通过结合FcγRIIb并且阻断与Fc结构域接触来阻止或减少FcγRIIb结合。
我们还包括如果在药剂存在下，FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域的结合是在不存在所述药剂的情况下FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域的结合的少于约90％、或少于约80％、或少于约70％、或约少于约60％、或少于约50％、或少于约40％、或少于约30％、或少于约20％、或少于约10％、或少于约5％、或少于约1％，那么所述药剂减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合。
我们还包括如果在药剂存在下，FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域结合的强度是在不存在所述药剂的情况下FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的强度的至多1/2、或至多1/5、或至多1/10、或至多1/20、或至多1/50、或至多1/100、或至多1/200、或至多1/500、或至多1/1000，那么所述药剂减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合。
我们包括如果在药剂存在下，FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域的结合是不可检测的、或如果结合是可检测的，而所述可检测的结合是可忽略不计的，那么所述药剂阻止FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合。
本发明中所包括的抗体分子靶标的实例是细胞表面抗原，它将是抗体分子的表位(在这一背景下另外被称为细胞表面表位)。细胞表面抗原和表位是免疫学或细胞生物学领域的技术人员将容易理解的术语。
通过“细胞表面抗原”，我们包括细胞表面抗原暴露在细胞膜的细胞外侧上，但是可能只是短暂地暴露在细胞膜的细胞外侧上。通过“短暂地暴露”，我们包括细胞表面抗原可以被内化到细胞中、或从细胞膜的细胞外侧释放到细胞外间隙中。细胞表面抗原可以通过可以由蛋白酶介导的切割而从细胞膜的细胞外侧释放。
我们还包括细胞表面抗原可以与细胞膜连接，但是可能只是短暂地与细胞膜缔合。通过“短暂地缔合”，我们包括细胞表面抗原可以从细胞膜的细胞外侧释放到细胞外间隙中。细胞表面抗原可以通过可以由蛋白酶介导的切割而从细胞膜的细胞外侧释放。
我们还包括细胞表面抗原可以是肽、或多肽、或碳水化合物、或低聚糖链、或脂质；和/或存在于蛋白质、或糖蛋白、或脂蛋白上的表位。
待由本发明治疗的疾病是复发性癌症和/或难治性癌症。
将了解的是，癌症可以由于获得性抗性而是复发性癌症、或复发性癌症和难治性癌症。通过“获得性抗性”，我们包括所述癌症和/或所述受试者和/或所述靶细胞在第一次施用特定治疗之前对所述治疗没有抗性，但是在至少第一次施用所述治疗之后或期间，例如在第二次施用所述治疗之后；在第三次施用所述治疗之后；在第四次施用所述治疗之后；在第五次施用所述治疗之后；在第六次施用所述治疗之后；在第七次施用所述治疗之后；在第八次施用所述治疗之后；在第九次施用所述治疗之后；在第十次施用所述治疗之后；在第十一次施用所述治疗之后；在第十二次施用所述治疗之后，变得具有抗性。
在本发明的背景下，优选的是，复发性癌症先前已经接受抗体治疗，并且已经变得对该抗体具有抗性。如本文所论述，本发明提供了一种用于治疗患有这样的复发性癌症的患者子组的手段，也就是说，本发明提供了一种用于治疗患有对抗体治疗具有抗性的复发性癌症的受试者的手段。
在本发明的背景下，进一步优选的是，所述复发性癌症先前已经接受如本文所限定的抗体分子的治疗，并且已经变得对该抗体分子具有抗性。如本文所论述，本发明提供了一种用于治疗患有这样的复发性癌症的患者子组的手段，也就是说，本发明提供了一种用于治疗患有对如本文所限定的抗体分子具有抗性的复发性癌症的受试者的手段。
将了解的是，本发明因此提供了一种用于治疗受试者的癌症的手段，所述手段是使用所述癌症已经抵抗的相同的抗体分子而实现的。
难治性癌症是已经接受治疗，但是已经不对该治疗作出响应、和/或已经接受治疗，但是已经在治疗期间进展的癌症。换句话说，难治性癌症是对治疗具有抗性的癌症。
将了解的是，癌症可以由于内在抗性而是难治性癌症。通过“内在抗性”，我们包括以下含义，即所述癌症和/或所述受试者和/或所述靶细胞从第一次施用特定治疗时起就对所述治疗具有抗性。
在本发明的背景下，优选的是，难治性癌症先前已经接受抗体治疗，但是对该抗体具有抗性。如本文所论述，本发明提供了一种用于治疗患有这样的难治性癌症的患者子组的手段，也就是说，本发明提供了一种用于治疗患有对抗体治疗具有抗性的难治性癌症的受试者的手段。
在本发明的背景下，进一步优选的是，所述难治性癌症先前已经接受如本文所限定的抗体分子的治疗，但是对该抗体分子具有抗性。如本文所论述，本发明提供了一种用于治疗患有这样的难治性癌症的患者子组的手段，也就是说，本发明提供了一种用于治疗患有对如本文所限定的抗体分子具有抗性的难治性癌症的受试者的手段。
将了解的是，本发明因此提供了一种用于治疗受试者的癌症的手段，所述手段是使用所述癌症所抵抗的相同的抗体分子而实现的。
复发性癌症和/或难治性癌症将容易由医学领域的技术人员诊断出，并且进一步论述于本文中。
本申请的发明人现在已经出人意料地证实用抗体分子和阻断FcγRIIB与所述抗体分子结合的药剂进行的治疗可以用于治疗复发性癌症和/或难治性癌症。如所附的实施例中所证实，抗体分子和本发明的药剂对于治疗难治性慢性淋巴细胞性白血病和/或复发性慢性淋巴细胞性白血病是特别有效的。
本申请的发明人认为由于FcγRIIB通过使治疗性抗体分子内化而降低了那些抗体分子治疗复发性癌症和/或难治性癌症的有效性，因此用抗体分子和本发明的药剂进行的治疗发挥作用。鉴于他们的发现，本申请的发明人认为这些抗体分子和本发明的药剂将有效治疗可以通过治疗性抗体分子治疗并且受试者的靶细胞表达FcγRIIB的任何复发性癌症和/或难治性癌症。
因此，所述抗体分子和本发明的药剂可以用于治疗B细胞癌，特别是复发性套细胞淋巴瘤和/或难治性套细胞淋巴瘤、和/或复发性滤泡性淋巴瘤和/或难治性滤泡性淋巴瘤、和/或复发性弥漫性大B细胞淋巴瘤和/或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤。
对于本发明治疗患有复发性癌症和/或难治性癌症的受试者，所述受试者应当有表达FcγRIIb的靶细胞。将了解的是，FcγRIIb是细胞表面受体，并且因此将存在于靶细胞的表面上。本领域技术人员将了解的是，不同的生物标志物可以用于评估FcγRIIb的存在；例如FcγRIIb蛋白质和/或FcγRIIbmRNA。本领域技术人员将了解的是，存在本领域已知的用于测量FcγRIIb蛋白质的方法；例如，免疫组织化学、蛋白质印迹法、Bradford蛋白质测定、流式细胞术以及使用AT-10抗体进行检测。本领域技术人员将了解的是，存在本领域已知的用于测量FcγRIIbmRNA的方法；例如RNA印迹法、RNA测序、定量PCR、以及微阵列杂交。
本领域技术人员将了解的是，为了评估FcγRIIb的存在，可能需要将靶细胞中FcγRIIb生物标志物的水平与不表达FcγRIIb的对照细胞中FcγRIIb生物标志物的水平相比较。该对照细胞可以是来自不表达FcγRIIb的个体的对照细胞、或来自个体的不表达FcγRIIb的对照细胞、或来自受试者的不表达FcγRIIb的对照细胞、或已经被遗传工程化以不表达FcγRIIb的细胞。
通过“表达FcγRIIb的靶细胞”，我们包括靶细胞表达FcγRIIb蛋白质和/或FcγRIIbmRNA。我们还包括如果靶细胞中的FcγRIIb蛋白质和/或FcγRIIbmRNA是对照细胞中的FcγRIIb蛋白质和/或FcγRIIbmRNA的多于两倍、或多于五倍、或多于10倍、或多于20倍、或多于50倍、或多于100倍、或多于200倍、或多于500倍、或多于1000倍，那么所述靶细胞可以被定义为表达FcγRIIb。
对于医学领域的技术人员来说将已知的是，药物可以用不同的添加剂改性，例如以改变所述药物由身体吸收的速率；并且可以被改性成不同的形式，例如以允许以特定的施用途径用于身体。
因此，我们包括本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物可以与赋形剂和/或药学上可接受的载体和/或药学上可接受的稀释剂和/或辅料组合。
我们还包括本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物可以适用于肠胃外施用，包括水性和/或非水性无菌注射溶液，所述溶液可以含有抗氧化剂、和/或缓冲剂、和/或抑菌剂、和/或使得制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和/或水性和/或非水性无菌悬浮液，所述悬浮液可以包括助悬剂和/或增稠剂。本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物可以存在于单位剂量容器或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在冷冻干燥(即冻干)条件下，从而只需要在即将使用之前添加无菌液体载体，例如注射用水即可。
临时的注射溶液和悬浮液可以由先前所述种类的无菌粉剂、和/或颗粒、和/或片剂来制备。
对于向人类患者肠胃外施用，本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物的日剂量水平通常将是每个成人每天1pg至10mg，以单次剂量或分次剂量施用。在任何情况下，医师将确定将最适用于任何单个患者的实际剂量并且它将随具体患者的年龄、体重以及响应而变。上述剂量是平均情况的示例。当然，可以有其中需要更高或更低的剂量范围的单个情况，并且这些范围落入本发明的范围内。通常，本发明的组合物和/或药物将含有约2mg/ml至150mg/ml或约2mg/ml至200mg/ml的浓度的本发明的抗体和/或药剂。在一个优选的实施方案中，本发明的药物和/或组合物将含有10mg/ml的浓度的本发明的抗体和/或药剂。
一般来说，在人类中，口服或肠胃外施用本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物是优选的途径，所述途径是最方便的。对于兽医使用来说，本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物是作为可适当接受的制剂根据正常兽医实践来施用的，并且兽医将确定将最适合于具体动物的给药方案和施用途径。因此，本发明提供了一种药物制剂，所述药物制剂包含有效治疗各种病况的量的本发明的抗体和/或药剂(如上文所述和下文进一步所述)。优选地，所述组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物适用于通过选自包括以下各项的组的途径递送：静脉内；肌内；皮下。
我们包括所述受试者可以是哺乳动物或非哺乳动物。优选地，所述哺乳动物受试者是人类或是非哺乳动物，如马、或牛、或羊、或猪、或骆驼、或狗、或猫。最优选地，所述哺乳动物受试者是人类。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述复发性癌症和/或难治性癌症对抗体治疗具有抗性。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述复发性癌症和/或难治性癌症对如(i)中所限定的抗体分子具有抗性。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂阻止或减少存在于靶细胞上的FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合。
如上文所述，Fc受体(包括FcγRIIb)是存在于细胞上的膜蛋白。本领域技术人员将了解的是，存在本领域已知的用于检测蛋白质是否存在于细胞上的方法；例如免疫组织化学、以及使标记有可检测的标记的蛋白质可视化。
通过“存在于靶细胞上的FcγRIIb”，我们包括FcγRIIb是FcγRIIb蛋白质；和/或FcγRIIb存在于靶细胞膜上；和/或FcγRIIb存在于靶细胞膜中。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中特异性结合靶细胞的细胞表面抗原的抗体分子能够以FcγRIIb依赖性方式被内化到靶细胞中，所述抗体分子具有能够结合FcγRIIb的Fc结构域。
如上文所述，Fc受体(包括FcγRIIb)介导抗体分子向细胞中的内化，这可以造成抗体分子的破坏。FcγRIIb介导抗体分子向细胞中的内化的方式将是细胞生物学领域的技术人员已知的。
通过“被内化到靶细胞中”，我们包括所述抗体分子从细胞膜被去除到靶细胞中；和/或所述抗体分子被再循环到靶细胞中；和/或所述抗体分子被内化到靶细胞中并且被破坏；和/或所述抗体分子被包封在靶细胞的内体中；和/或所述抗体分子被内化到靶细胞中并且因此不再具有治疗有效性；和/或所述抗体分子被靶细胞内吞。
将了解的是，抗体分子可以在许多不同的过程中被内化到细胞中。如上文所述，本发明的教导是抗体分子可以经由抗体分子的Fc结构域与FcγRIIb的结合而被内化。然而，将了解的是，抗体分子可以经由另一个过程被内化，如胞饮，所述胞饮是其中细胞外分子可以被被动地摄取到细胞中的过程。抗体分子可以被摄取到细胞中的其它过程将是细胞生物学领域的技术人员已知的。
通过“FcγRIIb依赖性方式”，我们包括所述抗体分子以需要FcγRIIb活性的方式被内化。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中阻止或减少FcγRIIb与所述抗体分子的Fc结构域结合的药剂另外阻止或减少所述抗体分子被内化到靶细胞中。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如果受试者已经接受癌症治疗而没有响应，和/或受试者已经接受癌症治疗，但是所述受试者的癌症在所述治疗期间进展，那么所述难治性癌症被表征为是难治性癌症。
通过“受试者已经接受癌症治疗”，我们包括所述受试者先前已经接受治疗剂的治疗或目前正接受治疗剂的治疗。
我们还包括如果所述受试者先前已经接受治疗剂的治疗，那么该治疗是在之前约一天、或约两天、或约三天、或约四天、或约五天、或约六天、或超过约一周、或超过约两周、或超过约三周、或超过约一个月、或超过约两个月、或超过约三个月、或超过约四个月、或超过约五个月、或超过约六个月、或超过约七个月、或超过约八个月、或超过约九个月、或超过约十个月、或超过约11个月、或超过约一年、或超过约两年、或超过约三年、或超过约4年、或超过约5年、或超过约10年进行的。
除了上述治疗剂之外，医学领域的技术人员还将了解可以用于治疗癌症、和/或复发性癌症、和/或难治性癌症的治疗剂的其它类型和组合；其实例可以见于《医疗保健研究与质量局指南摘要NGC-9392(AgencyforHealthcareResearchandQualityGuidelineSummaryNGC-9392)》,2012年9月；《医疗保健研究与质量局指南摘要NGC-9278(AgencyforHealthcareResearchandQualityGuidelineSummaryNGC-9278)》,2012；McKay等,2012,BritishJournalofHaematology:12046；Hallek等,2008,Blood,111:5446-5456；Wang等,2013,N.Engl.J.Med.,369(6):507-516；Byrd等,N.Engl.J.Med.,369(1):32-42；以及《NCCN非霍奇金淋巴瘤指南(NCCNGuidelinesonNon-Hodgkin'sLymphomas)》,1.2014版中。
通过“接受癌症治疗而没有响应”，我们包括在已经接受癌症治疗之后，所述受试者没有表现出癌症症状的严重程度的降低；和/或所述受试者没有表现出癌症症状数目的减少；和/或所述受试者没有改善的癌症预后；和/或所述受试者没有表现出癌症的诊断标志物的减少。
通过“所述受试者的癌症进展”，我们包括在癌症治疗期间，所述受试者表现出癌症症状的严重程度的增加；和/或所述受试者表现出癌症症状数目的增加；和/或所述受试者有更差的癌症预后；和/或所述受试者表现出癌症的诊断标志物的增加。
通过“表现出”，我们包括所述受试者显示出癌症症状和/或癌症诊断标志物；和/或所述癌症症状和/或癌症诊断标志物可以被测量、和/或被评估、和/或被定量。
对于医学领域的技术人员来说将容易显而易见的是，癌症症状和癌症诊断标志物将是什么以及如何测量和/或评估和/或定量癌症症状的严重程度是降低还是增加、或癌症诊断标志物是减少还是增加；以及如何可以使用那些癌症症状和/或癌症诊断标志物来形成癌症的预后。
通过“在治疗期间”，我们包括所述受试者目前正接受治疗过程、和/或正接受治疗剂、和/或正接受治疗剂的过程。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如果所述受试者先前已经针对癌症接受治疗，但是实现少于部分缓解，那么所述受试者被表征为没有响应。
