18/18《家畜繁殖学》实验《动物繁殖学》实验
动物科学2009级
授课教师：何兰花
2009年9月
实验须知
1、实验前，必须认真预习实验指导书，了解实验目的、原理和方法。
2、严格按照实验操作规程及有关要求进行实验，独立完成各项操作，作好实验记录，依时缴交实验报告。
3、爱护公物，小心使用各种仪器设备，如有丢失、损坏，应立即向老师汇报，并如实在实验室的记事本上登记；节约使用实验材料、药品以及水电，避免浪费，并注意使用药物时滴管一定要专用，用完后立即放会原来的药瓶以避免污染。
4、保持良好的实验秩序，保持安静，保持实验室整齐清洁，废弃物品丢入指定
容器。实验完毕清理（洗）仪器用具，并放回原位，整理桌面，把凳子拿到墙边排号，经上课教师检查同意方可离开。值日生打扫地面，关好水电门窗。
5、注意安全，勿踏地上电线和开关、插头，不可随便动与本实验无关的仪器。
目录
实验一人工授精器材的配置认识及假阴道的安装调试第7周实验二睾丸、卵巢的组织学切片观察第9周实验三精液品质的常规检查及理化因素对精子的影响第11周实验四精子数量计数和畸形率的测定第13周实验五不同畜种精液稀释液的优化第15周
实验一人工授精器材的配置认识及假阴道的安装调试
[实验目的]
1．熟悉家畜人工授精所使用的各种器械，了解其用途、构造和使用方法。
2．掌握假阴道的安装步骤和方法。
[实验内容]
介绍家畜人工授精的主要器材以及假阴道的安装步骤和方法。
[实验仪器、设备及材料]
1．消毒用具高压蒸汽灭菌器、煮沸消毒器、酒精灯、紫外线灯。
2．采精用具各种家畜假阴道、假台畜、温度计、玻璃棒、润滑剂、长柄钳等。
3．精液品质检查用具量精杯、显微镜、显微镜保温箱（或显微镜恒温盘）、血球计数室（在显微镜下找出）、酸度计、烧杯、载玻片、盖玻片、玻棒等。
4．配制稀释液用具及运输、保存精液容器量筒、天平、药匙、漏斗架、滤纸、冰箱、广口保温瓶、贮精瓶。
5．输精用具各种家畜输精器、阴道扩张器、头灯或手电筒、长臂手套等。
6．精液冷冻设备液氮机、液氮罐、精液冷冻器械（制颗粒冻精盒）、细管精液制备机等。7．一般用品玻棒、毛巾、棉花、纱布、玻璃瓶、标签、瓷盘、水桶、肥皂、工作服等。8．常用药品酒精、新洁尔灭、稀释液用药品、白凡士林、染色剂、蒸馏水等。
[实验步骤]
一、人工授精器械的结构和组成
1．假阴道的结构和组成
（1）牛、羊用假阴道（各种家畜采精用的假阴道主要由外壳、内胎、集精杯、活塞、固定圈等部件组成。）
牛、羊假阴道的构造基本相同，唯羊用假阴道较短小。外壳系用硬橡胶或硬质塑料制成的圆筒，中部有一注水孔，可注入热水并通过气门活塞进行充气。内胎由优质橡胶制成，装入外壳内，两端翻卷固定在外壳上，加固定圈固定之，在假阴道的一端安装上集精杯。（目前有些国家将其内胎面制成粗糙面，以增强采精时对阴茎的刺激。）
集精杯有两种：一种是夹层棕色玻璃集精杯，夹层可盛35℃左右的温水以保护精子免受低温打击，外面用专用的集精杯固定套固定。另一种是在橡胶漏斗上接上一个有刻度的玻璃管，连同假阴道－并装入人造革保温套内。
（2）猪用假阴道
猪用假阴道的外形和构造基本上与牛、羊假阴道相同。不同的是较牛假阴道短些，集精瓶为350-500ml棕色有刻度的广口玻璃瓶，用乳胶漏斗固定在假阴道外口上。
在生产实践中，猪通常用手握法采精，只需备一只医用乳胶手套和一个收集精液的保温杯。
2．输精器械
输精器械主要为扩张器、输精管和照明灯。
扩张器有两种，一种是鸭嘴式（金属），另一种是圆筒式（玻璃或塑料），各种家畜的扩张器只是大小上的区别。
输精器有玻璃、金属、塑料、橡皮制成的。马、猪的输精器，为一端尖细的优质橡皮
