戴金岳1，曾宪文1，方利敏1，姚明印2，刘木华2，黄林1,*
（1.江西农业大学生物科学与工程学院，江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室，江西农业大学应用微生物研究所，江西南昌330045；2.江西农业大学工学院，江西省现代农业装备重点实验室，江西南昌330045）
摘要：为研究特定致腐菌在冷却猪肉中的致腐作用机制，将韩国假单胞菌PS1（PseudomonaskoreensisPS1）和梭状芽孢杆菌J4（BacillusfusiformisJ4）分别接种到新鲜冷却猪肉中进行致腐实验，以不接种致腐菌的猪肉为对照，于4℃条件下贮藏，每隔1d测定各组肉样的细菌总数、总挥发性盐基氮（totalvolatilebasicnitrogen，TVB-N）含量、蛋白质含量以及脂肪酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶活力。结果表明：各组肉样细菌总数均呈现先上升后稳定的趋势，贮藏第5天，接种P.koreensisPS1、B.fusiformisJ4的肉样细菌总数均超过8.0（lg（CFU/g）），明显大于对照组；接种特定致腐菌的2组肉样脂肪酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶活力均高于对照组，且呈现先上升后降低趋势，至贮藏第7天，弹性蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶活力均达到峰值，而脂肪酶活力在贮藏第5天达到峰值；同时，各组肉样蛋白质含量不断降低，产物TVB-N含量明显增加，贮藏第5天，接种特定致腐菌的2组肉样TVB-N含量均超出15mg/100g，明显高于对照组。
关键词：冷却猪肉；特定致腐菌；酶活力；致腐机制
本课题组前期从变质冷却猪肉中分离、筛选、鉴定出5株致腐菌，通过TVB-N含量因子测定确定出2株优势致腐菌：韩国假单胞菌PS1（PseudomonaskoreensisPS1）和梭状芽孢杆菌J4（BacillusfusiformisJ4）[12]，并近一步利用原位荧光染色结合激光共聚焦扫描显微镜技术研究特定致腐菌P.koreensisPS1侵染猪肉的方式及其在猪肉中的分布情况，初步探索其对冷却猪肉的致腐作用方式[13]。本研究将特定致腐菌P.koreensisPS1、B.fusiformisJ4回接至冷却猪肉，使其腐败变质，测定该过程中细菌总数、蛋白质、TVB-N含量以及脂肪酶和蛋白酶活力的动态变化，更深入地探索特定致腐菌在冷却猪肉中的致腐作用机制。
冷却里脊肉来自于不同的长白猪，购于江西省南昌市经济技术开发区主要超市肉制品专柜。样品置于密封袋内，放在加有冰袋的保温箱中30min内运回实验室。
特定致腐菌P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4，课题组自行从变质冷却猪肉中分离、鉴定、保藏[12]。
无水乙酸钠﹑乙酸﹑氯化钠﹑氢氧化钠﹑盐酸西陇科学股份有限公司；氧化镁﹑三氯乙酸天津市大茂化学试剂厂；硫酸铜天津市永大化学试剂有限公司；对硝基苯酚上海展云化工有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均为生化试剂）北京奥博星生物技术有限责任公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）和福林酚北京索莱宝（Solarbio）科技有限公司；地衣红-弹性蛋白美国Sigma公司；所用试剂均为分析纯。
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1.3.1菌悬液制备
将甘油管保藏的特定致腐菌P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4菌种在试管斜面培养基上活化，取长势良好、无污染的菌体斜面，用无菌水制备成菌悬液，并利用染色显微镜检计数法计数[14]，即取5μL菌悬液于载玻片1cm2的区域内涂匀，用0.1g/100mL结晶紫染色，油镜镜检并随机选取10个视野进行细菌计数，取平均值计算出菌悬液细胞含量，再用无菌水调整菌体初始浓度约为1×103个/mL。
1.3.2肉样制备
在无菌操作台上将肉样表面切除约0.5cm后，切成大小约为4cm×4cm×2cm的样本60个，平均分成3组，用无菌镊子将每个样品置于酒精灯上灼烧30s，进行表面灭菌；取其中2组分别在制备好的P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4菌悬液中浸润10～15s进行接种[9,15]，取出沥干放入无菌塑料袋中密封，剩余1组不接种作为对照组；样品全部置于4℃冰箱保存，分别于第1、3、5、7、9天的相同时段，3组肉样中各取4个肉样进行细菌总数、蛋白质、TVB-N含量以及脂肪酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶活力测定。