通过“实现少于部分缓解”，我们包括所述癌症症状或癌症诊断标志物已经基于癌症症状的严重程度的降低、和/或癌症症状数目的减少、和/或改善的癌症预后、和/或癌症诊断标志物的减少被评估和/或被测量和/或被定量；并且与在治疗之前所述癌症症状或癌症诊断标志物相比减少了少于50％。
我们还包括对受试者是否实现少于部分缓解的评估和/或测量和/或定量是基于在停止治疗之后的癌症症状和/或癌症诊断标志物与在开始治疗之前的癌症症状和/或癌症诊断标志物、和/或在治疗期间的癌症症状和/或癌症诊断标志物之间的比较。还包括在受试者被认为已经实现少于部分缓解之前可以进行评估和/或测量和/或定量至少一次、或至少两次、或至少三次、或至少四次、或至少五次、或至少六次、或至少七次、或至少八次、或至少九次、或至少十次、或至少15次、或至少20次。
我们还包括如果与在开始治疗之前的癌症症状和/或癌症诊断标志物、和/或在治疗期间的癌症症状和/或癌症诊断标志物相比，在停止治疗之后所述癌症症状和/或癌症诊断标志物减少了少于约1％、或少于约5％、或少于约10％、或少于约15％、或少于约20％、或少于约25％、或少于约30％、或少于约35％、或少于约40％、或少于约45％、或少于约50％，那么受试者实现少于部分缓解。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如果所述受试者先前已经针对癌症接受治疗并且先前已经对所述治疗作出响应，并且随后复发，那么所述复发性癌症被表征为是复发性癌症。
通过“先前已经针对癌症接受治疗”，我们包括所述受试者先前已经接受治疗剂的治疗，但是该治疗已经停止。因此，我们包括如果用治疗剂进行的治疗在之前至少约一天、或至少约两天、或至少约三天、或至少约四天、或至少约五天、或至少约六天、或超过约一周、或超过约两周、或超过约三周、或超过约一个月、或超过约两个月、或超过约三个月、或超过约四个月、或超过约五个月、或超过约六个月、或超过约七个月、或超过约八个月、或超过约九个月、或超过约十个月、或超过约11个月、或超过约一年、或超过约两年、或超过约三年、或超过约4年、或超过约5年、或超过约10年停止，那么所述受试者先前已经针对癌症接受治疗。
医学领域的技术人员将清楚的是，患者是否已经对治疗作出响应。
通过“先前对所述治疗作出响应”，我们包括在停止治疗之后，有经过评估和/或经过测量和/或经过定量的癌症症状的严重程度的降低、和/或癌症症状数目的减少、和/或改善的癌症预后、和/或癌症诊断标志物的减少。
复发是癌症医学领域中公知的术语，该术语涉及受试者的癌症在所述受试者的癌症先前已经对治疗作出响应之后发生恶化。医学领域的技术人员将清楚的是，癌症何时已经复发。
通过“随后复发”，我们包括在所述受试者先前已经对治疗作出响应之后，所述受试者表现出癌症症状的严重程度的增加；和/或所述受试者表现出癌症症状数目的增加；和/或所述受试者有更差的癌症预后；和/或所述受试者表现出癌症诊断标志物的增加。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如果所述受试者(i)在治疗之后实现至少部分缓解和/或如果所述受试者在治疗之后实现至少完全缓解，但是(ii)在停止所述治疗之后所述受试者的癌症进展，那么所述受试者被表征为随后复发。
通过“在治疗之后完全缓解”，我们包括在停止治疗之后，没有可检测的癌症症状和/或癌症诊断标志物。
我们还包括在一些情况下，如果所述癌症症状和/或癌症诊断标志物在停止治疗之后至少约一天、或至少约两天、或至少约三天、或至少约四天、或至少约五天、或至少约六天、或超过约一周、或超过约两周、或超过约三周、或超过约一个月、或超过约两个月、或超过约三个月、或超过约四个月、或超过约五个月、或超过约六个月、或超过约七个月、或超过约八个月、或超过约九个月、或超过约十个月、或超过约11个月、或超过约一年、或超过约两年、或超过约三年、或超过约4年、或超过约5年、或超过约10年、或约20年、或约30年、或约40年、或约50年是不可检测的，则为在治疗之后完全缓解。最具体来说，我们包括在一定情况下，如果所述癌症症状和/或癌症诊断标志物在停止治疗之后超过约六个月是不可检测的，则为在治疗之后完全缓解。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者随后在停止治疗之后超过约1个月复发。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者随后在停止治疗之后超过约1个月、或超过约2个月、或超过约3个月、或超过约4个月、或超过约5个月、或超过约6个月、或超过约7个月、或超过约8个月、或超过约9个月、或超过约10个月、或超过约11个月、或超过约12个月、或超过约2年、或超过约3年、或超过约4年、或超过约5年、或超过约6年、或超过约7年、或超过约8年、或超过约9年、或超过约10年复发。最优选地，其中所述受试者随后在停止治疗之后超过约6个月复发。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者表现出复发性癌症的特征至少一次、或至少两次、或至少三次、或至少四次、或至少五次、或至少六次、或至少七次、或至少八次、或至少九次、或至少十次。
通过“表现出复发性癌症的特征”，我们包括所述受试者先前已经针对癌症接受治疗并且先前已经对所述治疗作出响应，并且随后复发。
认为癌症可能由于它已经对先前已经被用于治疗所述受试者的癌症的治疗产生抗性而复发。因此，患有复发性癌症的受试者常常使用与先前用于治疗该受试者的癌症的治疗剂不同的治疗剂来治疗。因此，在上文刚刚提到的实施方案中，我们包括在后续每一次受试者表现出复发性癌症的特征时，则使用与先前已经用于治疗所述受试者的治疗剂不同的治疗剂治疗所述受试者；和/或使用与先前已经用于治疗所述受试者的治疗剂相同的治疗剂治疗所述受试者。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述治疗是抗体治疗，例如，如之前的实施方案的(i)中所限定的抗体分子，所述抗体治疗是在不存在如之前的实施方案的(ii)中所限定的药剂的情况下被施用的。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述治疗包括一种或多种治疗剂。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述靶细胞包含升高水平的FcγRIIb表达。
对于分子生物学和细胞生物学领域的技术人员来说将已知的是，升高的FcγRIIb表达水平将是什么以及如何可以测量所述表达。举例来说，除了上述测量FcγRIIb表达的方法之外，FcγRIIb表达水平还可以通过肿瘤活检的免疫组织化学来测量。本领域技术人员将了解的是，存在用于测定FcγRIIb表达水平的多种技术和方法。
通过“包含升高水平的FcγRIIb表达的靶细胞”，我们包括与对照相比，所述靶细胞包含升高水平的FcγRIIb蛋白质和/或所述靶细胞包含升高水平的FcγRIIbmRNA，如下文所述。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中靶细胞上升高的FcγRIIb表达是相对于对照来确定的。
合适的对照将是具有正常水平的FcγRIIb表达的对照。选择正确的对照以及限定FcγRIIb表达的正常水平可能取决于许多变量，如受试者、受试者的靶细胞类型的类型、以及癌症的类型。对于分子生物学或细胞生物学领域的技术人员来说将是显而易见的是，适当的对照和FcγRIIb表达的正常水平将是什么。
通过“对照”，我们包括所述对照是对照细胞；和/或所述对照是来自FcγRIIb表达水平的数据库的信息。我们还包括所述对照细胞是与所述靶细胞不同的细胞类型，和/或是与所述靶细胞相同的细胞类型。我们还包括所述对照细胞来自于对照个体，并且该对照个体可能是所述受试者和/或除所述受试者以外的个体。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述对照包含患有非难治性癌症和/或非复发性癌症的对照个体的对照细胞。
通过“患有非难治性癌症和/或非复发性癌症的对照个体”，我们包括该对照个体患有不是复发性癌症和/或难治性癌症的癌症。我们还包括该对照个体先前已经接受治疗剂治疗至少一次。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者的靶细胞中所述升高的FcγRIIb表达在与对照相比时是至少2倍。
我们还包括所述靶细胞中所述升高的FcγRIIb表达是对照的约10倍、或约20倍、或约30倍、或约40倍、或约50倍、或约60倍、或约70倍、或约80倍、或约90倍、或约100倍、或约200倍、或约300倍、或约400倍、或约500倍、或约600倍、或约700倍、或约800倍、或约900倍、或约1000倍。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述靶细胞是癌细胞。
癌细胞是表现出癌症特征的细胞，也就是说，它表现出一种或多种癌症诊断标志物。细胞生物学和肿瘤学领域的技术人员将清楚的是，所述靶细胞是否是癌细胞。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述靶细胞是B细胞。
B细胞(另外被称为B淋巴细胞)是一种类型的适应性免疫应答细胞，所述细胞与免疫系统的其它细胞的不同之处在于细胞表面上存在B细胞受体。
通过“B细胞”，我们包括血浆B细胞(也被称作效应B细胞)、和/或记忆B细胞、和/或B-1细胞、和/或B-2细胞、和/或边缘区B细胞、和/或滤泡B细胞、和/或调节性B细胞、和/或初始B细胞。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述复发性癌症、和/或所述难治性癌症、和/或所述癌细胞、和/或所述相同的癌症类型、和/或所述癌症选自包括以下各项的组：非霍奇金淋巴瘤；滤泡性淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；套细胞淋巴瘤；慢性淋巴细胞性白血病；小淋巴细胞性淋巴瘤。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一组不同的淋巴瘤的集体名称，它包括：滤泡细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、MALT淋巴瘤、淋巴浆细胞性NHL(也被称为瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinaemia))、小淋巴细胞性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、间变性大细胞淋巴瘤、以及弥漫性混合细胞淋巴瘤等等。
上述癌症中的每一种是公知的，并且所述症状和癌症诊断标志物是被充分描述的，用于治疗那些癌症的治疗剂也是如此。因此，非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、以及小淋巴细胞性淋巴瘤的症状、癌症诊断标志物、以及用于治疗它们的治疗剂将是医学领域的技术人员已知的。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者没有响应、和/或受试者部分缓解、和/或受试者完全缓解、和/或受试者的癌症已经进展是通过测量来自包括以下各项的组的一个或多个来确定的：
(i)淋巴细胞计数；和/或
(ii)中性粒细胞计数；和/或
(iii)血小板计数；和/或
(iv)血红蛋白计数；和/或
(v)肿瘤细胞百分比；和/或
(vi)骨髓淋巴细胞百分比；和/或
(vii)循环淋巴细胞百分比；和/或
(viii)淋巴细胞上生物标志物的存在和/或不存在；和/或
(ix)癌症分期；和/或
(x)组织学检查；和/或
(xi)骨髓检查；和/或
(xii)细胞遗传学检查；和/或
(xiii)淋巴结评价；和/或
(xiv)身体症状；和/或
(xv)脾中癌细胞的减少。
将了解的是，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)以及(xv)涉及“癌症诊断标志物”；并且(xiv)涉及“癌症症状”。
对许多诊断癌症标志物(如“淋巴细胞计数”、“中性粒细胞计数”、“血小板计数”、“血红蛋白计数”、“非典型细胞百分比”、“骨髓淋巴细胞百分比”、以及“循环淋巴细胞百分比”)的评估依赖于对受试者体内细胞和分子的定量。用于定量那些细胞和分子的测定是本领域公知的。
通过“肿瘤细胞”，我们包括赘生性细胞、和/或呈CD19+、CD5+以及CD23+的赘生性细胞。
许多生物标志物可以指示某些类型的癌症。举例来说，慢性淋巴细胞性白血病细胞共表达CD5、CD19、CD20以及CD23。然而，如果与正常B细胞相比，那么CD20和CD79b的水平是更低的。
通过“淋巴细胞上生物标志物的存在和/或不存在”，我们包括术语“存在”包括在与对照B细胞相比时生物标志物的量增加、或有可检测的生物标志物，并且不存在包括在与对照B细胞相比时生物标志物的量减少、或没有可检测的生物标志物。我们还包括对照B细胞可以来自“对照个体”。我们还包括淋巴细胞上生物标志物的存在和/或不存在包括CD5、和/或CD19、和/或CD20、和/或CD23、和/或细胞周期蛋白D1、和/或BCL2、和/或FMC6、和/或CD3、和/或CD10和/或BCL6、和/或CD21、和/或CD45、和/或Ki-67、和/或IRF4/MUM1、和/或MYC、和/或CD30、和/或CD138、和/或EBER-ISH、和/或ALK、和/或HHV8、和/或κ/λ、和/或CD79b的存在、和/或CD20、和/或CD79b、和/或CD10、和/或CD23、和/或BCL6的不存在。
许多癌症的诊断、预后以及进展的临床定义依赖于被称为分期的某些分类。那些分期系统用以分类整理许多不同的癌症诊断标志物和癌症症状以提供癌症的诊断、和/或预后、和/或进展的汇总。对于肿瘤学领域的技术人员来说将已知的是，如何使用分期系统评估癌症的诊断、和/或预后、和/或进展以及应当使用哪些癌症诊断标志物和癌症症状来这样做。
通过“癌症分期”，我们包括Rai分期，它包括0期、I期、II期、III期以及IV期；和/或Binet分期，它包括A期、B期以及C期；和/或AnnArbour分期，它包括I期、II期、III期以及IV期。
已知癌症可以导致细胞形态的异常。这些异常往往可重现地出现在某些癌症中，这意味着检查形态上的这些变化(另外被称为组织学检查)可以用于癌症的诊断或预后。用于将样品可视化以检查细胞的形态以及制备用于可视化的样品的技术是本领域公知的；例如光学显微术或共聚焦显微术。
通过“组织学检查”，我们包括存在小的成熟的淋巴细胞；和/或存在具有细胞质的窄边界的小的成熟的淋巴细胞；存在具有缺乏可识别的核仁的致密核的小的成熟的淋巴细胞；和/或存在具有细胞质的窄边界并且具有缺乏可识别的核仁的致密核的小的成熟的淋巴细胞；和/或存在非典型细胞、和/或核裂细胞、和/或幼淋巴细胞。
公知癌症是细胞的DNA中突变的结果，所述突变可以使得细胞避免细胞死亡或不受控制地增殖。因此，检查这些突变(也被称为细胞遗传学检查)可以是用于评估癌症的诊断和/或预后的有用的工具。这样的一个实例是染色体位置13q14.1的缺失，它是慢性淋巴细胞性白血病的特征。用于检查细胞中的突变的技术是本领域公知的；例如荧光原位杂交(FISH)。
通过“身体症状”，我们包括肝肿大、和/或脾肿大。
通过“受试者没有响应”，我们包括在所述受试者中，在治疗前与停止治疗后之间进行比较时和/或在治疗期间与在停止治疗后和/或治疗期间之间进行比较时，对上文刚刚所述的实施方案中的点(i)、和/或(ii)、和/或(iii)、和/或(iv)、和/或(v)、和/或(vi)、和/或(vii)、和/或(viii)、和/或(ix)、和/或(x)、和/或(xi)、和/或(xii)、和/或(xiii)、和/或(xiv)、和/或(xv)的测量和/或评估没有变化，或即使发生变化，所述变化也是可忽略不计的。
通过“受试者部分缓解”，我们包括对于“淋巴细胞计数”，与在治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，淋巴细胞计数减少至少50％；和/或对于“淋巴结评价”，与在治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，一个或多个淋巴结的尺寸减小至少50％、和/或没有另外的肿大的淋巴结；和/或对于“身体症状”，与在治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，脾的尺寸减小至少50％(与脾肿大有关)，和/或与在治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，肝脏的尺寸减小至少50％(与肝肿大有关)；和/或对于“中性粒细胞计数”，存在不超过1500个细胞/微升；和/或对于“血小板计数”，存在不超过100,000个血小板/微升；和/或与在治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，中性粒细胞计数的数目减少至少50％；和/或对于“血红蛋白计数”，存在不超过11g/dL，和/或与在治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，血红蛋白的量减少至少50％。
