1(西南大学/中国农业科学院柑桔研究所，重庆，400712)2(农业农村部柑桔产品质量安全风险评估实验室，重庆，400712)3(农业农村部柑桔及苗木质量监督检测测试中心，重庆，400712)
摘要优化了柑橘中类胡萝卜素的提取条件，结合超高效液相色谱法进行快速测定，并重点分析比较了不同品种的不同部位(果肉和果皮)中类胡萝卜素物质的种类和含量差异。结果表明：宽皮柑橘中类胡萝卜素含量丰富，类胡萝卜素以β-隐黄质为主，果肉中总平均含量为8.44mg/kgFW，果皮为23.73mg/kgFW；不同品种宽皮柑橘之间的含量差异显著，果肉中类胡萝卜素含量呈橘类(14.73mg/kgFW)>柑类(13.51mg/kgFW)>杂柑类(8.11mg/kgFW)的规律，而果皮中类胡萝卜素含量呈橘类(47.94mg/kgFW)>杂柑类(28.71mg/kgFW)>柑类(21.80mg/kgFW)的规律。该文对宽皮柑橘中功能成分开发利用具有重要意义。
关键词超高效液相色谱；宽皮柑橘；类胡萝卜素
柑橘是世界第一大水果，是第三大国际贸易农产品，仅次于小麦和玉米[1]。我国柑橘种植面积和总产量均居世界第一，其中宽皮柑橘约占年产量的60%。柑橘果实营养丰富，富含类黄酮[2-6]、酚酸[5-6]、类柠檬苦素[5]、香豆素[6]、类胡萝卜素[7]、生物碱[8]、肌醇[9]和挥发性物质[10]等多种生物活性成分。目前，国内外主要集中于类黄酮和酚酸等活性物质的鉴定分析[2-6]。
类胡萝卜素是一类C40类萜化合物及其衍生物，是胡萝卜素和叶黄素2大类色素的总称。类胡萝卜素既是决定水果、蔬菜内在营养品质的重要指标，也是影响果实外观品质和花卉观赏价值的重要因素[11]。医学研究表明，许多类胡萝卜素在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等方面起着重要的作用，β-胡萝卜素还是维生素A的前体[12]。日本的农研机构已明确证实经常食用温州蜜柑(1d摄入3～4mg功效成分的β-隐黄质)，可以显著降低骨质疏松、动脉硬化、吸烟者代谢症候群和胰岛素抵抗性等风险。
本研究在前人基础上，优化了宽皮柑橘中类胡萝卜素的提取条件，建立快速、有效的UPLC方法,对我国34个宽皮柑橘品种中的主要类胡萝卜素物质含量进行测定，并分析比较不同宽皮柑橘品种的不同部位(果肉和果皮)中类胡萝卜素物质的种类和含量差异，探究类胡萝卜素与宽皮柑橘品种的相互关系，旨在充实宽皮柑橘功能性成分数据库，为合理开发利用柑橘资源、提高柑橘综合利用价值提供科学依据。
34个宽皮柑橘品种均来自国家果树种质资源(重庆)柑橘圃，样品信息如表1。在果实成熟期，选择树势相对一致的3～5株树，在树冠中外围的中上部随机挑选大小、成熟度相对一致的果实。
叶黄素(纯度≧97%)、玉米黄质(纯度≧95%)、β-隐黄质(纯度≧97%)、α-胡萝卜素(纯度≧98%)、β-胡萝卜素(纯度≧97%)，美国Sigma-Adrich公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT，纯度≧99%)，德国CNWTechnologiesGmbH公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚(MTBE)、正己烷，均为色谱纯，德国CNWTechnologiesGmbH公司；丙酮、四氢呋喃、乙醇、KOH、Na2SO4，均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂。
表1宽皮柑橘品种的样品信息Table1Experimentalmaterials
WatersACQUITYUPLC色谱仪(2996PDA检测器，version4.1Empour工作站)，美国Waters公司，配YMC类胡萝卜素C30分析柱(4.6mm×100mm,3μm),日本YMC公司；Milli-QAdvantageA10超纯水器，美国Millpore公司；XS205电子天平(感量0.01mg)、PB3002-S/FACT分析天平(感量0.01g)，瑞士梅特勒-托利多公司；0.22μm有机相针式滤器，上海安谱科学仪器有限公司；KS260摇床，德国IKA公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；3K15高速冷冻离心机，美国Sigma-Aldrich公司；WD-12氮吹仪，杭州奥盛仪器有限公司。
1.3.1仪器条件
1.3.2标准溶液的配制
准确称取5种类胡萝卜素标准物质各2mg，于10mL容量瓶中分别用四氢呋喃(含体积分数为0.1%BHT)溶解并定容至刻度，配制成200mg/L的标准品母液。以上标准品母液均存放于棕色瓶中，-80℃保存备用。