管，马的较粗和长，猪的细和短，输精管的一端接注射器。牛、羊的输精器是由金属或玻璃制成的输精管，其后连接一个橡皮球或注射器。牛的输精器比羊的粗和长。牛多采用直肠把握法输精，所采用的输精器多为金属输精器。细管冷冻精液输精枪由金属外壳、推杆以及一次性塑料外套组成，每次配种后更换新的一次性塑料外套即可，不需要消毒就可连续使用。使用时将细管的封口一端剪去，将另一端插在输精枪的推杆上，推动椎杆，借助细管中的封闭塞即可将溶解后的精液排出。
3．冷冻精液设备
（1）冷源（常用冷源为液氮、干冰）
液态氮是利用空气分离设备-液氮机，将空气重复压缩、膨胀、冷却、液化后呈透明状的液化空气。再将液化空气进一步冷却，即可分离成为液化氮、液化氧和液化氩。液氮的温度为-196℃。
（2）冷冻精液保存容器
保存冷冻精液的专用容器为液氮容器。液氮是超低温的液化气体，吸热后易气化，所以液氮必须保存在专用的液氮容器内，贮氮容器有：杜瓦瓶、贮氮罐、贮氮槽、贮氮车和贮精罐等。大型容器可贮数千升液氮，小的可容数十升，最小的不到1L。保存冷冻精液常用的是中、小型液氮罐。是由耐腐蚀和防锈的铝合金制成。外层称为外壳，上有罐口、手柄及密封的抽气孔。内层亦为金属制成的瓶罐。在罐颈处是以铝合金相同热膨胀系数的玻璃钢，用低温粘合剂牢固粘在一起。液氮罐采用高真空和多层绝热的结构形式进行绝热。容器的内、外层之间抽空形成6666Pa（50mmHg）的高度真空，并放置有适量的、经过真空干燥处理的低温吸附剂和常温吸附剂。在有效期内，对于容器材料的放气及漏进容器的活性气体（N2、O2、CO2等）几乎全部吸收，从而维持容器的真空度。罐塞是由塑料制成并留有空隙，以保证排出氮气通畅，保障液氮罐的安全使用。在罐颈处可以固定数个提筒用于贮存精液。液氮罐因不同容量而有不同型号。
（3）冷冻精液类型
颗粒型：将精液在液氮降温的冷冻板上滴冻成0.1ml左右的丸剂，待用解冻液溶解后，用一般人工授精输精器输精。
安瓿型：将精液分装于安瓿中，在液氮蒸气中冻结。加热溶解后用一般人工授精器输精。
细管型：将精液分装于0.5ml或0.25ml的细塑料管内，经液氮蒸气冻结，加热溶解后，用专用的细管精液输精器输精。（要有专用机器才能制细管冻精）
4．高压灭菌器
高压灭菌器系由合金制成，轻便耐用，适用于少量物品灭菌，因此为人工授精站广泛采用。其主要构造为器身、器盖及器内的安置桶所组成，盖上附有压力表、安全阀门与放气软管，在安置桶壁设有一小筒，用以插入放气软管，桶底面有多孔的隔板。
使用时先在灭菌器内放入2500-3000ml的清水，再将盛有需灭菌的各种人工授精器械、物品的安置桶放入器身内，合上气盖，同时注意将放气管插入安置桶壁的小筒内，将锁紧螺丝扭紧，使气盖平稳、牢固地密合以免漏气。然后将灭菌器置于火炉上加热，此时可将放气阀门的手柄直立，待灭菌器内的空气排尽而有白色蒸汽冒出时再关闭阀门。或者待压力表指针升至49.03kPa左右时打开放气阀门以排放空气，当空气排尽而有白色蒸汽冒出时再关闭阀门，并继续向灭菌器加热。灭菌器的压力要求维持在68.65kPa（温度为115℃）
经30分钟，或98.07kPa（温度为120℃）经20分钟。灭菌完毕后，等待压力表指针下降至零度时，将放气阀门打开，放尽灭菌器中的蒸汽，趁热打开灭菌器，取出各种物品备用。
[消毒器械和稀释液时，要求灭菌器压力维持在0.7kg／cm2（器内温度为115℃）经30min消毒。若只消毒器械，可维持1.0kg／cm2（温度120℃）经20min即可。]
5．在显微镜下找出血球计数室每块血球计数板有上下两个计数室，使用时物镜只须对准其中1个就行。每个计数室面积为1mm2，深为0.1mm，由25个大方格构成（双线），每个大方格又分为16个小方格。（注意光线为暗视野且光线方向不要与竖线相同。）