通过“受试者完全缓解”，我们包括对于“淋巴细胞计数”，存在最多4000个细胞/微升的细胞计数；和/或对于“淋巴结评价”，淋巴结的直径是最多1.5cm；和/或对于“身体症状”，没有可检测的肝肿大、和/或没有可检测的脾肿大；和/或对于“中性粒细胞计数”，存在不超过1500个细胞/微升；和/或对于“血小板计数”，存在不超过100,000个血小板/微升；和/或对于“血红蛋白计数”，存在不超过11g/dL。
通过“受试者的癌症已经进展”，我们包括对于“淋巴细胞计数”，与在治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，淋巴细胞计数的数目增加至少50％，和/或至少超过5000个细胞/微升；和/或对于“淋巴结评价”，淋巴结肿大到至少1.5cm的直径，和/或与治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，淋巴结的尺寸增加至少50％；和/或对于“身体症状”，出现肝肿大，和/或出现脾肿大，和/或与治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，脾的尺寸增加至少50％(与脾肿大有关)，和/或与治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，肝脏的尺寸增加至少50％(与肝肿大有关)；和/或对于“血红蛋白计数”，血红蛋白水平降低超过20g/L，和/或血红蛋白水平降低到低于100g/L；对于“血小板计数”，与治疗前和/或治疗期间相比，在停止治疗后，中性粒细胞计数的数目减少至少50％，和/或存在最多100,000个血小板/微升。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包括：多肽；或抗运载蛋白(anticalin)；或肽；或抗体；或嵌合抗体；或单链抗体；或适体；或darpin；或Fab、或F(ab')2、或Fv、或ScFv或dAb抗体片段；或IgG2抗体；或IgG4抗体；或IgG2和IgG4的嵌合分子；或包含N297Q突变的抗体变体；或DANA变体抗体；或小分子；或天然产品；或亲和体；或拟肽；或核酸；或肽核酸分子；或脂质；或碳水化合物；或基于模块化框架的蛋白质，包括锚蛋白重复序列蛋白、或犰狳重复序列蛋白、或富含亮氨酸的蛋白质、或三十四肽重复序列蛋白、或设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(ii)中所限定的药剂是特异性结合FcγRIIb的一种或多种抗体分子。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(ii)中所限定的药剂是不包括能够募集效应细胞的结构域的一种或多种抗体分子。
免疫系统包含许多不同的细胞类型，这些细胞类型各自在产生、辅助或维持免疫应答中具有不同的作用。为了发挥它在免疫中的作用，免疫系统的细胞常常将对刺激作出反应，所述刺激常常将引起该细胞被动员到特定的身体部位或靶标(如具有信号的细胞)。免疫系统的一类细胞是效应细胞；其特征和作用将是免疫学领域的技术人员公知的。
通过“效应细胞”，我们包括效应T细胞、和/或效应B细胞(也被称为浆细胞)、和/或效应记忆T细胞、和/或效应记忆CD4+T细胞、和/或效应记忆CD8+T细胞。
通过“能够募集效应细胞的结构域”，我们包括抗体分子上将使效应细胞移动到所述抗体分子的位置的表位和/或抗原。我们还包括能够募集效应细胞的结构域可以是抗体分子的Fc结构域、和/或抗体分子的Fc结构域上的抗原和/或表位。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(ii)中所限定的药剂是一种或多种抗体分子，所述抗体分子是单克隆抗体分子、和/或多克隆抗体分子、和/或双特异性抗体分子。
如上文所述，不同类型和形式的抗体被包括在本发明中，并且将是免疫学领域的技术人员已知的。公知的是，用于治疗目的的抗体常常被改变抗体分子的特性的另外的组分修饰。
因此，我们包括本发明的抗体分子(例如单克隆抗体分子、和/或多克隆抗体分子、和/或双特异性抗体分子)包含可检测的部分和/或细胞毒性部分。
通过“可检测的部分”，我们包括来自包括以下各项的组的一种或多种：酶；放射性原子；荧光部分；化学发光部分；生物发光部分。所述可检测的部分允许抗体分子在体外、和/或体内、和/或离体被可视化。
通过“细胞毒性部分”，我们包括放射性部分；和/或酶，其中所述酶是胱天蛋白酶；和/或毒素，其中所述毒素是细菌毒素或毒液；其中所述细胞毒性部分能够诱导细胞裂解。
我们还包括所述抗体分子可以呈分离形式和/或纯化形式、和/或可以被聚乙二醇化。
在以下实施方案中，SEQIDNO指的是以下克隆中所示的序列。
如上文所述，抗体的CDR与抗体靶标结合。本文所述的每一个CDR的氨基酸分配是依据根据KabatEA等,1991,“有免疫学意义的蛋白质序列(SequencesofProteinsofImmulogicalInterest)”,第5版,NIH出版号91-3242,第xv-xvii页的定义。
含有两个CDR区的分子例如由Vaughan和Sollazzo2001,《组合化学和高通量筛选(CombinatorialChemistry&HighThroughputScreening)》,4:417-430所描述。在第418页(右栏-3我们的设计策略(OurStrategyforDesign))，描述了只包括穿插在框架区内的H1和H2CDR高变区的微型抗体。所述微型抗体被描述为能够与靶标结合。Pessi等,1993,Nature,362:367-9和Bianchi等,1994,J.Mol.Biol.,236:649-59由Vaughan和Sollazzo引用并且更详细地描述了H1和H2微型抗体以及它的特性。在Qiu等,2007,NatureBiotechnology,25:921-9中，证实了由两个连接的CDR组成的分子能够结合抗原。Quiocho1993,Nature,362:293-4提供了“微型抗体”技术的汇总。Ladner2007,NatureBiotechnology,25:875-7说明了含有两个CDR的分子能够保留抗原结合活性。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包含可变重链(VH)，所述可变重链包含以下CDR：
(i)SEQIDNO:51和SEQIDNO:52以及SEQIDNO:53；或
(ii)SEQIDNO:57和SEQIDNO:58以及SEQIDNO:59；或
(iii)SEQIDNO:63和SEQIDNO:64以及SEQIDNO:65；或
(iv)SEQIDNO:69和SEQIDNO:70以及SEQIDNO:71；或
(v)SEQIDNO:75和SEQIDNO:76以及SEQIDNO:77；或
(vi)SEQIDNO:81和SEQIDNO:82以及SEQIDNO:83；或
(vii)SEQIDNO:87和SEQIDNO:88以及SEQIDNO:89；或
(viii)SEQIDNO:93和SEQIDNO:94以及SEQIDNO:95；或
(ix)SEQIDNO:99和SEQIDNO:100以及SEQIDNO:101；或
(x)SEQIDNO:105和SEQIDNO:106以及SEQIDNO:107；或
(xi)SEQIDNO:111和SEQIDNO:112以及SEQIDNO:113；或
(xii)SEQIDNO:117和SEQIDNO:118以及SEQIDNO:119；或
(xiii)SEQIDNO:123和SEQIDNO:124以及SEQIDNO:125；或
(xiv)SEQIDNO:129和SEQIDNO:130以及SEQIDNO:131；或
(xv)SEQIDNO:135和SEQIDNO:136以及SEQIDNO:137；或
(xvi)SEQIDNO:141和SEQIDNO:142以及SEQIDNO:143；或
(xvii)SEQIDNO:147和SEQIDNO:148以及SEQIDNO:149；或
(xviii)SEQIDNO:153和SEQIDNO:154以及SEQIDNO:155；或
(xix)SEQIDNO:159和SEQIDNO:160以及SEQIDNO:161；或
(xx)SEQIDNO:165和SEQIDNO:166以及SEQIDNO:167；或
(xxi)SEQIDNO:171和SEQIDNO:172以及SEQIDNO:173；或
(xxii)SEQIDNO:177和SEQIDNO:178以及SEQIDNO:179；或
(xxiii)SEQIDNO:183和SEQIDNO:184以及SEQIDNO:185；或
(xxiv)SEQIDNO:189和SEQIDNO:190以及SEQIDNO:191。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包含可变轻链(VL)，所述可变轻链包含以下CDR：
(i)SEQIDNO:54和SEQIDNO:55以及SEQIDNO:56；或
(ii)SEQIDNO:60和SEQIDNO:61以及SEQIDNO:62；或
(iii)SEQIDNO:66和SEQIDNO:67以及SEQIDNO:68；或
(iv)SEQIDNO:72和SEQIDNO:73以及SEQIDNO:74；或
(v)SEQIDNO:78和SEQIDNO:79以及SEQIDNO:80；或
(vi)SEQIDNO:84和SEQIDNO:85以及SEQIDNO:86；或
(vii)SEQIDNO:90和SEQIDNO:91以及SEQIDNO:92；或
(viii)SEQIDNO:96和SEQIDNO:97以及SEQIDNO:98；或
(ix)SEQIDNO:102和SEQIDNO:103以及SEQIDNO:104；或
(x)SEQIDNO:108和SEQIDNO:109以及SEQIDNO:110；或
(xi)SEQIDNO:114和SEQIDNO:115以及SEQIDNO:116；或
(xii)SEQIDNO:120和SEQIDNO:121以及SEQIDNO:122；或
(xiii)SEQIDNO:126和SEQIDNO:127以及SEQIDNO:128；或
(xiv)SEQIDNO:132和SEQIDNO:133以及SEQIDNO:134；或
(xv)SEQIDNO:138和SEQIDNO:139以及SEQIDNO:140；或
(xvi)SEQIDNO:144和SEQIDNO:145以及SEQIDNO:146；或
(xvii)SEQIDNO:150和SEQIDNO:151以及SEQIDNO:152；或
(xviii)SEQIDNO:156和SEQIDNO:157以及SEQIDNO:158；或
(xix)SEQIDNO:162和SEQIDNO:163以及SEQIDNO:164；或
(xx)SEQIDNO:168和SEQIDNO:169以及SEQIDNO:170；或
(xxi)SEQIDNO:174和SEQIDNO:175以及SEQIDNO:176；或
(xxii)SEQIDNO:180和SEQIDNO:181以及SEQIDNO:182；或
(xxiii)SEQIDNO:186和SEQIDNO:187以及SEQIDNO:188；或
(xxiv)SEQIDNO:192和SEQIDNO:193以及SEQIDNO:194。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包含选自由以下序列组成的组的可变重链(VH)氨基酸序列：SEQIDNO:3；SEQIDNO:4；SEQIDNO:5；SEQIDNO:6；SEQIDNO:7；SEQIDNO:8；SEQIDNO:9；SEQIDNO:10；SEQIDNO:11；SEQIDNO:12；SEQIDNO:13；SEQIDNO:14；SEQIDNO:15；SEQIDNO:16；SEQIDNO:17；SEQIDNO:18；SEQIDNO:19；SEQIDNO:20；SEQIDNO:21；SEQIDNO:22；SEQIDNO:23；SEQIDNO:24；SEQIDNO:25；以及SEQIDNO:26。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包含选自由以下序列组成的组的可变轻链(VL)氨基酸序列：SEQIDNO:27；SEQIDNO:28；SEQIDNO:29；SEQIDNO:30；SEQIDNO:31；SEQIDNO:32；SEQIDNO:33；SEQIDNO:34；SEQIDNO:35；SEQIDNO:36；SEQIDNO:37；SEQIDNO:38；SEQIDNO:39；SEQIDNO:40；SEQIDNO:41；SEQIDNO:42；SEQIDNO:43；SEQIDNO:44；SEQIDNO:45；SEQIDNO:46；SEQIDNO:47；SEQIDNO:48；SEQIDNO:49；以及SEQIDNO:50。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包含以下CDR氨基酸序列：
(i)SEQIDNO:51和SEQIDNO:52和SEQIDNO:53和SEQIDNO:54和SEQIDNO:55以及SEQIDNO:56；或
(ii)SEQIDNO:57和SEQIDNO:58和SEQIDNO:59和SEQIDNO:60和SEQIDNO:61以及SEQIDNO:62；或
(iii)SEQIDNO:63和SEQIDNO:64和SEQIDNO:65和SEQIDNO:66和SEQIDNO:67以及SEQIDNO:68；或
(iv)SEQIDNO:69和SEQIDNO:70和SEQIDNO:71和SEQIDNO:72和SEQIDNO:73以及SEQIDNO:74；或
(v)SEQIDNO:75和SEQIDNO:76和SEQIDNO:77和SEQIDNO:78和SEQIDNO:79以及SEQIDNO:80；或
(vi)SEQIDNO:81和SEQIDNO:82和SEQIDNO:83和SEQIDNO:84和SEQIDNO:85以及SEQIDNO:86；或
(vii)SEQIDNO:87和SEQIDNO:88和SEQIDNO:89和SEQIDNO:90和SEQIDNO:91以及SEQIDNO:92；或
(viii)SEQIDNO:93和SEQIDNO:94和SEQIDNO:95和SEQIDNO:96和SEQIDNO:97以及SEQIDNO:98；或
(ix)SEQIDNO:99和SEQIDNO:100和SEQIDNO:101和SEQIDNO:102和SEQIDNO:103以及SEQIDNO:104；或
(x)SEQIDNO:105和SEQIDNO:106和SEQIDNO:107和SEQIDNO:108和SEQIDNO:109以及SEQIDNO:110；或
(xi)SEQIDNO:111和SEQIDNO:112和SEQIDNO:113和SEQIDNO:114和SEQIDNO:115以及SEQIDNO:116；或
(xii)SEQIDNO:117和SEQIDNO:118和SEQIDNO:119和SEQIDNO:120和SEQIDNO:121以及SEQIDNO:122；或
(xiii)SEQIDNO:123和SEQIDNO:124和SEQIDNO:125和SEQIDNO:126和SEQIDNO:127以及SEQIDNO:128；或
(xiv)SEQIDNO:129和SEQIDNO:130和SEQIDNO:131和SEQIDNO:132和SEQIDNO:133以及SEQIDNO:134；或
(xv)SEQIDNO:135和SEQIDNO:136和SEQIDNO:137和SEQIDNO:138和SEQIDNO:139以及SEQIDNO:140；或
(xvi)SEQIDNO:141和SEQIDNO:142和SEQIDNO:143和SEQIDNO:144和SEQIDNO:145以及SEQIDNO:146；或
(xvii)SEQIDNO:147和SEQIDNO:148和SEQIDNO:149和SEQIDNO:150和SEQIDNO:151以及SEQIDNO:152；或
(xviii)SEQIDNO:153和SEQIDNO:154和SEQIDNO:155和SEQIDNO:156和SEQIDNO:157以及SEQIDNO:158；或
(xix)SEQIDNO:159和SEQIDNO:160和SEQIDNO:161和SEQIDNO:162和SEQIDNO:163以及SEQIDNO:164；或
(xx)SEQIDNO:165和SEQIDNO:166和SEQIDNO:167和SEQIDNO:168和SEQIDNO:169以及SEQIDNO:170；或
(xxi)SEQIDNO:171和SEQIDNO:172和SEQIDNO:173和SEQIDNO:174和SEQIDNO:175以及SEQIDNO:176；或
(xxii)SEQIDNO:177和SEQIDNO:178和SEQIDNO:179和SEQIDNO:180和SEQIDNO:181以及SEQIDNO:182；或
(xxiii)SEQIDNO:183和SEQIDNO:184和SEQIDNO:185和SEQIDNO:186和SEQIDNO:187以及SEQIDNO:188；或
(xxiv)SEQIDNO:189和SEQIDNO:190和SEQIDNO:191和SEQIDNO:192和SEQIDNO:193以及SEQIDNO:194。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂包含以下氨基酸序列：