1.3.3样品前处理
加标实验：果肉的加标水平为0.2和1mg/kg，分别向5g空白果肉样品(旭柑)中加入100μL的10mg/L和50μL的100mg/L标准溶液；果皮的加标水平为1和5mg/kg，分别向5g空白果皮样品(旭柑)中加入50μL的100mg/L和250μL的100mg/L标准溶液，混匀备用。前处理如上。
1.3.4数据分析
采用Origin9.0软件绘图、数据统计；应用SPSS24.0软件计算标准误差，并进行方差分析(ANOVA)，利用邓肯式多重比较对差异显著性进行分析(P<0.05)。所有样品均为3次平行，测定结果以平均值±标准差(mean±SD表示)。
1-叶黄素;2-玉米黄质;3-β-隐黄质;4-α-胡萝卜素;5-β-胡萝卜素图1五种类胡萝卜素的标准图谱Fig.1Chromatogramofastandardmixturepeakidentification
2.2.1提取剂的类型
实验选择3种不同的有机提取剂，以考察不同提取剂对柑橘(黄岩蜜桔果肉)中类胡萝卜素提取效果的影响，从而确定适合的提取剂，结果如图2所示。同一条件下，正己烷的提取效果最差，V(正己烷)∶V(丙酮)=1∶1的提取效果较好，使用V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1∶1提取获得的类胡萝卜素的总量最高。因此，选择V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1∶1作为柑橘中类胡萝卜素的提取剂。
图2不同提取剂对提取效率的影响Fig.2Effectofdifferentextractantsontheefficiency
2.2.2不同处理方法提取效果
类胡萝卜素如β-隐黄质含有1个羟基，叶黄素和玉米黄质含有2个羟基，在基质内多被酯化，而皂化反应可以去除脂质、脂肪酸和叶绿素，并水解类胡萝卜素酯。实验采用皂化和非皂化2种处理方法，考察了不同处理方法对柑橘(黄岩蜜桔果肉)中类胡萝
卜素提取效率的影响，结果如图3所示。皂化后测得的类胡萝卜素总含量明显高于未经皂化的，说明通过皂化能更有效地提取柑橘中的类胡萝卜素[20,25]。
图3非皂化和皂化对提取效率的影响Fig.3Effectofnon-saponificationandsaponificationontheefficiency
表2五种类胡萝卜素的线性范围、线性方程、检出限和定量限Table2Linearrange,equation,limitofdetection(LOD)andlimitofquantification(LOQ)offivecarotenoids
采用对空白基质(类胡萝卜素含量较低的旭柑)加标的方法进行回收率和精密度实验。分别对果皮和果肉样品进行2个水平的加标回收实验，以1.3.3节的方法对样品进行前处理，平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差(表3)。结果表明：在果肉样品中，2种添加水平的回收率在80.5%～92.3%之间，相对标准偏差在3.2%～7.1%之间；在果皮样品中，2种添加水平的回收率在81.3%～91.5%之间，相对标准偏差在2.6%～7.9%之间。本方法有较好的准确度和精密度，满足柑橘中类胡萝卜素定量分析的要求。此方法的检出限为0.01mg/kg，定量限为0.02mg/kg。
从国家果树种质资源(重庆)柑橘圃抽取34个宽皮柑橘样品，采用上述方法进行测定，不同品种果肉中类胡萝卜素的含量如表4所示，不同品种果皮中类胡萝卜素的含量如表5所示。实际样品(黄岩蜜桔)果肉和果皮的色谱图如图4所示。
表3五种类胡萝卜素的平均回收率、相对标准偏差、检出限和定量限Table3Meanrecovery,relativestandarddeviation,LODandLOQoffivecarotenoids
目标物质果肉果皮添加水平/(mg·kg-1)平均回收率/%相对标准偏RSD(%,n=6)添加水平/(mg·kg-1)平均回收率/%相对标准偏差RSD(%,n=6)检出限/(mg·kg-1)定量限/(mg·kg-1)叶黄素0.282.15.8181.34.2190.56.4582.46.90.010.02玉米黄质0.283.57.0181.25.2189.45.3584.55.80.010.02β-隐黄质0.289.96.3186.73.4183.44.1581.72.60.010.02α-胡萝卜素0.280.53.2181.97.9183.06.7585.56.00.010.02β-胡萝卜素0.291.74.9187.73.3192.37.1591.56.60.010.02