二、假阴道的安装
1．安装前的检查工作
（1）假阴道外壳是否有裂缝或小孔。
（2）假阴道内胎是否漏气、内胎的光滑面应为内壁，边缘是否有裂损。
（3）气门活塞是否完好或漏气、扭动是否灵活。
2．安装方法
（1）内胎的安装将假阴道内胎装入外壳中，光滑面应朝向内腔。内胎露出外壳两端长短应相等，将假阴道外壳夹在安装者的大腿之间，使内胎的两端翻卷于外壳两端上，内胎应平整不得扭曲，内胎的中轴应与外壳中轴重合，即内胎和外壳的两端应成为同心圆位置，用橡皮圈将两端扎紧。
（2）消毒先用长柄钳夹取75％酒精棉球擦拭消毒内胎和集精杯，再以95%的酒精棉球擦拭，待酒精挥发干燥后方可用于采精，采精前用稀释液冲洗1-2次。
（3）集精杯的安装装上集精杯，外加集精杯保护套。
（4）涂润滑剂用消毒玻棒取适量灭菌凡士林与石蜡油的混合物，均匀地涂于内胎腔的前1／2段（与阴茎接触部分）的表面，以利于采精时阴茎导入。
（5）注水从注水孔向假阴道夹层内注入50-55℃的温水，使其能在采精时的温度保持38-40℃。注水量为夹层容积的1/3~1/2（牛约500ml左右），装上气门活塞。
（6）调节假阴道内腔压力打开气门活塞，吹入适量空气，使内胎一端的中央形成“Y”形。
（7）测量内腔温度用消毒的温度计插入假阴道内腔，待温度不变时再读数，一般温度为38-40℃。
（8）防尘用消毒毛巾盖住假阴道的开口端，以备采精。
[实验注意事项]
1．安装者的指甲须剪短，以免将内胎掐破。
2．安装好的假阴道须稳妥平置，勿碰及其他硬物，以免损伤内胎。
[思考题]
1.各种公畜采精器械的设计原理及优缺点是什么？
2.试述牛假阴道的组成和安装时要求；进行采精时应具备哪些条件？
实验二睾丸、卵巢的组织学切片观察
1.通过观察家畜睾丸和卵巢组织切片，了解家畜睾丸、卵巢的组织结构及其形态。
2.掌握精子的发生和卵子的发生、卵泡的发育过程及其形态。
1.材料公畜睾丸，母畜卵巢组织切片及挂图
2.器械显微镜、投影仪。
一、睾丸的组织学观察
教师先结合投影仪进行讲解，使学生对公畜睾丸、母畜卵巢组织学结构及精子发生、卵泡发育过程有了初步的了解。然后再用显微镜观察睾丸、卵巢组织切片。
1．低倍镜观察
①被膜：由浆膜和白膜构成。外层浆膜为一较薄的固有鞘膜，从腹膜延伸而来。内层的白膜为弹性结缔组织构成的、致密的、白色薄膜层，其中含有丰富有血管。白膜下为实质部分，即睾丸的功能层。
②睾丸纵隔和中隔：睾丸纵隔为睾丸白膜从睾丸头伸向睾丸实质的结缔组织索，并向四周发出许多放射状的结缔组织小梁，伸向白膜。这些结缔组织小梁称为睾丸中隔。猪的睾丸中隔较发达，牛、羊的薄而不完整。
③睾丸小叶：由睾丸中隔将睾丸实质分成许多基部朝向、顶端向内的锥形小叶，每个小叶由2-3条盘曲的曲精细管及血管和间质细胞组成。曲精细管直径约200μm。据估测，牛的曲精细管拉直，头对头连接，可长达几千米，站睾丸重量的80%。
④附睾：曲精细管在各小叶的尖端先各自汇合成直精细管，穿入睾丸纵隔结缔组织内，形成弯曲的导管网，称为睾丸网（马无此结构），为精细管的收集管道。睾丸网又分出12～15条睾丸输出管，汇入附睾头形成附睾管，经附睾体、附睾尾最后过渡为输精管。
2．高倍镜观察观察睾丸小叶的结构和睾丸小叶中精细管及间质细胞的结构和形态。观察精子在发生周期中主要阶段和支持细胞形态。
①睾丸小叶的结构：有曲精细管及其间质细胞构成。此外，还有血管、淋巴管等。
②间质细胞：又称Leyding细胞。体积较大，分布于曲精细管之间，近似卵圆形或多角形，胞质嗜酸性，核大而圆，具有分泌雄激素的功能。
③曲精细管的结构：曲精细管的管壁自外向内由同心圆状排列的结缔组织、基膜和复层上皮构成。上皮细胞成层地排列在基膜上，可分为生精细胞和支持细胞两种。