(i)SEQIDNO:3和SEQIDNO:27；或
(ii)SEQISNO:4和SEQIDNO:28；或
(iii)SEQISNO:5和SEQIDNO:29；或
(iv)SEQIDNO:6和SEQIDNO:30；或
(v)SEQIDNO:7和SEQIDNO:31；或
(vi)SEQIDNO:8和SEQIDNO:32；或
(vii)SEQIDNO:9和SEQIDNO:33；或
(viii)SEQIDNO:10和SEQIDNO:34；或
(ix)SEQIDNO:11和SEQIDNO:35；或
(x)SEQIDNO:12和SEQIDNO:36；或
(xi)SEQIDNO:13和SEQIDNO:37；或
(xii)SEQIDNO:14和SEQIDNO:38；或
(xiii)SEQIDNO:15和SEQIDNO:39；或
(xiv)SEQIDNO:16和SEQIDNO:40；或
(xv)SEQIDNO:17和SEQIDNO:41；或
(xvi)SEQIDNO:18和SEQIDNO:42；或
(xvii)SEQIDNO:19和SEQIDNO:43；或
(xviii)SEQIDNO:20和SEQIDNO:44；或
(xix)SEQIDNO:21和SEQIDNO:45；或
(xx)SEQIDNO:22和SEQIDNO:46；或
(xxi)SEQIDNO:23和SEQIDNO:47；或
(xxii)SEQIDNO:24和SEQIDNO:48；或
(xxiii)SEQIDNO:25和SEQIDNO:49；或
(xxiv)SEQIDNO:26和SEQIDNO:50。
本发明的药剂还可以包含SEQIDNO1和SEQIDNO2的恒定区(CH)和(CL)。
在另一个实施方案中，所述药剂能够与本文所述的本发明的药剂，例如包含上述实施方案中所示的氨基酸序列(例如SEQIDNO:1-194)的药剂竞争阻止或减少FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域结合。
通过“能够与如本文所限定的药剂(如抗原分子)竞争”阻止或减少FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域结合，我们意指所测试的药剂能够至少部分地抑制或以其它方式干扰如本文所限定的药剂与FcγRIIb结合并且阻止或减少FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域结合。
举例来说，所述药剂可能能够将本文所述的药剂的结合抑制至少约10％；例如至少约20％、或至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约100％和/或将所述药剂阻止或减少FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域结合的能力抑制至少约10％；例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约100％。
竞争结合可以通过本领域技术人员公知的方法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。
ELISA测定可以用于评价表位修饰抗体或阻断抗体。另外的适用于鉴定竞争抗体的方法公开在《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratoryManual)》,Harlow和Lane(其以引用的方式并入本文，例如参见第567至569、574至576、583以及590至612页，1988,CSHL,NY,ISBN0-87969-314-2)中。
本发明的药剂可以包含以下恒定区(CH和CL)：
IgG1-CH[SEQIDNO:1]
l-CL[SEQIDNO:2]
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
本发明的药剂可以包含以下克隆的一个或多个序列：
抗体克隆：1A01
1A01-VH[SEQIDNO:3]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWIRQTPGKGLEWVSRFTISRDNSENTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGQGTLVTVSS
1A01-VL[SEQIDNO:27]
CDR区
CDRH1：DYYMN[SEQIDNO:51]
CDRH2：LIGWDGGSTYYADSVKG[SEQIDNO:52]
CDRH3：AYSGYELDY[SEQIDNO:53]
CDRL1：SGSSSNIGNNAVN[SEQIDNO:54]
CDRL2：DNNNRPS[SEQIDNO:55]
CDRL3：AAWDDSLNASI[SEQIDNO:56]
抗体克隆：1B07
1B07-VH[SEQIDNO:4]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWVRQAPGKGLEWVARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGQGTLVTVSS
1B07-VL[SEQIDNO:28]
CDRH1：SYGMH[SEQIDNO:57]
CDRH2：FTRYDGSNKYYADSVRG[SEQIDNO:58]
CDRH3：ENIDAFDV[SEQIDNO:59]
CDRL1：SGSSSNIGNNAVN[SEQIDNO:60]
CDRL3：WDDRLFGPV[SEQIDNO:62]
抗体克隆：1C04
1C04-VH[SEQIDNO:5]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWVRQAPGKGLEWVSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGQGTLVTVSS
1C04-VL[SEQIDNO:29]
CDRH1：SYAMS[SEQIDNO:63]
CDRH2：SISDSGAGRYYADSVEG[SEQIDNO:64]
CDRH3：THDSGELLDAFDI[SEQIDNO:65]
CDRL1：SGSSSNIGSNHVL[SEQIDNO:66]
CDRL2：GNSNRPS[SEQIDNO:67]
CDRL3：AAWDDSLNGWV[SEQIDNO:68]
抗体克隆：1E05
1E05-VH[SEQIDNO:6]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWVRQVPGKGLEWVARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGQGTLVTVSS
1E05-VL[SEQIDNO:30]
CDRH1：TYAMN[SEQIDNO:69]
CDRH2：VISYDGSNKNYVDSVKG[SEQIDNO:70]
CDRH3：NFDNSGYAIPDAFDI[SEQIDNO:71]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQIDNO:72]
CDRL2：DNNSRPS[SEQIDNO:73]
CDRL3：AAWDDSLGGPV[SEQIDNO:74]
抗体克隆：2A09
2A09-VH[SEQIDNO:7]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWVRQAPGKGLEWVARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTTWGQGTLVTVSS
2A09-VL[SEQIDNO:31]
CDRH1：NAWMS[SEQIDNO:75]
CDRH2：YISRDADITHYPASVKG[SEQIDNO:76]
CDRH3：GFDYAGDDAFDI[SEQIDNO:77]
CDRL1：SGSSSNIGSNAVN[SEQIDNO:78]
CDRL2：GNSDRPS[SEQIDNO:79]
CDRL3：AAWDDSLNGRWV[SEQIDNO:80]
抗体克隆：2B08
2B08-VH[SEQIDNO:8]
2B08-VL[SEQIDNO:32]
CDRH1：DYYMS[SEQIDNO:81]
CDRH2：LIGHDGNNKYYLDSLEG[SEQIDNO:82]
CDRH3：ATDSGYDLLY[SEQIDNO:83]
CDRL1：SGSSSNIGNNAVN[SEQIDNO:84]
CDRL2：YDDLLPS[SEQIDNO:85]
CDRL3：TTWDDSLSGVV[SEQIDNO:86]
抗体克隆：2E08
2E08-VH[SEQIDNO:9]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWIRQAPGKGLEWVSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGWGQGTLVTVSS
2E08-VL[SEQIDNO:33]
CDRH1：DYYMS[SEQIDNO:87]
CDRH2：AIGFSDDNTYYADSVKG[SEQIDNO:88]
CDRH3：GDGSGWSF[SEQIDNO:89]
CDRL1：SGSSSNIGNNAVN[SEQIDNO:90]
CDRL2：DNNKRPS[SEQIDNO:91]
CDRL3：ATWDDSLRGWV[SEQIDNO:92]
抗体克隆：5C04
5C04-VH[SEQIDNO:10]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWVRQAPGKGLEWVARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREWGQGTLVTVSS
5C04-VL[SEQIDNO:34]
CDRH1：NYGMH[SEQIDNO:93]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQIDNO:94]
CDRH3：WRDAFDI[SEQIDNO:95]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQIDNO:96]
CDRL2：SDNQRPS[SEQIDNO:97]
CDRL3：AAWDDSLSGSWV[SEQIDNO:98]
抗体克隆：5C05
5C05-VH[SEQIDNO:11]
5C05-VL[SEQIDNO:35]
CDRH1：TYGMH[SEQIDNO:99]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQIDNO:100]
CDRH3：ENFDAFDV[SEQIDNO:101]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQIDNO:102]
CDRL2：SNSQRPS[SEQIDNO:103]
CDRL3：AAWDDSLNGQVV[SEQIDNO:104]
抗体克隆：5D07
5D07-VH[SEQIDNO:12]
5D07-VL[SEQIDNO:36]
CDRH1：TYGMH[SEQIDNO:105]
CDRH2：VIAYDGSKKDYADSVKG[SEQIDNO:106]
CDRH3：EYRDAFDI[SEQIDNO:107]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQIDNO:108]
CDRL2：GNSNRPS[SEQIDNO:109]
CDRL3：AAWDDSVSGWM[SEQIDNO:110]
抗体克隆：5E12
5E12-VH[SEQIDNO:13]
5E12-VL[SEQIDNO:37]
CDRH1：SYGMH[SEQIDNO:111]
CDRH2：VISYDGINKDYADSMKG[SEQIDNO:112]
CDRH3：ERKDAFDI[SEQIDNO:113]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQIDNO:114]
CDRL2：SNNQRPS[SEQIDNO:115]
CDRL3：ATWDDSLNGLV[SEQIDNO:116]
抗体克隆：5G08
5G08-VH[SEQIDNO:14]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNWVRQAPGKGLEWVARFTMSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGQGTLVTVSS
5G08-VL[SEQIDNO:38]
CDRH1：NYGMH[SEQIDNO:117]
CDRH2：VISYDGSNRYYADSVKG[SEQIDNO:118]
CDRH3：DRWNGMDV[SEQIDNO:119]
CDRL1：SGSSSNIGAGYDVH[SEQIDNO:120]
CDRL2：ANNQRPS[SEQIDNO:121]
CDRL3：AAWDDSLNGPWV[SEQIDNO:122]
抗体克隆：5H06
5H06-VH[SEQIDNO:15]
5H06-VL[SEQIDNO:39]
CDRH1：SYGMH[SEQIDNO:123]
CDRH2：VISYDGSDTAYADSVKG[SEQIDNO:124]
CDRH3：DHSVIGAFDI[SEQIDNO:125]
CDRL1：SGSSSNIGSNTVN[SEQIDNO:126]
CDRL2：DNNKRPS[SEQIDNO:127]
CDRL3：SSYAGSNNVV[SEQIDNO:128]
抗体克隆：6A09
6A09-VH[SEQIDNO:16]
6A09-VL[SEQIDNO:40]
CDRH1：SYGMH[SEQIDNO:129]
CDRH2：VTSYDGNTKYYANSVKG[SEQIDNO:130]
CDRH3：EDCGGDCFDY[SEQIDNO:131]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQIDNO:132]
CDRL2：GNSNRPS[SEQIDNO:133]
CDRL3：AAWDDSLNEGV[SEQIDNO:134]
抗体克隆：6B01
6B01-VH[SEQIDNO:17]
6B01-VL[SEQIDNO:41]
CDRH1：NYGMH[SEQIDNO:135]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQIDNO:136]
CDRH3：DQLGEAFDI[SEQIDNO:137]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQIDNO:138]
CDRL2：DNNKRPS[SEQIDNO:139]
CDRL3：ATWDDSLSGPV[SEQIDNO:140]
抗体克隆：6C11
6C11-VH[SEQIDNO:18]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDWVRQAPGKGLEWVSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGWGQGTLVTVSS
6C11-VL[SEQIDNO:42]
CDRH1：DYGMS[SEQIDNO:141]
CDRH2：AISGSGSSTYYADSVKG[SEQIDNO:142]
CDRH3：GDIDYFDY[SEQIDNO:143]
CDRL1：TGSSSNFGAGYDVH[SEQIDNO:144]
CDRL2：ENNKRPS[SEQIDNO:145]
CDRL3：AAWDDSLNGPV[SEQIDNO:146]
抗体克隆：6C12
6C12-VH[SEQIDNO:19]
6C12-VL[SEQIDNO:43]
CDRH1：SYGMH[SEQIDNO:147]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQIDNO:148]
CDRH3：ERRDAFDI[SEQIDNO:149]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQIDNO:150]
CDRL2：SDNQRPS[SEQIDNO:151]
CDRL3：ATWDSDTPV[SEQIDNO:152]
抗体克隆：6D01
6D01-VH[SEQIDNO:20]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWVRQAPGKGLEWVARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCARWGQGTLVTVSS
6D01-VL[SEQIDNO:44]
CDRH1：SYGMH[SEQIDNO:153]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQIDNO:154]
CDRH3：DHSAAGYFDY[SEQIDNO:155]
CDRL1：SGSSSNIGSNTVN[SEQIDNO:156]