表4我国34个宽皮柑橘品种果肉中类胡萝卜素的含量单位：mg/kgFw
Table4Carotenoidcontentsof34loose-skinmandarinsinpulps
ND：未检出(低于定量限)
表5我国34个宽皮柑橘品种果皮中类胡萝卜素的含量单位：mg/kgFw
Table5Carotenoidcontentsof34loose-skinmandarinsinpeels
a-果肉；b-果皮图4实际样品(黄岩蜜桔)果肉和果皮的色谱图Fig.4ChromatogramsofpulpandpeelofHuangYanMiJu
宽皮柑橘中类胡萝卜素含量丰富，果肉和果皮中的平均总量分别为12.41和37.87mg/kgFW，普遍高于文献报道的其他品种。果肉和果皮中类胡萝卜素分布均呈以下规律：β-隐黄质>玉米黄质>叶黄素>β-胡萝卜素>α-胡萝卜素。
2.5.1果肉中类胡萝卜素含量
果肉中β-隐黄质的平均含量达8.44mg/kgFW，占果肉总类胡萝卜素含量的68.0%，四会柑最高，达18.74mg/kgFW，旭柑最低，仅为0.30mg/kgFW。玉米黄质含量次之，其平均含量为2.19mg/kgFW，占果肉总类胡萝卜含量的17.6%，蕉柑最为丰富(7.69mg/kgFW)，旭柑最低(0.033mg/kgFW)。叶黄素含量相对较低，其平均含量仅为1.04mg/kgFW，仅占果肉总类胡萝卜含量的8.4%，贡柑最高(3.00mg/kgFW)，旭柑最低(0.067mg/kgFW)。β-胡萝卜素和α-胡萝卜素的总平均含量仅为0.75mg/kgFW，占5种类胡萝卜素总含量的6.0%。除旭柑外，其他样品均检测出β-胡萝卜素，而满头红、莽山野桔、少核朱红橘、椪柑、旭柑、春见、不知火、清见和爱媛38等9个品种中均未检出α-胡萝卜素。
2.5.2果皮中类胡萝卜素含量
与果肉一致，β-隐黄质也是果皮中最主要的类胡萝卜素，其平均含量为23.73mg/kgFW，占果皮总类胡萝卜素的62.7%，椪柑最高(47.32mg/kgFW)，晚蜜一号最低(2.59mg/kgFW)。玉米黄质含量次之，其平均含量为9.16mg/kgFW，占果皮总类胡萝卜素的24.2%，八月桔最高(29.31mg/kgFW)，爱媛38最低(1.35mg/kgFW)。叶黄素平均含量为4.15mg/kgFW，占果皮总类胡萝卜素的11.0%，八月桔最高(13.27mg/kgFW)，晚蜜一号最低(0.78mg/kgFW)。β-胡萝卜素含量较低，其平均含量为0.74mg/kgFW，仅占总类胡萝卜素的2.0%。与果肉中一致，α-胡萝卜素的含量最低，平均含量为0.09mg/kgFW，在晚蜜一号和清见中均未检出。从总量上看，果皮中类胡萝卜素含量普遍高于果肉(总含量比值变幅为0.78～23.30mg/kgFW)。
2.5.3不同品种果肉中类胡萝卜素含量差异
从总量上看，四会柑果肉中类胡萝卜素含量最高，可达27.04mg/kgFW，旭柑最低(0.40mg/kgFW)。34种宽皮柑橘可分为橘类(编号1～18)、柑类(编号19～23)和杂柑(编号24～34)三大类，品种之间的含量差异显著(橘类>柑类>杂柑类)。橘类的类胡萝卜素含量最为丰富，平均含量为14.73mg/kgFW，柑类(13.51mg/kgFW)略低于橘类，最低的为杂柑类(8.11mg/kgFW)。橘类中β-隐黄质除马水桔和砂糖桔(低于5.00mg/kgFW)，其他品种的β-隐黄质均高于5.00mg/kgFW，变幅为5.34～18.74mg/kgFW；柑类中，与蕉柑和贡柑(β-隐黄质含量分别为6.76和3.09mg/kgFW)相比，温州蜜柑(编号19～21)富含较多的类胡萝卜素，3个品种的β-隐黄质的变幅为8.92～14.29mg/kgFW；杂柑中，类胡萝卜素含量普遍较低，除蜜可露和默科特(β-隐黄质分别为15.25和14.34mg/kgFW)，其余品种β-隐黄质的变幅为0.30～5.30mg/kgFW，旭柑最低。
2.5.4不同品种果皮中类胡萝卜素含量差异
从总量上看，八月桔果皮中类胡萝卜素含量最高，高达80.85mg/kgFW，爱媛38最低(7.02mg/kgFW)。橘类的类胡萝卜素含量最为丰富，平均含量为47.94mg/kgFW；与果肉中不同，杂柑果皮中的类胡萝卜素平均含量(28.71mg/kgFW)略高于柑类(21.80mg/kgFW)。橘类的β-隐黄质平均含量为30.70mg/kgFW，约为柑类的2.29倍，杂柑类的1.80倍。橘类的玉米黄质的平均含量为11.18mg/kgFW，明显高于杂柑类(7.52mg/kgFW)和柑类(5.44mg/kgFW)。橘类的叶黄素的平均含量为5.00mg/kgFW，明显高于杂柑类(3.56mg/kgFW)和柑类(2.39mg/kgFW)。与陶俊报道的结果[7]相比：总体上类胡萝卜素含量相当，橘类中南丰蜜桔总量偏低，本地早的β-隐黄质和总量均偏低，杂柑类中默科特的β-隐黄质和总量均偏高。
