我们开发了两种通过使用序列检测系统（SDS）仪器进行PCR产物检测的试剂：
TaqMan方法
TaqMan方法通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。
使用TaqMan方法的检测类型
TaqMan方法可用于以下检测类型：定量，包括：
SYBRGreenI染料试剂
使用SYBRGreenI染料法的检测类型
SYBRGreenI染料法可用于以下检测类型：
TaqMan试剂
最初，使用嵌入式染料进行实时荧光PCR(qPCR)产物定量。但这些染料存在重大缺点，即会同时检测特异性以及非特异性PCR产物的扩增量。
TaqMan方法的开发
通过引入基于TaqDNA聚合酶5’核酸酶活性的荧光标记探针，实时定量PCR系统得到了显著提升。这些荧光探针的使用，使得实时定量的方法得到了发展，实现了仅对特定扩增产物的检测。此外，荧光标记探针的开发，也免去了用于探针降解分析的PCR反应后处理过程。
TaqMan序列检测方法的工作原理
步骤、过程
两种类型的TaqMan探针
我们可提供两种类型的AppliedBiosystemsTaqMan探针：
推荐用于等位基因检测的TaqManMGB探针
我们一般推荐使用TaqManMGB探针进行等位基因分型分析，特别是当传统TaqMan探针超过30个核苷酸时。TaqManMGB探针包含：
最终，TaqManMGB探针会在匹配和未匹配探针之间展现出更大的Tm值差异，从而提供更准确的等位基因分型。
TaqMan方法的优点
TaqMan方法的缺点：
TaqMan方法的主要缺点在于需要根据不同的序列，合成不同的探针。
一般将可与双链DNA发生结合的小分子分为以下两类：
无论哪种结合方法，用于PCR实时检测的DNA结合染料都需要满足以下两个条件：
我们开发更加优化的条件，使得SYBRGreenI染料的使用不会对PCR产生抑制并带来相对于溴化乙锭更为灵敏的检测。
SYBRGreenI染料法的工作原理
SYBRGreenI染料法通过SYBRGreenI染料与PCR过程中产生的双链DNA结合，而对聚合酶链反应（PCR）的产物进行检测。工作原理：
当SYBRGreenI染料被加入到样品中后，它可立即与样品中的双链DNA进行结合。
SYBRGreenI染料法的优点
SYBRGreenI染料法的缺点：
SYBRGreenI染料法的最大缺点在于可能会产生假阳性信号；即，因为SYBRGreenI染料可与任何的双链DNA发生结合，因此也会与非特异性的双链DNA序列发生结合。
其他注意事项
什么是定量检测？
定量检测是一种实时的PCR(qPCR)检测。测量（定量）每轮PCR扩增循环中，检测目标核酸片段的量。目标分子可以为DNA、cDNA或RNA。此方法指南主要对以下三种定量检测进行讨论：
定量分析常见术语
实时PCR(qPCR)定量检测工作原理
在PCR的起始循环中，荧光信号几乎不发生变化。从而定义为扩增曲线中的基线。而超出基线部分的荧光的增加，则为对累计目标分子的检测。固定的荧光阈值线，可设置在基线之上。荧光超过固定阈值时的循环数则为参数CT（阈值循环）。
当对定量检测的结果进行计算时，可以采用绝对或相对定量。
什么是绝对定量？
绝对定量检测是根据标准曲线对未知样品进行的定量。
示例
绝对定量可根据病毒的拷贝数，监控疾病状态。研究者须知道特定生物学样品中目标RNA分子的准确拷贝数，以对疾病的进展进行监测。绝对定量可通过从所有SDS仪器获取的数据进行，但注意标准品的绝对定量则须首先通过其他方法获取。
什么是相对定量？
相对定量用于分析特定样品相对于参照样品（比如，未处理的对照组）某个基因表达量的变化。
相对定量可用于检测化合物（药物）引起的基因表达改变。经化学处理样品中的特定目标基因的表达水平可与相对未处理样品中的基因表达水平进行比较。
相对定量的计算方法
相对定量可根据从所有SDS仪器获取的数据而进行。用于相对定量的计算方法有：
确定使用哪种方法所有方法都可产生同等的结果。当在确定使用哪种方法时，需要注意：
常用术语
绝对和相对定量中常用的术语，如下：
概述
因采用的是相对于基础样品的表达量，例如校准品，用于相对定量的标准曲线一般都比较容易绘制。对于所有的实验样品，其目标分子的量均是从标准曲线获取，然后除以校准品的目标分子量而确定的。因此，校准品便成为1X样品，而所有其他的量则都为以n倍校准品来表示。例如，在研究药物对表达产生的影响时，未处理的对照样品便是合理恰当的校准品。
关键指南
以下指南可为相对定量中标准曲线的正确使用，提供关键指导：
内源性对照
对于内源性对照进行扩增可用于对加入至反应的样品RNA或DNA的量进行标准化。对于基因表达定量，研究者采用过-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、核糖体RNA（rRNA）或其他RNA作为内源性对照。
标准品
由于样品量会除以校准品的量，则标准曲线中的单位便被去除了。因此，对于标准品来说所有需要知道的只是它们的相对稀释比。对于相对定量，任何含有合适目标分子的RNA或DNA储存液都可用作标准品。
比较CT法与标准曲线法相似，只是它利用的是算术公式2ΔΔCT来获取相同的相对定量结果。
算术公式：
为了有效地利用比较CT法，目标分子（基因）和对照（内源性对照）的扩增效率应当近似相同。更多关于使用比较CT法进行相对定量的信息，请参阅用户手册#2：基因表达的相对定量（PN4303859）。
用于绝对定量的标准曲线法与用于相对定量的标准曲线法类似，只是标准品的绝对量必须首先通过其他独立方法获取。
下面的指南对于绝对定量中标准曲线的正确使用十分关键：
无法使用DNA作为RNA绝对定量的标准品，因为对于逆转录过程的效率没有对照。
标准品的绝对量必须首先通过其他独立的方法获取。质粒DNA和体外转录的RNA通常用于制备绝对标准品。浓度可在A260处被测量得到，并通过使用DNA或RNA的分子量转化成拷贝数。
PCR过程以及5’核酸酶处理受到RocheMolecularSystems,Inc.以及F.Hoffmann-LaRocheLtd.所拥有的专利保护。