CDRL2：GNSIRPS[SEQIDNO:157]
CDRL3：ASWDDSLSSPV[SEQIDNO:158]
抗体克隆：6G03
6G03-VH[SEQIDNO:21]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGWVRQAPGKGLEWVSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWGQGTLVTVSS
6G03-VL[SEQIDNO:45]
CDRH1：SYGMH[SEQIDNO:159]
CDRH2：GISWDSAIIDYAGSVKG[SEQIDNO:160]
CDRH3：DEAAAGAFDI[SEQIDNO:161]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQIDNO:162]
CDRL2：GNTDRPS[SEQIDNO:163]
CDRL3：AAWDDSLSGPVV[SEQIDNO:164]
抗体克隆：6G08
6G08-VH[SEQIDNO:22]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSWVRQAPGKGLEWVSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASWGQGTLVTVSS
6G08-VL[SEQIDNO:46]
CDRH1：SYGIS[SEQIDNO:165]
CDRH2：GISGSGGNTYYADSVKG[SEQIDNO:166]
CDRH3：SVGAYANDAFDI[SEQIDNO:167]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQIDNO:168]
CDRL2：GDTNRPS[SEQIDNO:169]
CDRL3：AAWDDSLNGPV[SEQIDNO:170]
抗体克隆：6G11
6G11-VH[SEQIDNO:23]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWVRQAPGKGLEWMARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGQGTLVTVSS
6G11-VL[SEQIDNO:47]
CDRH1：SYGMH[SEQIDNO:171]
CDRH2：VISYDGSNKYYADSVKG[SEQIDNO:172]
CDRH3：ELYDAFDI[SEQIDNO:173]
CDRL1：TGSSSNIGAGYDVH[SEQIDNO:174]
CDRL2：ADDHRPS[SEQIDNO:175]
CDRL3：ASWDDSQRAVI[SEQIDNO:176]
抗体克隆：6H08
6H08-VH[SEQIDNO:24]
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNWVRQAPGKGLEWVARFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGQGTLVTVSS
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抗体克隆：7C07
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抗体克隆：4B02
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优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂是能够与如之前的实施方案中所限定的药剂竞争阻止或减少FcγRIIb与抗体分子的Fc结构域结合的药剂。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂阻止或减少FcγRIIb信号转导。
Fc受体可以经由细胞信号转导来调节细胞行为。对于细胞生物学领域的技术人员来说将已知的是，哪些下游细胞信号转导调节因子由FcγRIIb信号转导所激活和/或失活以及使那些细胞信号转导调节因子激活和/或失活将对细胞有哪些影响。
通过“所述药剂阻止或减少FcγRIIb信号转导”，我们包括在FcγRIIb与Fc结构域结合时阻止或减少FcγRIIb信号转导；和/或在FcγRIIb不与Fc结构域结合时阻止或减少FcγRIIb信号转导。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述药剂阻止或减少抗体分子被靶细胞内化。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(i)中所限定的抗体分子与CD20特异性结合。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(i)中所限定的抗体分子是I型CD20抗体。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(i)中所限定的抗体分子是II型CD20抗体。
如上文所述，抗CD20抗体分子可以根据它们是否使CD20重新分布到脂筏中而被指定为I型或II型。这是通过Tx-100不溶性测定或通过蔗糖密度梯度分离和蛋白质印迹法来进行的。这两种方法在Cragg等,Blood2003中描述如下：
1.通过TritonX-100不溶性评估筏缔合抗原
作为对筏微结构域中抗原存在的快速评估，我们利用基于在低温下TritonX-100不溶性的流式细胞术方法。简单地说，将细胞在RPMI/1％BSA中洗涤并且以2.5×106个/毫升重悬。然后将细胞在37℃与10μg/ml的与FITC缀合的mAb一起孵育15分钟，在冷PBS/1％BSA/20mM叠氮化钠中洗涤，然后将样品分成两半。将一半维持在冰上以允许计算100％表面抗原水平，而将另一半在冰上用0.5％TritonX-100处理15分钟以确定保留在不溶性筏级分中的抗原的比例。然后在测定的整个其余部分中将细胞维持在4℃，在PBS/BSA/叠氮化物中洗涤一次，重悬并且通过流式细胞术评估，如上文所详述。使用间接的检测方法获得类似的结果。为了确定靶抗原的筏缔合的组成水平，首先将细胞在冰上用0.5％TritonX-100处理15分钟并且在PBS/BSA/叠氮化物中洗涤，之后结合FITC标记的mAb。为了评估是否有更多的抗原可以通过另外的交联移动到TritonX-100不溶性级分中，如前所述将细胞与FITC-mAb一起孵育，洗涤，然后分成四份。将这些样品中的两份与山羊抗小鼠IgF(ab')2片段一起在冰上孵育15分钟。在洗涤后，将交联样品中的一份和非交联样品中的一份在TritonX-100中裂解并且洗涤，如上文所详述，之后进行流式细胞术。
2.蔗糖密度梯度分离和蛋白质印迹法——脂筏级分的制备和蛋白质印迹法
在37℃将单克隆Ab(1μg/106个细胞)添加到细胞中。在20分钟孵育之后，使细胞沉淀并且在冰冷的含1.0％TritonX-100的MES缓冲盐水(25mMMES(pH6.5)、150mMNaCl、1mM苯甲基磺酰氟、5μg/ml抑肽酶、5μg/ml亮肽素、10mMEDTA)中裂解。然后通过蔗糖密度梯度离心制备脂筏级分。简单地说，将裂解物与等体积的含80％蔗糖的裂解缓冲液混合，用不连续的5％-30％蔗糖密度梯度覆盖，然后以200,000×g离心16小时。收集级分(0.5ml)并且通过蛋白质印迹法分析。将每一个级分的15ml等分试样在2×上样缓冲液中1:1稀释，加热到95℃，持续5分钟并且在15％SDS-PAGE凝胶上分离，之后转移到PVDF膜上并且与一抗(例如小鼠抗CD20、用于检测CD20的克隆7D1或用于鉴定筏级分的抗Lyn兔多克隆抗血清(英国的Serotec公司(Serotec,UK)))孵育，继而与HRP缀合的二抗(阿默舍姆生物科技(英国)有限公司(AmershamBiosciencesUKLtd))一起孵育。使用ECL+plus(阿默舍姆生物科技(英国)有限公司)将印迹可视化。
抗CD20抗体分子可能需要CD20的大环中的AxP基序(奥法木单抗和其它Genmab公司抗体则不需要)。然而，(Niederfellner,G等,2011.Blood118,358-367)表明与I型相比，II型抗体分子与CD20环的略微不同的区域结合。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中I型CD20抗体是利妥昔单抗、或利妥昔单抗生物仿制药、或奥法木单抗。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中II型CD20抗体是奥比妥珠单抗、或托西莫单抗。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中如(i)中所限定的抗体分子是CD52抗体。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述CD52抗体是阿仑单抗。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种试剂盒，其中所述组合物或试剂盒包含一种或多种治疗剂。
优选地，本发明提供了一种用途，其中所述组合物还包含一种或多种治疗剂。
优选地，本发明提供了一种方法，其中还向所述受试者施用一种或多种治疗剂。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者患有难治性癌症或复发性癌症，或所述受试者患有难治性癌症和复发性癌症。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其中所述受试者患有难治性慢性淋巴细胞性白血病或复发性慢性淋巴细胞性白血病，或所述受试者患有难治性慢性淋巴细胞性白血病和复发性慢性淋巴细胞性白血病。
优选地，本发明提供了一种组合物、或一种用途、或一种方法、或一种试剂盒，其基本上如本文参考说明书、和/或实施例、和/或附图所述和/或要求保护。
本说明书中显然是先前已公开的文件的列举或论述不应当一定被视为承认所述文件是现有技术的一部分或是公知常识。
附图说明
现在将参考以下附图描述体现本发明的某些方面的优选的非限制性实施例：
图1(2/2)：hFcγRIImAb(AT10)的治疗作用以及能够区分hFcγRIIB和hFcγRIIA的特异性mAb的产生。(顶部)如箭头所示对异种移植有Daudi细胞(s.c.)的SCID小鼠(5只/组)进行处理(i.p.)。绘制平均肿瘤重量±SEM的图并且使用非配对t检验分析；p值比较单独的利妥昔单抗(Rit)处理组与Rit+AT10处理组(**p≤0.005)。代表性数据(n＝2)。(底部)hFcγRIIBmAb与hFcγRIIB转染的细胞(红线)或hFcγRIIA转染的细胞(蓝线)的结合以及对IC与hFcγRIIB转染的细胞的结合的mAb依赖性抑制(绿线)。还参见图7和图8以及表6。
图6(2/2)：hFcγRIIBmAb6G11被良好耐受并且不产生毒性。进行体外全血消耗测定来评估Rit±WT或N297Q6G11在消耗hFcγRIIB+血液B细胞(左侧图表)、单核细胞(中间图表)或中性粒细胞(右侧图表)方面的效力。示出了平均值(水平线)，每一个点代表单个供体。还参见图14、图18以及图19和表7。
图8：所产生的克隆对hFcγRIIB具有高度特异性。(A)hFcγRIIA氨基酸(aa)序列(顶部)与高度同源的hFcγRIIB蛋白质(底部)相比的比对。差异用红色突出显示，指示了IgG结合位点。(B-D)将hFcγRIIB特异性mAb与PBMC一起孵育，然后通过流式细胞术评估与CD14+ve单核细胞(B)、CD19+veB细胞(C)或CD3+veT细胞(D)的结合。除了2B08和2E08之外，对于所有的克隆均观测到与血液中的CD19+veB细胞的高度和剂量依赖性结合(C)；而与CD14+ve单核细胞的结合则相反(B)。克隆6A09对单核细胞和B细胞这两者显示出交叉反应性。(D)没有mAb对CD3+veT细胞染色。
图10：hFcγRIIBmAb在体外的ADCC活性。(A)将用hFcγRIIBmAb预调理的Raji细胞与从健康供体的外周血液中纯化的NK细胞一起共培养并且评估ADDC活性，如材料和方法部分中所述。该图示出了4次独立实验的平均值±SD。(B)基于A中的结果，在一定浓度范围内进一步测试七种hFcγRIIB特异性mAb的ADCC活性。包括Rit(Rit)作为阳性对照。所有的hFcγRIIBmAb均被证实比Rit表现得更有利，7C07和6G11是表现最好的mAb，甚至是在更低的浓度下也是如此。示出了2次代表性实验中的一次；数据点代表来自一式三份样品的平均值±SD。
图11：用WT或N297QhFcγRIIBmAb染色的人类组织的IHC。将7C07或6G11的WT或N297Q变体添加到从多种组织获得的新鲜冷冻切片中。使用酪胺信号放大(TSA；珀金埃尔默公司(PerkinElmer))放大在没有过氧化氢封闭的情况下检测组织反应性。(A)人类脾脏的7C07染色。显示7C07对窦状隙和血管非特异性染色。(B)将6G11的WT或N297Q变体添加到人类脾脏切片中并且评估结合，如上文所详述。显示这两种形式同样对该组织中的小淋巴细胞染色。(C)对来自如切片上所示的多种人类组织的冷冻保存的横切片进行6G11(1μg/ml)染色，继而进行TSA检测。没有观测到反应性。
图12：无糖基化的N297Q6G11变体缺乏内在的Fc依赖性效应活性并且不能在体外诱导ADDC。将原代人类CLL细胞用6G11的WT或N297Q型式或WThIgG1同种型对照(10μg/ml)调理，然后与NK92细胞共培养，并且评估ADDC活性，如材料和方法部分中所述。不同于WT6G11，N297Q6G11mAb没有内在的Fc介导的效应功能，如通过与isoctrl调理的靶细胞相当的ADCC功效所说明。每一个点代表一名CLL患者；****p≤0.0001，如通过配对斯图登氏t检验(pairedstudent'sttest)所评估。
图14：hFcγRIIB小鼠的产生和表征。(A)将全长hFcγRIIB2从Raji细胞扩增并且经由重叠PCR与从相同的细胞中分离的原生hFcγRIIB启动子连接以产生所示的构建体。(B)在阳性和阴性小鼠品系中通过PCR扩增评估hFcγRIIBTg的表达。(C)产生小鼠，回交并且通过用CD19-PE和hFcγRII(AT10)-FITCmAb染色来对循环血液进行表型分析并且通过流式细胞术评估。(D)使用内部产生的特异性mAb(Tutt等，文稿正在准备中)对从所示的小鼠品系产生的BMDM研究激活性和抑制性mFcγRII和/或hFcγRIIB受体的表达。数据表明在人类转基因存在下激活性和抑制性mFcγR的谱没有补偿性变化。(E)分别对来自所示的WT小鼠或hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠的脾脏的CD19-veCD11b+veNK1.1-veLy6G+ve中性粒细胞评估mFcγRII或hFcγRIIB的表达。示出了3次独立实验的代表性点图。如所预期，mFcγRII在中性粒细胞上表达，但是hFcγRIIB不在中性粒细胞上表达。(F)使用所示的标志物((分别是AT130-2和AT10mAb；红色)；B细胞(B220；顶部图(绿色))和巨噬细胞(F4/80；底部图(绿色)))，通过免疫荧光分析来自WT或hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠脾脏的冷冻切片，并且评估hFcγRIIBTg的表达并且与内源性mFcγRII受体相比较。
图16：CLL细胞通过与基质细胞相互作用受到保护而免受Rit依赖性消耗。
(A)将6-10×107个原代患者CLL细胞同时静脉内和腹膜内转移到免疫缺陷NOD/SCID小鼠体内。在注射后4天-5天时，用1次或2次剂量的10mg/kg的Rit(Rit)或同种型对照处理小鼠。在2天后，将小鼠处死并且通过流式细胞术评估脾脏和腹膜中保留的CLL细胞的数目，之后相对于接受同种型对照的样品归一化。数据显示单次剂量的mAb有效地除去腹膜中的CLL细胞(虚线条柱)，而即使在两次剂量的Rit后，Rit诱导的从脾脏的消耗(实心条柱)仍是不完全的。该图示出了3只-5只小鼠/组的平均值±SEM。经由t检验分析数据；p值比较如所示的组(**p≤0.01；****p≤0.001)。
(B)在接受人类CLL细胞异种移植的小鼠中Rit、6G11或组合的抗肿瘤活性。用1mg/kg-10mg/kg的hCD20mAb(Rit)、hFcγRIIBmAb(6G11)或这两者处理小鼠，并且对保留在脾脏中的CLL细胞％进行计数并且相对于在用isoctrl处理后的比例归一化。示出了来自每一次独立实验的平均值，每一名患者用颜色编码(n＝11名患者)。
(C)如(B)中将来自先前被指定为难治的患者(n＝4；参见表S4)的CLL细胞异种移植，处理并且评估。使用配对单因素方差分析检验分析数据。
