细胞培养，看似简单的一个实验，却不知道把多少英雄豪杰折磨的意欲“自挂东南枝”~今天科研小助手就为大家盘点一下细胞复苏、传代到冻存的一些步骤和注意事项，希望广大科研汪能与细胞愉快的玩耍！
细胞复苏细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作：
一.实验前准备：1.将水浴锅预热至37℃2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
二．细胞复苏培养：1.根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。2.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。3.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000rpm/min速度离心3~5min。
细胞传代
一.传代前准备：1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
二、细胞传代：
细胞冻存
一、冻存前准备
1.准备适量冻存管，做好标记后置于4℃冰箱预冷；
2.配制冻存液，一般为用培养液配制10%DMSO；
3.梯度冻存盒。
二、细胞冻存：
1.按照细胞传代步骤1-7操作制备细胞悬液并离心；
2.弃去上清，加入适当体积的冻存液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液；
3.将1ml细胞悬液加入加入之前已做好标记的冻存管中并做好记录；
4.将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜（如果没有冻存盒，可以先在4℃冰箱放置30min，然后转移至-20℃放置1-2h，最后转移至-80℃过夜），第二天取出放入液氮罐，并记录好位置信息。
注意事项：1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。