1、细胞原代培养、传代培养、冻存与复苏1实验原理细胞培养可分为原代培养与传代培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样
3、用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。6.加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。面做好标志，注明细胞、组别及日期。然后将培养瓶置于二氧化碳培养箱中培养。（2）传代培养：1.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代。2.培养液瓶打开后，过酒精灯火焰，置酒精灯火焰周围
4、。3.拿出直头滴管，套上橡皮吸头，过火，放入培养液瓶中。4.打开培养瓶，瓶口过火，将培养瓶内的培养液轻轻倒入废液缸，用2-3mLPBS洗去残留的旧培养基。5.培养瓶加入0.25%胰酶，用量以薄薄盖满一层为宜，37消化，倒置显微镜下观察到细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，加入少量的含血清的新鲜培养基。6.取弯头滴管反复吹打细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基，制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。7.对半贴壁培养细胞，不需胰酶，直接吹打，加入新鲜培养基，然后分