(C和D)6G11在体内增强II型hCD20mAbGA101gly除去靶细胞的能力的能力。(C)将CFSE+hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-(靶)脾细胞和mFcγRII-/-(非靶)脾细胞过继转移(i.v.)到WT小鼠体内并且用单独的GA101gly或6G11或它们的组合(0.008mg/kg)处理并且评估血液，如前所述。数据是从2次-3次独立实验合并的。(D)将CFSE+hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-(靶)脾细胞和mFcγRII-/-(非靶)脾细胞过继转移(i.v.)到hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-接受体小鼠体内并且用isoctrl或6G11(20mg/kg)处理，继而用GA101gly(0.04mg/kg)处理并且分析血液，如前所述。每一个点描绘了来自单个小鼠的结果，平均比率由水平线指示。(B、C、F以及G)使用单因素方差分析检验分析数据(*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；以及****p≤0.0001)。
(底部图)在hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠(4只小鼠/组；平均值±SD)中评估WT6G11(20mg/kg)对循环单核细胞和中性粒细胞的消耗。
图19：体外全血和稀释血液(20％v/v)细胞因子释放测定。在37℃将来自3名健康志愿者的(A)新鲜的或(B)5×稀释(在无血清CTL培养基中)的肝素化的血液用10μg/ml的所示的mAb处理24小时，之后收集上清液进行后续的分析。通过MSD定量细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α以及IFN-γ)。每一个点指示单个供体(n＝3)。
具体实施方式
实施例
实施例1：实验数据
概要
治疗性抗体已经使癌症治疗发生转变，从而通过结合免疫系统而开启了新的作用机制。令人遗憾的是，治愈很少发生并且患者显示出内在抗性或获得性抗性。在此，我们证实了靶向和阻断人类(h)FcγRIIB的治疗潜能，所述FcγRIIB是牵涉到免疫细胞脱敏和肿瘤细胞对抗体药物的抗性的受体。FcγRIIB阻断抗体阻止CD20特异性抗体利妥昔单抗内化，从而使细胞表面可及性和免疫效应细胞介导的体外和体内抗肿瘤活性达到最大限度。在完全同基因的hFcγRIIBTg小鼠模型中，hFcγRIIBmAb增强利妥昔单抗的B细胞消耗。在评估人类慢性淋巴细胞性白血病(CLL)肿瘤细胞从易形成抗性的基质隔室的消耗的小鼠模型中，与利妥昔单抗共同施用改善了目标响应和完全响应，包括用来自复发性/难治性患者的CLL细胞进行的实验。首选的候选hFcγRIIB特异性抗体6G11被证实在体内具有良好的靶上免疫反应性、有利的药物代谢动力学并且没有不良作用而与利妥昔单抗组合有叠加/协同活性。这些数据支持了对这种hFcγRIIB特异性mAb进行进一步临床研发以用于B细胞淋巴增殖性病症的免疫治疗。
引言
一般来说，生物治疗，特别是单克隆抗体(mAb)是一类不断扩展的治疗剂1。它们使癌症治疗发生巨大变化并且已经成为除了常规化疗以外用于几种恶性肿瘤的护理标准。十多年来，我们已经知晓治疗性mAb的大部分活性取决于它们与Fcγ受体(FcγR)的相互作用。确切地说，它是FcγR的相对表达水平、亲和力以及活性，这解释了IgG的大部分的治疗活性(2,3中所综述)。更不为人所知的是对抗体药物的内在抗性或获得性抗性的潜在机制。虽然诸如CD47的‘别吃我(don't-eat-me)’信号已经被证实限制抗体介导的效应细胞抗癌活性4，但是它们的临床重要性的证据仍处在早期阶段。随着正被开发用于治疗几种类型的癌症的抗体治疗的数量不断增加，正日益需要了解癌细胞对这些治疗的抗性以及开发药物来克服它们。
由于几种抗癌mAb依赖于结合抗体依赖性免疫细胞介导的抗肿瘤机制来产生临床前功效5-8和临床功效9-11，因此特别需要了解和防止针对这些共同抗体效应机制的抗性机制。
人类(h)CD20特异性mAb利妥昔单抗是最先被批准用于癌症免疫治疗的，并且因而已经被广泛施用于患有表达CD20的B细胞癌的患者，所述B细胞癌包括滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、以及套细胞淋巴瘤(MCL)(12中所综述)。有趣的是，虽然利妥昔单抗在FL和DLBCL中是有效的，其中它改善了总体存活率，但是在CLL和MCL中只看到不太大的响应。此外，甚至是在利妥昔单抗响应性淋巴瘤内，一些个体在首次治疗时仍显示出抗性或变得对含有利妥昔单抗的联合治疗具有抗性，从而使得它成为研究mAb抗性机制的理想系统。
材料和方法
动物和细胞
人类(h)CD20Tg、γ-链-/-和小鼠(m)FcγRIIB-/-小鼠先前已经被描述(Beers等,2008)，它们具有通过PCR和/或流式细胞术确认的基因型。根据内政部准则将小鼠饲养和维持在当地的设施中。动物实验是通过当地伦理委员会批准的并且是依照内政部许可证PPL30/1269和M90-11进行的。人类(h)CD20Tg、γ-链-/-和FcγRIIB-/-小鼠先前已经被描述15，它们具有通过PCR和/或流式细胞术确认的基因型。十周至十二周大的雌性BALB/c和C57BL/6小鼠是由哈伦英国有限公司(HarlanUKLimited)(英国牛津的布莱克索恩(Blackthorn,Oxon,UK))供应的并且被维持在当地的动物设施中。CB-17SCID小鼠购自查尔斯河公司(CharlesRiver)，然后被饲养和维持在当地的动物设施中。对于用原代肿瘤细胞进行的异种移植研究(参见下文)，6周-8周大的雌性NODSCID小鼠是由Taconic公司(丹麦的博姆霍尔特(Bomholt,Denmark))供应的并且被维持在当地的设施中。
临床样品
使用临床样品的伦理批准是由南安普顿大学医院NHS信托(SouthamptonUniversityHospitalsNHSTrust)从南安普顿和西南汉普郡研究伦理委员会(SouthamptonandSouthWestHampshireResearchEthicsCommittee)或由斯科讷大学医院(UniversityHospital)的伦理委员会(EthicsCommittee)获得的。知情同意书是根据《赫尔辛基宣言(DeclarationofHelsinki)》提供的。样品是从人体组织管理局(HumanTissueAuthority)许可的南安普顿大学(UniversityofSouthampton)癌症科学单位组织库(CancerScienceUnitTissueBank)发放的或经由隆德的斯科讷大学医院(UniversityHospital,Lund)的血液科(DepartmentofHematology)和肿瘤科(DepartmentofOncology)获得的。CLL样品和MCL样品是作为单细胞悬浮液来评估的，所述单细胞悬浮液已经经过分离、Ficoll纯化并且冷冻保存以用于后续的分析或新鲜用于异种移植研究中。
细胞培养
在补充的RPMI(含有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸盐、100IU/ml青霉素和链霉素以及10％FCS[Myoclone公司]的RPMI)(苏格兰佩斯利的GIBCOBRL公司(GIBCOBRL,Paisley,Scotland))中进行细胞培养。小鼠脾B细胞是通过使用MACSB细胞分离试剂盒(英国的美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec,UK))进行阴性选择来纯化的并且培养在相同的培养基中。细胞系是从ECACC获得的并且维持在无抗生素的补充的RPMI培养基中。正常人外周B细胞是通过使用MACSB细胞分离试剂盒(英国的美天旎生物技术公司)进行阴性选择而纯化的。
BMDM是由从小鼠的股骨和胫骨的骨髓中分离的细胞产生的，如先前所报道17。简单地说，将骨髓细胞培养在富含10％FCS、2mM谷氨酰胺和1mM丙酮酸盐、青霉素和链霉素(各自是100μg/ml)以及20％L929细胞条件培养基(含有M-CSF)的RPMI1640(英国佩斯利的生命技术公司-英杰公司(LifeTechnologiesInvitrogen,Paisley,U.K.))中。将细胞在使用前在37℃、5％CO2下培养10天-14天。通过形态学检查和/或针对CD11b和F4/80的表达进行流式细胞术来常规地确认巨噬细胞分化。
抗体和试剂
mAb通常是由杂交瘤或稳定转染的CHO-k1细胞的培养上清液产生的。在蛋白A上纯化IgG，通过电泳(BeckmanEP系统；贝克曼公司(Beckman))评估纯度以及通过HPLC确认没有聚集。如先前所述产生F(ab')2片段18。hFcγRIImAbAT10如先前所述19。利妥昔单抗是由南安普顿综合医院肿瘤学药房赠予的或购自瑞典隆德的大学医院药房(UniversityhospitalPharmacy)。使用针对磷酸化的hFcγRIIB的抗体(克隆EP926Y)(美国的傲锐东源公司(Origene,US))和α-微管蛋白(美国的细胞信号转导公司(CellSignaling,US))进行免疫印迹法。使用AF647标记的IgG1、抗CD3-PE、抗CD19-perCp-Cy5.5以及抗CD56-AF488(碧迪生物科技公司(BDBiosciences))标记PBMC。对于PBMC免疫表型分析，将使用zenon标记试剂盒(分子探针公司(MolecularProbes))用PE标记的FcγRIIBmAb与抗CD3-FITC、抗CD19-PerCP-Cy5.5以及抗CD56-APC结合使用。
流式细胞术
荧光缀合的mAb购自碧迪生物科技公司、eBiosciences公司、AbDSerotec公司或内部制备。流式细胞术如先前所述20，在FACScan、FACSCalibur或FACSCantoII上评估样品，用CellQuestPro或FACSDiva分析数据(所有均来自碧迪生物科技公司)。
hFcγRIIBmAb的产生
阻断免疫复合物(IC)结合
通过将对FITC具有特异性的hIgG1与FITC-BSA-生物素或FITC-BSA以10:1的摩尔比混合形成IC。在使用前将混合物在室温预孵育1小时。将大肠杆菌表达的特异性结合FcγRIIA和FcγRIIB的ScFv克隆的上清液(10μl)添加到表达FcγRIIA和FcγRIIB的CHO-k1细胞中并且使其结合1小时。添加3nM的IC。使用StrepAlexaFluor(AF)-647(英国的生命技术公司)，继而使用流式细胞术检测结合的IC，并且将阻断定量为AF674信号的损失。
抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
基本上如先前所详述来进行吞噬测定(ADCP)23。在成熟为巨噬细胞之后，使用冰冷的PBS或Accutase(西格玛公司)或胰蛋白酶/EDTA(英国的生命技术公司)收集细胞并且以5×104个细胞/孔重新接种到96孔板中并且在37℃孵育2小时-4小时或过夜。随后，在37℃将CLL细胞用5μM的羧基荧光素丁二酰亚胺基酯(CFSE，分子探针公司)标记15分钟。在洗涤后，将CLL细胞与10μg/ml的一种或多种调理mAb一起孵育30分钟并且之后以5:1的比率添加到巨噬细胞培养物中。在1小时之后，利用刮擦收集细胞并且在冰上用APC标记的CD206(碧迪生物科技公司)或hFcγRIIImAb(3G8，内部)染色15分钟以区分MDM。收集细胞并且通过流式细胞术用所收集的最少5000个巨噬细胞分析。染色双阳性的细胞的百分比被确定为吞噬潜能的量度。对吞噬作用的确认是常规地通过共聚焦显微术提供的23。
以两种方式进行ADCC测定：使用从健康志愿者的外周血液中MACS分离(德国的美天旎生物技术公司)的原代CD56+veNK细胞；或被稳定转染以表达CD16-158V等位基因以及GFP的NK-92细胞系(购自加利福尼亚州圣地亚哥的Conkwest公司(Conkwest,SanDiego,CA))24。在使用原代NK细胞效应子的测定中，将靶细胞与1μg/ml-10μg/ml的mAb一起预孵育30分钟，之后与NK细胞混合。以20:1效应子:靶细胞比率将细胞在含有10mMHEPES缓冲液、1mM丙酮酸钠以及10％FBS(所有均来自Gibco公司)的RPMI1640+GlutaAMX培养基(生命技术公司)中孵育3小时-4小时。使用CellaTOX试剂盒(细胞技术公司(CellTechnologyInc))根据制造商的说明书测量裂解，并且在Victor2V光度计中对所得的生物发光进行读数。在使用NK细胞系时，将NK细胞与靶标一起以1:1至5:1过量孵育4小时并且通过流式细胞术测定裂解。简单地说，在孵育结束时，在暗处将细胞悬浮液与9nMSYTOX红色死细胞染色剂(生命技术公司)一起孵育20分钟，然后通过流式细胞术测定细胞。
内化测定和AF488标记
蛋白质印迹法
如先前所述进行蛋白质印迹法26。简单地说，将2.5-5×106个细胞处理，洗涤并且在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的混合物的onyx缓冲液中裂解。然后通过SDSPAGE分离样品并且将蛋白质立即转移到PVDF膜上。将膜用5％脱脂奶粉封闭，与适当稀释的一级抗体孵育，洗涤，然后与辣根过氧化物酶缀合的抗兔IgG或抗小鼠IgG(英国的西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich,UK))孵育。通过与增强化学发光剂(ECL；英国的通用电气医疗公司)孵育并且对感光胶片(HyperfilmECL；英国的通用电气医疗公司)曝光来使条带可视化。使用ImageJ软件，按照制造商的说明书进行光密度测定。
体内免疫治疗
过继转移测定：如先前所详述(Beers等,2010b)，将约2×107个脾细胞/毫升分别用5μM和0.5μM的CFSE染色成靶或非靶，洗涤，以1:1比率组合并且静脉内注射到接受体小鼠体内(约5×106个细胞/小鼠)。然后在第1天和/或第2天对小鼠进行静脉内和/或腹膜内注射并且在1天后处死以使用流式细胞术检查血液白细胞和脾白细胞。
原代人类异种移植模型：收集来自处于白血病阶段的CLL或MCL患者的血液样品并且将所述血液样品在收集的24小时内用于异种移植研究。简单地说，使用FicollPaquePLUS分离PBMC，并且在充分洗涤之后，将细胞以3-5×108个细胞/毫升重悬在无菌PBS中。在静脉内注射对应于6-10×107个细胞/小鼠的200μl细胞悬浮液之前1小时-5小时，用1Gy对小鼠进行辐照。在细胞注射之后第4天-第5天时，用1mg/kg-10mg/kg的hCD20mAb、hFcγRIImAb或这两者处理小鼠。在2天-3天后小鼠接受第二次注射并且在2天-3天后处死。将脾脏分离，分成两半，一半冷冻在OCT中并且使另一半变成单细胞悬浮液。之后，使用裂解缓冲液(Gibco公司)将血红细胞裂解，之后在冰上与细胞表面染色mAb一起孵育30分钟。经由hCD5和hCD19染色(碧迪生物科技公司)将人类细胞鉴定和定量为hCD45阳性和白血病细胞。
体内白细胞消耗
体内PD、PK以及免疫原性
使用定性和半定量ECL免疫测定来检测小鼠血清中针对6G11的MAHA的存在。将样品在含有生物素和磺基-标签标记的6G11的测定缓冲液中稀释。在孵育后，将样品转移到预封闭的链霉亲和素板中。使用基于MSD的技术评估信号，发光信号与样品中存在的抗6G11的水平成正比。使用亲和纯化的山羊抗6G11血清来制备阳性对照样品。
体内药效动力学(PD)、药物代谢动力学(PK)、最低预期生物效应水平(MABEL)以及免疫原性研究
单次剂量PD、PK以及MABEL：向年龄和性别匹配的hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠注射单次剂量的1mg/kg、10mg/kg或100mg/kg的WT6G11，从而研究以10mg/kg剂量进行的静脉内和腹膜内这两种施用途径(图17A)。在注射后立即以及在终止前最多168小时内采集连续的血液样品。彻底检查动物的任何痛苦、体重减轻、毒性或病变的体征。如下研究hFcγRIIB+veB细胞的消耗(PD)和其它参数(例如6G11PK和小鼠抗人类抗体[MAHA])。
6G11PK分析：使用ECL免疫测定来测定小鼠血清中6G11的浓度。将绵羊抗hIgG(theBindingSite公司)或山羊抗hλ(AbDSerotec公司)(在利妥昔单抗存在下)包被到96孔MSD板上，然后使用0.45％鱼胶封闭。通过后续添加生物素化的抗6G11多克隆山羊血清和链霉亲和素-磺基标签(MesoScaleDiagnostics公司，MSD公司)来检测6G11mAb，从而允许任何未结合的物质被洗掉。添加含有三聚胺的读数缓冲液T(MSD公司)，并且在施加电压时，与6G11缔合的sTag产生化学发光信号。通过与对于6G11产生的已知的标准曲线相比较来对血清中mAb的水平进行定量。
体外全血消耗测定
将新鲜的肝素化的人类血液在CTL培养基(德国的细胞技术有限公司(CellTechnologyLimited,Germany))中5×稀释，并且与20μg/mlRit和/或WT或N297Q6G11一起接种到96孔板中；或保持未处理24小时，之后收集细胞并且分别用抗人类CD3-PerCP-Cy5.5/FITCmAb、CD19-PEmAb、CD14-APCmAb以及CD66b-FITCmAb染色以针对流式细胞术鉴定T细胞、B细胞、单核细胞以及中性粒细胞。计算白细胞子集相对于CD3+细胞的比率。
表3