1.3.3指标测定
1.3.3.1肉样细菌总数、蛋白质和TVB-N含量测定
采用GB/T4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[16]中的平板菌落计数法测定细菌总数；采用GB/T5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[17]中的分光光度法测定蛋白质含量；采用GB5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》[18]中的半微量定氮法测定TVB-N含量。
1.3.3.2肉样酶活力测定
参考赵培培[19]的方法测定弹性蛋白酶活力；参考孙文斌[20]的方法测定脂肪酶和胶原蛋白酶活力；参考刘亮亮[21]的方法测定胰蛋白酶活力。4种酶的酶活力单位均为U/g。
采用Excel2010软件进行数据处理，利用Origin2018软件进行图形绘制，DPS7.05软件进行显著性分析（P＜0.05为差异显著）；测定结果用平均值±标准差表示，实验均重复3次。
蛋白质作为里脊肉中主要的营养物质会被微生物分解利用，同时产生氨气、尸胺和腐胺等生物胺，TVB-N含量是评价肉品新鲜度最重要的指标，我国国标规定生鲜肉类TVB-N含量不可超过15mg/100g。
猪肉脂肪中的亚油酸与油酸在氧气和致腐菌所产脂肪酶的作用下先形成过氧化物，再被分解成醛类﹑酮类等小分子物质，致使猪肉的食用价值丧失[24]。
由图3可知：在贮藏前3d，接种特定致腐菌P.koreensisPS1、B.fusiformisJ4和对照组肉样脂肪酶活力快速上升；贮藏第5天，3组肉样的脂肪酶活力均达到峰值，分别为53.85、51.83、47.51U/g，而后酶活力均出现下降趋势，在此过程中接种P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4肉样的脂肪酶活力保持较高水平，均高于对照组。可见，特定致腐菌P.koreensisPS1、B.fusiformisJ4均可产生活性较强的脂肪酶，加快对肉样肌纤维及黏膜中脂肪的破坏，更有利于致腐菌向肉样深层侵染。
肉样蛋白质的分解依靠胰蛋白酶﹑胶原蛋白酶和弹性蛋白酶等的作用来完成，胶原蛋白的破坏导致肉样感官品质发生改变，同时更有利于腐败微生物的侵染。
由图4可知，肉样腐败过程中胰蛋白酶﹑胶原蛋白酶和弹性蛋白酶活力均出现相似的变化趋势，接种致腐菌P.koreensisPS1﹑B.fusiformisJ4及对照组肉样的上述3种蛋白酶活力均呈现先上升后下降的趋势，至贮藏第7天，弹性蛋白酶﹑胶原蛋白酶﹑胰蛋白酶活力均达到峰值，且接种P.koreensisPS1﹑B.fusiformisJ4肉样的蛋白酶活力均明显高于对照组，此后3种蛋白酶活力略有降低。Tsigarida等[25]发现，屠宰后猪肉本身存在内源酶的糖酵解作用，而该作用在pH5.4～5.5时会被终止，此后内源酶对猪肉的影响相较于腐败菌的酶解作用可被忽略。腐败菌先以糖类﹑脂质为底物进行分解，因而贮藏前3d3种蛋白酶活力无明显变化，之后胰蛋白酶、胶原蛋白酶和弹性蛋白酶活力均快速增加，蛋白质的分解也加快（图2A），这可能是由于蛋白质氧化降解受活性氧的影响，而不饱和脂肪酸及脂肪氧化产物丙二醛对活性氧的生成具有促进作用[26-27]。
特定致腐菌P.koreensisPS1﹑B.fusiformisJ4在新鲜冷却猪肉中仍能快速生长，导致细菌总数呈现先上升后稳定的趋势，特定致腐菌优先产生脂肪酶，导致肌肉肌纤维及黏膜中脂肪氧化降解，并在酶活力较强的弹性蛋白酶﹑胶原蛋白酶和胰蛋白酶等多种蛋白酶作用下，促使肉样中蛋白质分解，并增加TVB-N的释放，从而加速冷却猪肉的腐败变质。
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Keywords:chilledpork;specificspoilagebacteria;enzymeactivity;spoilagemechanism
中图分类号：TS251.51
文献标志码：A
收稿日期：2019-09-26
基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31560482）；江西省科技计划项目（20151BBG70063）；江西农业大学大学生创新创业计划项目（201710410086）
第一作者简介：
戴金岳（1994—）（ORCID:0000-0003-3386-4246），男，硕士研究生，研究方向为食品品质安全快速检测。
E-mail:daijinyue1225@126.com
*通信作者简介：黄林（1977—）（ORCID:0000-0002-4434-7861），男，副教授，博士，研究方向为食品、农产品品质安全快速检测。E-mail:huanglin213@126.com