芯片上的皮肤：通过自动气液界面测量跨上皮细胞层电阻和细胞外酸化率
翻译整理：北京佰司特贸易有限责任公司
Keywords：TEER；Organ-on-a-Chip；skinmodels；reconstructedhumanepidermis；impedance；label-freemonitoring
1.INTRODUCTION
2.Background
2.1.基于重构人表皮的皮肤毒性试验的最新进展
从监管角度来看，评价和预测有毒化合物和药物对皮肤的有害影响，3D模型系统必须经过一系列广泛测试化合物的验证。如果通过欧洲替代方法验证中心(ECVAM)证实和经济合作与发展组织(OECD)测试指南(TG)，具有指定测试技术的模型就可以作为可接受的工具用于皮肤毒性测试。到目前为止，OECD提供了用于皮肤腐蚀和刺激的指南测试的指南，分别基于OECDTG431和439。
2.2.器官芯片平台和微生理测量
２.３.皮肤/重建人表皮的跨上皮细胞层电阻
由于潜在的有害化合物会影响皮肤厚度，厚度的测量也是早期研究的参数之一。破坏性测量，例如活组织检查，或非破坏性测量，如共焦拉曼光谱仪和超声波成像。其中最传统的方法和有用的细胞培养的应用就是测量皮肤通透性屏障，以评估上皮或内皮组织的活力和功能。在这里，跨上皮细胞层电阻(TEER)提供了一种无标记和快速的技术来研究皮肤完整性。TEER值测量了一个或几个细胞层的电阻。
２.４.目前跨上皮细胞层电阻测量的缺点和跨上皮细胞层电阻自动化测量的需要
3．MaterialsandMethods
3.1.体外诊断智能移动实验室概述
3.2改进的BioChip-D小室
生物芯片模块包含一个传感器芯片连接到电路板并连接到一个圆柱形密封小室，用以保护芯片的连接并连通细胞及培养基。一个流体头直接连接密封小室，形成一个液体密封、静态微容积(~6μL)的反应室，在集成的传感器表面测量细胞外酸化率(EAR)和氧合作用(图1a)。然而，需要测量RhE的情况下，多孔膜上培养的细胞不适合标准生物芯片或标准的IMOLA-IVD叉指电极传感器(IDES)测量阻抗。为了克服这些限制，新的密封小室和流体头的设计，以保持空气-液体使用Pro/EngineerWildfire4.0(PTCInc.,Needham,MA,USA)。封装用Ultimaker2(UltimakerBV，Geldermalsen，Netherlands)，使用聚乳酸(PLA)和硅橡胶医用粘合剂(CorningInc.,NewYork,NY,USA)连接到生物芯片BioChip。重新设计的BioChip小室适用于扩大培养室和其他多孔膜上培养的细胞(图1b)的RhE。
3.3.L929细胞与重建人表皮细胞的制备与培养
记录小鼠成纤维细胞(L929)和重建人表皮细胞（RhE）的跨上皮细胞层电阻值。L929细胞在加10%胎牛血清(FBS)和10μg/mlgentamycin(ThermoFisher,Waltham,MA,USA)。细胞按照标准的实验室规范(GLP)培养，并保存于37℃和5%的培养箱中培养后，在95%融合度时，细胞传代，100,000细胞种在12mmTranswell?上，孔径3μm的多孔膜(CorningIn)。transwell随后被放置在6孔板上，并在1mlDMEM中再孵育24小时，然后转移到modifiedBioChips中。
3.4.自动化灌流系统的介绍
设计了一种自动灌流系统来自动化监测在生物芯片上培养48小时以上的RhE细胞模型的TEER。该系统由两个流体模块(FM)组成，通过与Tygon?E-3603(ProLiquidGmbH,Ueberlingen,Germany)管道连接成独立的管道。这些独立的网络通过IMOLA-IVD泵标准设置的ON/OFF开关程序，向基底细胞提供营养丰富的细胞培养基，并定期向Transwell?膜的顶部区域，泵入磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)。如图2所示。介质传输模块在无缓冲的DMEM和0.2%SDS的培养基之间切换，提供给膜底部的细胞。TEER测量模块连接到PBS进行TEER测量或测试可用于接种RhE表面的水溶性测试物。
4.ResultsandDiscussion
4.1.重新设计的经上皮电阻封装功能
4.2.小鼠成纤维细胞的胞外酸化率的测定
4.3.小鼠成纤维细胞对十二烷基硫酸钠培养基的代谢反应
4.4.小鼠成纤维细胞的TEER(跨上皮细胞层电阻)监测
除了监测L929细胞的代谢率，在25分钟泵OFF期间还可以监测TEER值。在TEER测量过程中，随着PBS泵入测量小室以连接电路进行测量，数值会发生变化。TEER开始无数值，因为电极对之间存在短路。嵌入在流体头的导线电极浸入PBS中，与膜下的芯片上的导电电极一起连接形成电路。PBS在细胞上停留5分钟，泵OFF以进行稳定监测。然后PBS被泵出测量小室，直到下一个测量循环。
4.4.RhE细胞模型的TEER(跨上皮细胞层电阻)监测
使用上述相同的设置对重建人表皮细胞模型（reconstructedhumanepidermis，RhE）进行连续监测TEER约50小时。在前12小时，TEER值保持相对稳定，如图5所示。在36小时后，用0.2%SDS处理细胞后2小时，平均TEER值突然下降。SDS培养基加入前，TEER值最初是尖峰的，在用PBS加入顶端腔后，然后迅速稳定并保持，直到5分钟的测量周期结束。当从上部小室中移除培养基后，由于电路短路，TEER再次变成无数值。
5.Conclusions
在这里，我们提出了一种创新的方法，以非侵入性监测细胞培养在二维和三维多孔膜在各种形态。我们最先进的生物芯片密封设计被证明支持小鼠成纤维细胞的单层，以及更复杂的重建人表皮细胞模型（reconstructedhumanepidermis，RhE）。此外，设计了一个两部分的自动化流体系统，处理将PBS溶液输送和加入到顶部腔室进行TEER测量。使用L929细胞，设计了一个标准的操作方法，通过定期测量TEER来监测代谢率和屏障完整性。SDS培养基加入之前保持的细胞活力，作为阳性对照。
Acknowledgments:F.A.A.wouldliketothanktheWhitakerInternationalProgramfortheirfinancialsupportofthiswork.TheauthorswouldalsoliketothanktheDeutscherTierschutzbund–AkademiefürTierschutz(GermanAnimalWelfareFederation–AnimalWelfareAcademy)andMatTekinvitrolifesciencelaboratories,Slovakia,forEpiDermRhEmodels.AuthorContributions:F.A.A.andJ.W.developedtheconcept;F.A.A.andS.E.conceivedanddesignedtheexperiments;F.A.A.performedtheexperiments;F.A.A.andJ.W.analyzedthedata;F.A.A.,S.E.andJ.W.wrotethepaper.ConflictsofInterest:J.W.ischiefexecutiveofficer(CEO)andshareholderofcellasysGmbH.Thedatasetsgeneratedforthisstudyareavailableonrequesttothecorrespondingauthor.