免疫原性测定(MAHA)：使用定性和半定量ECL免疫测定来检测小鼠血清中针对WThIgG16G11的MAHA的存在。将样品在含有生物素和磺基-标签标记的6G11的测定缓冲液中稀释。在孵育后，将样品转移到预封闭的链霉亲和素板中。添加含有三聚胺的读数缓冲液T(MSD公司)并且使用基于MSD的技术评估信号，发光信号与样品中存在的抗6G11的水平成正比。使用亲和纯化的山羊抗6G11血清来制备阳性对照样品。
体外细胞因子释放测定
通过Lymphoprep(挪威奥斯陆的Axis-Shield公司(Axis-Shield,Oslo,Norway))密度离心来纯化PBMC。将细胞在高密度培养28(1×107个/毫升)下在24孔板中在无血清CTL培养基(德国的细胞技术有限公司)中以高密度(1.5毫升/孔)预孵育48小时。随后将细胞洗涤，重悬在无血清CTL培养基(1×106个/毫升)中并且接种到用0.02μg/ml或1μg/mlOKT3预包被的或未处理(NT)的96孔板(100微升/孔)中。添加10μg/ml浓度的hFcγRIIBmAb(克隆6G11)的WT和N297Q变体或同种型匹配对照mAb(hIgG1)并且将细胞再孵育48小时。通过MSDV-Plex测定(美国罗克维尔的MesoScaleDiscovery公司(MesoScaleDiscovery,Rockville,USA))根据制造商的说明书在经过处理的PBMC上清液中对细胞因子(IL-6、IL-10、IFN-γ以及TNF-α)进行定量。
免疫组织化学(IHC)
统计分析
为了比较体外实验组之间的差异，进行双尾t检验分析。为了评估体内实验组之间的存活差异，产生卡普兰-迈耶曲线(KaplanMeiercurve)并且通过对数秩次检验分析。对于含有超过两组的体内实验，使用双因素或单因素方差分析。对于体内目标响应或完全响应的差异，使用卡方检验。使用GraphPadPrism软件(用于Windows的版本5)进行统计分析。
产生表达hFcγRIIB和hCD20的转基因小鼠
通过重叠PCR反应，使用靶向不同的外显子和内含子连接的引物由Raji基因组DNA和cDNA构建hFcγRIIB2转基因。表达盒包括hFcγRIIB启动子22、外显子1/2、内含子2-3以及外显子3-7(2.4kb)并且最初经由NotI和XbaI位点克隆到pcDNA3(英杰公司)中并且与载体的BGH多聚腺苷酸化序列连接。构建体(包括多聚腺苷酸化序列)是3517bp长并且经由NotI和SmaI位点将所述构建体进一步亚克隆到载体pBC-SK(Stratagene公司)中。通过流式细胞术，使用AT10-FITC在瞬时转染的IIA1.6细胞中确认构建体的功能表达。将缺少载体序列的纯化的表达盒显微注射到FVB/N合子的雄性原核中。通过PCR(扩增来自从耳廓尖提取的基因组DNA的cDNA片段的外显子3-7)或使用AT10-FITC对外周血液进行流式细胞术来筛选Tg小鼠。使所得的Tg阳性首建者与C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠回交>10代。通过与小鼠FcγRIIB-/-小鼠杂交产生缺少相应的小鼠受体的hFcγRIIBTg小鼠。然后使所得的小鼠与hCD20Tg小鼠杂交以产生hCD20×hFcγRIIB+/-×mFcγRIIB-/-后代。
表面等离子体共振
使用BIAcoreT100分析仪(英国的通用电气医疗公司)来确定hFcγRIIBmAb的结合亲和力，如别处所述25。根据制造商的说明书，使用标准胺偶联将mAb固定到CM5传感器芯片(英国的通用电气医疗公司)上。注入可溶性hFcγRIIB(0.16nM-100nM；英国的R&D系统公司)5分钟并且监测解离10分钟。监测与对照流动池结合的背景并且自动扣除。使用BIAcoreT100评价软件从1:1结合模型计算KD值。
[重量＝(长度×宽度2)/2]
静脉内细胞系异种移植模型：在第0天向SCID小鼠(6只/组)静脉内注射2.5×106个Raji细胞(英国的碧迪生物科技公司)，随后在第7天、第14天、第21天以及第28天每周一次用治疗性mAb处理最多4次。通过针对任何瘫痪体征检查小鼠来定期监测肿瘤生长。
将新鲜或5×稀释(在无血清CTL培养基中)的肝素化的血液培养在96孔板(U形底)中并且在37℃用10μg/mlmAb处理24小时，之后收集上清液以进行后续的分析。通过MSDV-Plex测定(美国罗克维尔的MesoScaleDiscovery公司)，根据制造商的说明书在经过处理的全血上清液或稀释的血液上清液中对细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ以及TNF-α)进行定量。
荧光显微术
在干冰床上将用于切片的组织冷冻在置于异戊烷中的OCT培养基(RALamb，ThermoShandon公司)中。将10μm的冷冻切片在丙酮中固定，用5％正常山羊血清封闭并且与针对hFcγRII/CD32(克隆AT10，内部产生)、mFcγRII/CD32(克隆AT130-2，内部产生29)、B细胞(大鼠抗小鼠CD45R/B220；英国的BDPharmingen公司)、滤泡树突状细胞(大鼠抗小鼠FDC；英国的BDPharmingen公司)以及巨噬细胞(大鼠抗小鼠F4/80；英国的AbDSerotec公司)的mAb一起孵育，继而与DyLight594缀合的山羊抗hIgG(英国剑桥的艾博抗公司(Abcam,Cambridge,UK))和AF488缀合的山羊抗大鼠IgG(英国的生命技术公司)一起孵育。将切片封固在Vectashield(英国的载体实验室公司(VectorLaboratories,UK))中，并且使用装备有在CellB软件下运行的CC12彩色摄像机的CKX41倒置显微镜反射荧光系统，使用PlanAchromat10×0.25物镜(所有均来自英国的奥林帕斯公司(Olympus,UK))采集图像。将RGB图像文件(TIFF)传输到AdobePhotoshop(CS6)中，并且将红/绿图像叠加进行对比度拉伸以使用整个灰度。
中性粒细胞染色方案
从年龄和性别匹配的C57BL/6、mFcγRII-/-以及mFcγRII-/-×hFcγRIIb+/-小鼠采集血液样品或脾脏。通过穿过100μm细胞过滤器(碧迪公司)将脾脏匀浆，然后在完全RPMI中洗涤并且重悬在5ml的PBS中，每管使用200μl的细胞悬浮液以进行流式细胞术。将样品用10μg/ml的抗小鼠FcγRII(AT130-2F(ab')2-FITC)、抗人类FcγRII(AT10F(ab')2-FITC)或无关对照(3G8F(ab')2-FITC)(所有均是内部产生和标记的)加上以下各项来染色：抗小鼠CD19(1D3-PE，内部)、抗小鼠NK1.1(PK136-AlexaFluor647)、抗小鼠CD11b(M1/70-太平洋蓝)、抗小鼠CD11c(N418-PE-Cy7)、抗小鼠Ly-6-G(1A8-APC-Cy7)、抗小鼠Ly-6C(HK1.4-PerCP-Cy5.5；除非另有说明，否则所有均来自BioLegend公司)。将细胞在4℃染色30分钟，然后添加1ml的红细胞裂解缓冲液(英国的AbDSerotec公司)，将细胞离心，然后洗涤一次并且在FACsCanto上分析。排除碎片和CD11c高细胞，中性粒细胞是CD19-CD11b+NK1.1-Ly-6G+。
结果
对hFcγRIIB的Fc结合域具有特异性的mAb的产生和表征
最近已经报道在一些淋巴瘤患者中对利妥昔单抗(一种I型CD20mAb)的抗性可以部分地通过它由肿瘤的内化来解释并且靶B细胞表面上抑制性FcγRIIB/CD32B的表达促进这一过程13,23。与这一假设相一致，体内共同施用AT10与利妥昔单抗在其中hCD20和hFcγRIIB在肿瘤上共表达的两种不同的淋巴瘤异种移植模型中产生了叠加/协同抗肿瘤响应(图7)。
表1：hFcγRIIAmAb和hFcγRIIBmAbEC50数据
表2：所选择的hFcγRIIBmAb克隆的Biacore亲和力和亲合力数据
拮抗性hFcγRIIBmAb阻断利妥昔单抗内化
将hFcγRIIB+veB细胞与利妥昔单抗一起孵育会经由hFcγRIIB诱导抑制性信号转导，并且与hFcγRIIB细胞质ITIM基序的磷酸化有关31-33。我们基于这种受体的免疫抑制功能推测能够阻止CD20内化并且阻断hFcγRIIB激活/磷酸化的mAb将具有治疗意义。我们因此针对在非霍奇金淋巴瘤RajiB细胞中调节FcγRIIB磷酸化的能力对14种hFcγRIIB特异性mAb进行筛选。为了以可变域依赖性方式评估抗体介导的作用，我们工程化了抗体变体，所述抗体变体在它们的恒定区中携带N297Q突变，不能经由它们的恒定Fc结构域与FcγR结合(参见下文)34。用hFcγRIIBmAb短期处理(30分钟)Raji细胞产生了两种不同的响应；诱导hFcγRIIBITIM的高水平磷酸化的mAb(例如克隆5C04和6G08)以及几乎没有作用或没有作用的mAb，如克隆6G11和7C07(图2A)。用原代CLL细胞、扁桃体、以及单核细胞观测到类似的观测结果(图9B和9C，并且数据未示)。这些数据证实成功地产生了能够阻断免疫复合物与hFcγRIIB结合而不激活这种受体的hFcγRIIBmAb。
拮抗性hFcγRIIBmAb诱导Fc:FcγR依赖性细胞毒性并且阻断利妥昔单抗内化，从而在体外引出强效的抗肿瘤活性
一些mAb的拮抗作用保留在与表达激活性FcγR的免疫细胞有效结合的WThIgG1形式中的发现表明这些mAb可能具有内在的Fc:FcγR依赖性抗肿瘤活性。我们因此针对这些作用筛选我们的hFcγRIIBmAb。将经过调理的靶Raji细胞与原代NK细胞一起孵育证实了拮抗性mAb7C07和6G11还具有最高的细胞毒性活性，所述细胞毒性活性大于由利妥昔单抗本身所引出的活性(图10A和B)。在已经确定这两种克隆具有最高的亲和力、最强的阻断利妥昔单抗内化和引出ADCC的活性的情况下，我们随后评估它们与一组已知表达FcγR的人类和动物组织的结合。克隆7C07和6G11这两者对人类脾脏和扁桃体中的淋巴细胞特异性染色(图3A，并且数据未示)。7C07和6G11均不与食蟹猴、大鼠、兔或小鼠的淋巴细胞反应，这表明这些mAb对其它物种的FcγRIIB没有交叉反应性(图3A，并且数据未示)。然而，克隆7C07还对来自人类和其它物种的脾脏的窦状隙和淋巴结组织染色，但是6G11不是这样，这表明不希望有的交叉反应性(图3A和图11A)。WT和N297QmAb被证实同等染色(图11B)，并且没有观测到另外的意想不到的对其它人类组织的交叉反应性(图11C)。基于这一反应性谱，选择克隆6G11作为我们的首选临床候选者。
在ADCC、PCD以及ADCP测定中，使用一组广泛的原代患者CLL样品进一步研究6G11的内在细胞毒性活性。在每一个测定中显示出显著的活性，所述活性的水平显著大于用利妥昔单抗所观测到的活性(图3B-D)。此外，在使用表达hFcγRIIIA的高亲和力变体或低亲和力变体(分别是158V或158F)的NK细胞效应子进行的测定中，6G11在诱导细胞死亡方面比利妥昔单抗更有效(图3E)。
随后，我们研究6G11阻止利妥昔单抗从CLL细胞表面内化的能力。6G11的WT和N297Q变体(本身缺乏内在的Fc依赖性效应活性；图12)这两者能够显著阻止利妥昔单抗内化(图3F)。有趣的是，不同于CD20，并且如先前所报道17，在直接或间接评估时，WT或N297QhIgG1mAb(6G11或AT10)与CLL细胞表面上hFcγRIIB的结合没有引起高水平的hFcγRIIB内化(图3G以及图13A和B)。
为了阐明6G11是否还可以通过阻止利妥昔单抗内化来增强利妥昔单抗的细胞毒性活性，我们将原代CLL细胞与利妥昔单抗和6G11的N297Q变体一起共孵育，并且评估MDMADCP和NK细胞ADCC。惊人的是，与单独的利妥昔单抗相比，N297Q6G11被证实显著促进MDM吞噬利妥昔单抗调理的CLL细胞的能力(图3H和I)。在使用NK细胞进行的ADCC测定中观测到类似的活性提高(图3J)。NK细胞不表达FcγRIIB，从而确认由hFcγRIIBmAb引起的任何增强作用均源于由于它们抑制利妥昔单抗内化而对靶细胞的作用。这些数据确认阻断B细胞靶标表面上的hFcγRIIB抑制了mAb:Ag:hFcγRIIB复合物的内化，并且增强了它们被靶向以由效应细胞除去的能力。
综上所述，这些观测结果表明6G11可以经由以下双重机制引出抗肿瘤活性，即内在的细胞毒性活性以及经由阻止利妥昔单抗从细胞表面去除来增强利妥昔单抗的活性。
在免疫活性hCD20+vehFcγRIIb+veTg小鼠中6G11具有内在的B细胞消耗活性并且增强利妥昔单抗的消耗作用。
为了研究除B细胞以外的hFcγRIIB+细胞是否可能在6G11治疗之后被除去，进行了用人类血液进行的全血消耗测定(图6(2/2))和用hFcγRIIBTg小鼠进行的体内实验(图S4N)。B细胞，而不是单核细胞或中性粒细胞被WT6G11IgG1，而不是N297Q6G11除去。在与利妥昔单抗组合的情况下同样没有观测到单核细胞和中性粒细胞的消耗(图6(2/2))。随后，我们使用最近开发的体外细胞因子释放综合征(CRS)测定(CRA)(Hussain等,2015)来评估6G11对已经由高密度培养而变得对刺激敏感(Romer等,2011)的人类外周血液单核细胞(PBMC)的潜在影响，并且所述测定能够在添加先前被强调为引出CRS的几种mAb特异性(CD3、CD28或CD52)之后检测到显著水平的IFN-γ、TNF-α和/或IL-8。将WT或N297Q6G11施用48小时没有引起显著的细胞因子释放，这与1/500剂量的CD3mAb不同(图6)。使用全血或稀释血液CRA获得类似的结果(图19)。
在免疫活性小鼠中6G11具有内在活性并且增强利妥昔单抗的消耗作用
使用hIgG16G11和mIgG1AT10这两者评估单独或与利妥昔单抗组合靶向hFcγRIIB的消耗潜能。首先，在短期过继转移测定23中，其中将CFSE+vehFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-脾细胞注射到WT接受体体内并且随后用6G11(图4A和B)或AT10(图15A)处理，观测到转移的细胞被有效地从循环和脾脏中消耗。有趣的是，施用低到1μg的mAb足以引出约50％的B细胞消耗。消耗完全依赖于Fc:激活性FcγR相互作用，这是因为在使用F(ab')2片段和N297Q变体的情况下活性丧失；在缺乏激活性FcγR的γ链-/-小鼠中，hFcγRIIB+ve靶标也没有被除去(图4A和B以及图15A)。这些数据确认拮抗性hFcγRIImAb能够在体内除去靶细胞，这依赖于与免疫效应细胞上的激活性FcγR的相互作用，如先前所示36。
为了将我们的分析延伸到与利妥昔单抗的联合治疗，通过杂交产生hCD20+/-15,37×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠。在将靶标转移到WT接受体体内的短期测定中，与单独的任何一种mAb相比，利妥昔单抗和6G11(或AT10)的组合引起了hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-B细胞的更高消耗(分别是图4C和图15B)。类似地，在hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-接受体小鼠(在效应细胞上也表达hFcγRIIB)中，通过将利妥昔单抗与6G11组合更显著地消耗了过继转移的hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-B细胞(图4D)。
我们随后研究了所述组合在hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠模型中对循环B细胞的作用。如前所述，与单药治疗相比，所述组合引起循环B细胞的显著更高的消耗(图4E以及图15C和D)，这是首次在其中hFcγRIIB在靶细胞和效应细胞这两者上表达的完全同基因系统中证实这种能力。将利妥昔单抗和WThIgG16G11(或AT10)组合的作用大于对于叠加活性所预期的作用(分别是图4(2/2)和15)，如根据在单独施用两倍剂量的单个mAb的情况下所观测到的响应所判断的那样。
为了评估对于该活性来说是6G11的内在作用(B细胞消耗)还是外在作用(利妥昔单抗增强)更重要，我们将N297Q6G11用于hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠中并且证实虽然N297Q6G11单独在除去方面是无活性的，但是它显著增强了利妥昔单抗对B细胞的除去(图4(2/2))。用mIgG16G11观测到类似的结果。如所预期以及如用AT10所观测到(图15)，mIgG16G11在hCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠中显示出不佳的单一药剂消耗活性(Hamaguchi等,2006)，但是类似于N297QhIgG16G11，能够显著增强利妥昔单抗的鼠类IgG2a型式消耗B细胞的能力(图15)。此外，由于它的小鼠Fc，因此它没有被MAHA主动清除，从而有助于对组合治疗进行更长期的评估。这些数据证实了在体内拮抗hFcγRIIB功能对于增强利妥昔单抗的消耗活性的长期有益的作用。
总之，这些研究确认了6G11在体内的双重作用机制，涉及内在抗肿瘤功能联合经由阻止内化来增强利妥昔单抗的抗肿瘤活性。
6G11在体内增强II型hCD20mAb介导的B细胞消耗