宽皮柑橘果实中含有丰富的类胡萝卜素物质，但生长环境和基因差异导致不同宽皮柑橘品种类胡萝卜素的含量存在明显差异。宽皮柑橘中类胡萝卜素以β-隐黄质为主，果皮中含量普遍高于果肉。
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CHENXiyu,JIAOBining*,ZHANGYaohai*
1(CitrusResearchInstitute,SouthwestUniversity&ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Chongqing400712,China)2(LaboratoryofQualityandSafetyRiskAssessmentforCitrusProducts,MinistryofAgricultureandRuralAffairs,Chongqing400712,China)3(QualitySupervisionandTestingCenterforCitrusandSeedling,MinistryofAgricultureandRuralAffairs,Chongqing400712,China)
AbstractAtpresent,themaininternationalresearchesofcarotenoidsincitrusfocusonorangejuice,andlackofstudyonthedetectionanddifferenceanalysisofcarotenoidsindifferentkindsofloose-skinmandarins.Theextractionconditionsofcarotenoidsincitruswereoptimized,followedbyrapidanalysisbyultra-performanceliquidchromatography(UPLC).Thevarietiesandcontentsofcarotenoidcompoundsinpulpsandpeelswerecomparedanddiscussed.Theresultsshowedthat-cryptoxanthinwasthemajorcarotenoidofthetestedloose-skinmandarins,withtotalaveragecontentof8.44mg/kgFWinpulpsand23.73mg/kgFWinpeels.Therewasanotabledifferenceofcarotenoidcontentsandcompositionbetween34varieties,withtheaveragecontentinpulpsdescendingasfollows:tangerines(14.73mg/kgFW)>mandarins(13.51mg/kgFW)>hybrids(8.11mg/kgFW),whiletheorderinpeelswastangerines(47.94mg/kgFW)>hybrids(28.71mg/kgFW)>mandarins(21.80mg/kgFW).Itissignificanttomakefulluseofthefunctionalcomponentsinloose-skinmandarins.
Keywordsultra-highperformanceliquidchromatography(UPLC);loose-skinmandarins;carotenoid
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.020161
第一作者：硕士研究生(张耀海副研究员和焦必宁研究员为共同通讯作者，E-mail：zhangyaohai@cric.cn；jiaobining@cric.cn)。
基金项目：农业部现代农业(柑桔)产业技术体系建设专项(CARS-26)；中央高校基本科研业务费(XDJK2017B034)；国家柑橘及热带作物产品质量安全风险评估专项(GJFP2019012,GJFP2019043)