为了研究6G11与不在与I型CD20mAb相同的程度上被内化13,23,33并且最近被批准用于CLL的II型hCD20mAb组合是否也是有效的，我们在过继转移模型中进行了实验。如同利妥昔单抗，在接受体WT小鼠和hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠中，GA101gly(糖基化的奥比妥珠单抗)单药治疗和6G11单药治疗这两者均引起脾和循环靶CFSE+vehCD20+/-×hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-B细胞的不太大的消耗，而联合治疗显著增强了脾靶细胞和循环靶细胞这两者的消耗(图4F和G；并且数据未示)。这些数据表明6G11与其它直接B细胞靶向mAb组合也将是有效的。
6G11在体内增强利妥昔单抗介导的原代CLL细胞的消耗并且改善目标和完全抗肿瘤响应
尽管利妥昔单抗已经被成功地用于改善对几种B细胞恶性肿瘤的治疗，但是它在控制CLL方面具有有限的活性。尽管最初在血液中有外周消耗，但是从次级淋巴组织和所谓的增殖中心有效减灭肿瘤是不太成功的。因此，为了更好地评估6G11针对CLL细胞的抗肿瘤活性，我们研发了一种动物模型，其中原代人类CLL细胞归巢于次级淋巴器官(脾和骨髓)，并且与支持性人类T细胞一起增殖成簇，从而严格模拟人类疾病中的情况(图5A和B)。在这一模型中，利妥昔单抗有效消耗存在于腹膜腔中的CLL细胞，但是它在消耗存在于脾脏中的增殖中心中的CLL细胞方面是不完全有效的(图16)。
在单独用利妥昔单抗或6G11处理被移植有原代CLL细胞的小鼠时，与经过同种型对照mAb处理的动物相比，在脾脏中观测到肿瘤质量显著减小(图5C)。用利妥昔单抗和6G11的组合进行的处理产生了甚至更高的消耗速率(图5C)。此外，在根据响应率的标准评估这些数据时，在联合治疗后部分响应者和完全响应者的数目显著高于经过同种型对照处理的小鼠或单药治疗(分别是图5D和5E)。
此外，在联合治疗后目标响应者(OR；被定义为脾脏中的CLL细胞减少>75％)和完全响应者(CR；被定义为脾脏中的CLL细胞<0.1％)的数目显著高于经过同种型对照处理的小鼠或单药治疗(图5和5(2/2)以及表5)。这些数据显示在体内利妥昔单抗/6G11联合治疗针对原代CLL细胞的功效提高。
然后，我们研究6G11治疗被移植有从利妥昔单抗、奥法木单抗(hCD20mAb)和/或阿仑单抗(hCD52mAb)难治性患者分离的CLL细胞的小鼠的能力(表4)。将异种移植小鼠用作为单药治疗的6G11或利妥昔单抗处理或用这两种mAb的组合处理。如所预期，单独用利妥昔单抗处理是低效的(图5和5(2/2)以及表8)并且>95％的小鼠未能产生OR。相反，单独的6G11显示出显著的CLL细胞消耗，但是未能改善OR(图5和5(2/2)以及表5)。然而，值得注意的是，利妥昔单抗与6G11的共同施用引起了稳健的消耗(图5和5(2/2)以及表8)，有>25％的OR(表5)。这些数据表明除了增强利妥昔单抗在响应患者中的活性之外，6G11还可以针对治疗难治性CLL细胞具有活性。
使用利妥昔单抗和6G11的联合治疗在体内克服了难治性CLL细胞
之后，我们研究了6G11在存在或不存在利妥昔单抗的情况下治疗被移植有从利妥昔单抗和/或阿仑单抗(hCD52mAb)难治性患者分离的CLL细胞的小鼠的能力(表4)。如所预期，单独的利妥昔单抗对细胞的消耗是低效的，但是这在6G11存在下显著改善(图5F)。此外，被移植有难治性CLL细胞的接受联合治疗的更高数目的小鼠在所述组合下实现了部分响应(图5G)。这些数据支持了6G11可以增强利妥昔单抗在利妥昔单抗敏感性和利妥昔单抗难治性患者组中的功效。
表4：关于在临床上被定义为利妥昔单抗难治性的患者的患者信息、先前治疗以及响应的信息。这与体内模型中的相对响应相比较，其中经过同种型对照处理的小鼠的脾脏中CLL细胞的数目被设定为100％±SD。
使用利妥昔单抗和6G11的联合治疗在体内针对原代MCL细胞具有活性
为了评价6G11靶向其它类型的恶性B细胞的能力，我们使用被移植有JekoMCL细胞或新鲜分离的原代MCL细胞的免疫缺陷小鼠模型(分别是图17A和B)。在向小鼠移植JekoMCL细胞时，使用6G11或利妥昔单抗的单药治疗没有引起长期存活，而所述组合有效治愈约30％的小鼠直到100天。类似地，如同原代CLL细胞的情况一样，原代MCL细胞对联合治疗作出有利响应(图17B)。
随后，为了确定6G11mAb治疗的安全性，我们进行了剂量递增研究，用单次注射的1mg/kg、10mg/kg或100mg/kg的6G11处理hFcγRIIB+/-×mFcγRII-/-小鼠的群组，从而研究以10mg/kg剂量进行的静脉内施用途径和腹膜内施用途径这两者(图18A)。经过处理的小鼠均没有遭受不良事件，如急性作用、痛苦或体重减轻(图17B)。在第7天进行的组织检查未能表明器官(肾脏、脑、脾脏、肝脏、肺)中的任何总体毒性(数据未示)。在高于1mg/kg的剂量下在血液(图6A)和脾脏(图6B)中观测到hFcγRIIB+veB细胞的消耗，在10mg/kg组和100mg/kg组中有等同的活性，从而表明了功效。6G11是一种容易在小鼠血清中检测的完全人类mAb，但是内在具有免疫原性，因此我们同时评估了它的半衰期和小鼠抗人类抗体(MAHA)响应的证据(图6C和D)。这些数据表明在高于1mg/kg的剂量下，克服了影响PK特征的靶标介导的清除，在10mg/kg组和100mg/kg组中观测到靶标结合几乎没有影响。然而，在7天内，观测到显著的MAHA(在10mg/kgi.v.组中，从第4天到第7天，增加了4个数量级；图6D)，从而引起mAb的快速清除。基于在施用后在出现显著的MAHA之前的前4天，我们估算10mg/kg和100mg/kg剂量的抗体的半衰期是约2天-4天(图6C和D以及表3)。
最后，我们使用了最近开发的体外细胞因子释放综合征(CRS)测定来评估6G11对已经由高密度培养而变得对刺激敏感的人类PBMC的潜在影响28。这一测定系统能够在添加先前被强调为引出CRS的几种mAb特异性(CD3、CD28或CD52)之后检测显著水平的IFN-γ、TNF-α和/或IL-8(图6F和正在准备中的文稿)。在这一测定中将WT或N297Q6G11施用48小时没有引起显著的细胞因子释放，这与1/500剂量的CD3mAb不同(图6G)。使用全血细胞因子测定获得类似的结果(图18)，它们共同表明在人类研究之前6G11具有良好的安全性特征。
这些数据提供证据表明6G11可以针对多个靶标克服mAb药物抗性。
表5：在原代CLL患者异种移植物中对mAb处理的响应
anb：无结合。
bnm：未测量。
amAb半衰期。
c稳态分布容积(稳态：在一定次数的施用结束时获得的平衡状态)。
f在施用之后药物的峰值血浆浓度。
所有来者CLL患者异种移植物
利妥昔单抗难治性CLL患者异种移植物
MCL患者异种移植物
NA：不适用。
讨论
癌细胞是高度增殖性的，在本质上是基因组不稳定的并且具有高的突变倾向。这些方面为细胞在来自常规的抗癌药物的选择下进化提供了理想的环境，其中出现了遗传上不同的治疗抗性克隆，从而导致治疗失败。这种能力在针对DNA损伤化疗38和靶向不同的信号转导通路的小分子抑制剂，如伊马替尼(imatinib)、埃罗替尼(erlotinib)以及依鲁替尼39-43产生的抗性机制中是清楚明显的。这些机制涉及所靶向的受体中的突变或下游信号转导蛋白中的补偿性变化44。其它机制涉及经由上调药物外排泵所实现的多药抗性机制(45中所综述)。常规和靶向小分子抑制剂的失败已经促使寻找克服这些抗性方式的手段以及替代治疗，包括结合免疫系统的那些。
单克隆抗体(mAb)迄今为止是这种方法的最成功的代表，用于血液学病症的Ab引领该领域。B细胞癌代表了在抗体治疗方面在临床上被最充分研究的类型的癌症。自从利妥昔单抗在1997年被批准，以及随着第二代(奥法木单抗)和第三代(奥比妥珠单抗)hCD20mAb最近被批准，这些药剂已经成为治疗B细胞癌的医疗方法中的重要支柱。然而，很明显，mAb免疫治疗也易受内在抗性和获得性抗性这两者的影响。现在公认的是，肿瘤通过破坏基质细胞和骨髓细胞来影响它们的周围微环境以支持它们的存活和生长46。与mAb治疗有关的至少两种抗性机制是由抑制性FcγRIIB促成的(47中所综述)。除了由Clynes5所表明的对效应细胞的抑制作用之外，最近已经证实利妥昔单抗和其它I型hCD20mAb在B细胞表面上通过双极抗体桥联结合hFcγRIIB，从而引起mAb:CD20:FcγRIIB复合物的内化13,23,48，进而限制了它发挥关键的Fc依赖性效应功能的能力(23和未出版的Tipton等)。在此，这个实施例描述了在体内能够阻断这两种抗性机制并且因此能够释放其它治疗性mAb的完全潜能并且帮助克服对抗体治疗的抗性的完全人类hFcγRIIbmAb的产生。
惊人的是，hFcγRIIBmAb的共同施用不仅改善了被移植有来自利妥昔单抗响应患者的CLL细胞的小鼠的目标响应和完全响应，而且重要的是，它们还克服了来自对利妥昔单抗或靶向hCD52的mAb阿仑单抗具有抗性的复发性/难治性患者的CLL细胞的mAb治疗抗性表型。
最近提出了肿瘤细胞FcγRIIB在所选择的微环境中对hCD52mAb治疗的抗性中的作用(Pallasch等,2014)。发现与更敏感的脾脏隔室相比，hFcγRIIB在阿仑单抗抗性骨髓白血病B细胞中上调，并且在这些中由shRNA介导的hFcγRIIB基因敲低在原本具有抗性的组织中改善了hCD52mAb治疗。这些发现与在我们的CLL模型中得到的观测结果是一致的。尽管敏感的腹膜隔室中的CLL细胞容易由hCD20mAb消耗，但是抗性微环境中的消耗需要阻断肿瘤FcγRIIB。与高FcγRIIB表达构成了mAb在抗性组织隔室中的活性降低的基础相一致，在我们的CLL模型中阻断FcγRIIB增强了阿仑单抗以及II型hCD20mAb。我们先前证实了II型hCD20mAb只有在高水平的FcγRIIB存在下有效内化(Vaughan等,2014)。总的来说，这些观测结果证实了FcγRIIB介导的抗性与若干种不同的临床上批准的抗体有关，这表明与hFcγRIIBmAb组合的广泛治疗潜能。
先前已经证实，I型CD20mAb显示出比II型大得多的内化到所靶向的肿瘤细胞中的倾向13,23,33，后者只有在高水平的FcγRIIB存在下有效内化33。在此关于在体内II型CD20抗体的B细胞消耗活性似乎通过与6G11共同治疗而得到类似的改善的发现因此变得耐人寻味。Hemann和同事最近表明在所选择的微环境中肿瘤细胞FcγRIIB在对hCD52mAb治疗的抗性中的作用49。发现与更敏感的脾脏隔室相比，FcγRIIB在阿仑单抗抗性骨髓中上调，并且在白血病细胞中由siRNA介导的FcγRIIB基因敲低在原本具有抗性的组织中提高了hCD52mAb的治疗作用。这些发现与用我们的CLL模型得到的观测结果是一致的。尽管敏感的脾脏隔室中的单个CLL细胞容易由hCD20mAb治疗消耗，但是抗性微环境中成簇的增殖CLL细胞的消耗需要阻断肿瘤FcγRIIB。重要的是，这些观测结果(本文和33)证实了FcγRIIB介导的抗性与若干种不同的临床上批准的抗体和验证的靶标有关，这表明与hFcγRIIBmAb组合的广泛治疗潜能。
至少三种不同的机制因此可能促成6G11的总体体内治疗活性：内在细胞毒性；阻止治疗性mAb内化；以及中和免疫细胞中的FcγRIIB抑制性信号转导。若干观测结果表明阻断受体内化和抑制性信号转导对于克服药物抗性来说是最关键的。首先，在向其中hFcγRIIB在靶细胞和效应细胞这两者上表达的小鼠共同施用拮抗性hFcγRIIB和hCD20mAb时，有显著和明显协同作用。其次，我们发现尽管单独的AT10对于B细胞除去是低效的，但是AT10和利妥昔单抗的组合在增强利妥昔单抗活性方面是有效的。最确定的是，我们用缺乏结合激活性FcγR的能力并且没有直接的细胞毒性能力的N297QhIgG16G11所得到的数据确认阻断FcγRIIB活性是这种方法的功效背后的关键机制。这提供证据表明针对FcγRIIB的功能阻断性mAb可以再现在使FcγRIIB发生遗传缺失后所观测到的增强的抗癌mAb响应(Clynes等,2000)。然而，在此我们没有直接研究拮抗靶标上的FcγRIIB功能相比于拮抗免疫效应细胞上的FcγRIIB功能对于活性来说的相对重要性；这些研究形成了我们正在进行的努力的基础。
有趣的是，在人类血液中以及在hFcγRIIBTg小鼠体内，6G11处理引起B细胞的特异性除去。尽管在这两个系统中单核细胞表达hFcγRIIB，但是它们基本上没有被除去。当前的证据表明巨噬细胞和/或单核细胞是负责mAb治疗的关键效应细胞(Beers等,2010)；(Biburger等,2011；Gul等,2014)，因此我们的数据表明这些关键的效应子没有被hFcγRIIBmAb除去。
我们先前研究了一组等效的抗小鼠FcγRII特异性mAb25并且观测到它们具有有限的治疗益处，这是因为它们在体内被快速消耗，主要是由宿主的非肿瘤细胞消耗17。重要的是，至少在体外，在人类靶细胞上没有观测到类似速率的内化，这与之前的研究是一致的36。在此，我们延伸了这些观测结果并且证实对原代人类CLL样品观测到相同的情况并且在表达hFcγRIIBTg的小鼠中，没有观测到快速和广泛的mAb消耗。这些数据确认了我们之前的假设，小鼠和人类抑制性FcγRII(B)在它们对于内化和充当抗原汇(antigenicsink)的能力方面具有不同的特性，并且表明诸如6G11的hFcγRIIBmAb将在人类中有效地起作用。
总的来说，这个实施例证实了以下体内概念验证，即hFcγRIIBmAb克服了肿瘤细胞对mAb药物的内在抗性和获得性抗性，从而克服了复发性/难治性CLL细胞。我们的数据支持了临床开发hFcγRIIBmAb以用于表达FcγRIIB的B细胞癌的治疗。
这些数据支持了临床开发hFcγRIIBmAb以用于表达FcγRIIB的B细胞癌的治疗。此外，类似于CD20mAb向其它疾病的扩展，有证据表明了它们在其它治疗背景下的效用，如其中表达FcγRIIB的靶标可能适合于操作的自身免疫，例如其中靶PC表达高水平的FcγRIIB的系统性轻链淀粉样变性(Zhou等,2008)以及其中B细胞激活可能经由激动FcγRIIB而减少的类风湿性关节炎(Baerenwaldt等,2011；Mauri和Jury,2010)。
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实施例2：示例性药物制剂
虽然本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物有可能被单独施用，但是优选的是，将它连同一种或多种可接受的载体一起作为药物制剂提供。所述一种或多种载体必须在与本发明的组合物、和/或抗体、和/或药剂、和/或药物相容并且对其接受者无害的意义上是“可接受的”。通常，所述载体将是将无菌和无热原的水或盐水。
以下实施例说明了根据本发明的药物和药物组合物，其中活性成分是本发明的抗体分子和/或药剂。
实施例A：片剂
通过湿法制粒，继而压制由上述成分制备片剂。
实施例B：眼用溶液
实施例C：片剂制剂
通过用聚维酮溶液将成分湿法制粒，继而添加硬脂酸镁并且压制来制备以下制剂A和B。
制剂A
制剂B
制剂C
通过直接压制混合的成分来制备以下制剂D和E。用于制剂E中的乳糖是直接压制型。
制剂D
制剂E
制剂F(受控释放制剂)
通过用聚维酮溶液将成分(以下)湿法制粒，继而添加硬脂酸镁并且压制来制备制剂。
实施例D：胶囊制剂
通过将上述实施例C中制剂D的成分混合并且填充到两部分型硬明胶胶囊中来制备胶囊制剂。以类似方式制备制剂B(下文)。
通过使Macrogol4000BP熔融，将活性成分分散在熔体中并且将熔体填充到两部分型硬明胶胶囊中来制备胶囊。
通过将活性成分分散在卵磷脂和花生油中并且将分散液填充到软弹性明胶胶囊中来制备胶囊。
制剂E(受控释放胶囊)
通过使用挤出机将成分a、b以及c挤出，继而将挤出物球化并且干燥来制备以下受控释放胶囊制剂。然后将干燥的球粒用释放控制膜(d)包被并且填充到两件式硬明胶胶囊中。
实施例E：注射制剂
活性成分0.200g
121
无菌无热原的磷酸盐缓冲液(pH7.0)，达到10ml
将活性成分溶解在大部分的磷酸盐缓冲液(35℃-40℃)中，然后补足体积并且经由无菌微孔过滤器过滤到无菌10ml琥珀色玻璃小瓶(1型)中并且用无菌闭合件和封口件密封。
实施例F：肌内注射剂
将活性成分溶解在糖原糠醛中。然后添加苯甲醇并且溶解，并且添加水达到3ml。然后将混合物经由无菌微孔过滤器过滤并且在无菌3ml玻璃小瓶(1型)中密封。
实施例G：糖浆悬浮液
将苯甲酸钠溶解在一部分的纯化水中并且添加山梨糖醇溶液。添加活性成分并且分散。将增稠剂(可分散纤维素)分散在甘油中。将两种分散液混合并且用纯化水补足所需的体积。根据需要通过额外剪切所述悬浮液来实现进一步增稠。
实施例H：栓剂
*活性成分是作为粉末使用的，其中至少90％的颗粒具有63μm或更小的直径。
将1/5的WitepsolH15在蒸汽夹套锅中在最高45℃下熔融。使活性成分经由200μm筛过筛并且使用装有切割头的silverson(高剪切混合器)，在混合下添加到熔融的基质中，直到实现均匀分散为止。将混合物维持在45℃，同时将其余WitepsolH15添加到悬浮液中并且搅拌以确保均匀混合。使整个悬浮液通过250μm不锈钢筛网并且在连续搅拌下，冷却到40℃。在38℃至40℃的温度下，将2.02g混合物填充到合适的塑料模具中。使栓剂冷却到室温。
实施例I：子宫托
将上述成分直接混合并且通过直接压制所得混合物来制备子宫托。