④支持细胞：又称Sertoli（塞托利氏）细胞或足细胞。体积较大而细长，数量较少，为高柱状或锥状细胞，属于体细胞。呈辐射状排列在曲精细管中，其侧面嵌含各个发育阶段的生殖细胞之间，其底部附着在曲精细管的基膜上，游离端一直伸达精细管的管腔，常嵌含有许多精子。该细胞高低不等，界限不清，细胞核较大，位于细胞的基部，着色较浅，核仁明显，但不显示分裂现象。由于它的顶端有数个精子伸入胞浆内，故一般认为此种细胞是对生精细胞起着支持、营养、保护等作用。足细胞失去功能，精子便不能成熟。
⑤生精细胞（生殖细胞）：数量比较多，成群的分布在足细胞之间，大致排列成3-7
层（同心圆排列）。根据不同发育阶段的形态特点又可分为：精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞和精子。
a精原细胞：位于最基层，紧贴基膜，常显示有分裂现象。细胞体积较小，呈多边形或圆形，细胞质比较清亮，核大而圆，富含染色质，因而着色较深。仔细观察A、B、中间型3类。精原细胞是精子生成的干细胞。
b初级精母细胞：位于精原细胞上面，排成几层，常显示有分裂现象。细胞呈圆形，体积较大，核呈球形，富含染色体，故着色较深。分裂时，因染色体所处不同的活动时期而呈线状、棒状或粒状。在最初阶段与精原细胞不易区别。随着细胞离开基膜向管腔移动，胞浆逐渐增多，胞体逐渐变大，初级精母细胞开始具有明显的胞核。不久便进入成熟分裂的前期，并经过中期、后期和末期逐渐完成第一次成熟分裂，产生两个较小的次级精母细胞。次级精母细胞的细胞核内染色体数目比初级精母细胞减少了一半成为单倍体，因此这种分裂又称为减数分裂。
c次级精母细胞：位于曲精细管的浅层、初级精母细胞的内侧，常处于分裂状态，由于次级精母细胞形成后，很快分裂为2个精细胞，因而在切片上很难发现。细胞体积较小，呈圆形，与初级精母细胞相似。细胞核为球形，染色质呈细粒状，不见核仁。
d精子细胞：由次级精母细胞分裂而成，位于精母细胞内侧，靠近曲精细管的管腔，常排列成数层。并且多密集在足细胞游离端的周围。细胞呈圆形，体积更小，胞浆少，含有许多线粒体以及明显的高尔基体和中心体，有时在核旁的高尔基体区可见顶体粒。核小、呈球状，染色深，核仁清晰。精子细胞不再分裂，在支持细胞顶部经过一系列复杂的形态变化后形成高分化的精子。
e精子：有精子细胞经形态变化而成，位于或靠近曲精细管的管腔内。刚形成的精子头部常深入支持细胞游离端，尾部朝管腔。随着精子发育成熟，便脱离支持细胞，游离在管腔内。精子分头、颈、尾3部分，形似蝌蚪。头部多呈扁卵圆形，染色深，含有核物质，常深入足细胞的顶部胞浆中；尾部朝向管腔。精子发育成熟后脱离曲精细管的管壁，游离在管腔中，随后进入附睾。精子是一种独特的细胞，不含细胞质，成熟后具有前进运动的能力。
3．精子发生过程精子发生过程（spermatogenesis）可分为2个明显的时期。第一时期是精原细胞生成：精原细胞经一系列分裂形成精子细胞。第二时期是精子细胞变态形成精子。
初级精母细胞不就进入成熟分裂的前期，经过中期、后期和末期逐渐完成第一次成熟分裂，产生2个较小的次级精母细胞，这一阶段可达15-16天。几个小时后，次级精母细胞进行第2次成熟分裂，形成2个精子细胞。精子细胞不再进行分裂，经过一系列复杂的形态变化形成精子，这个阶段可持续10天。一个精原细胞可以分裂为16个初级精母细胞或64个精子。
随着精子发生的进行，生精细胞逐渐由曲精细管基膜移向管腔。精子发生整个过程的完成，羊需要46-49天；猪稍短些36-40天；牛稍长些56-63天。
二、母畜卵巢的组织学观察
在低倍镜下找出卵巢表面上皮和白膜，区分卵巢的皮质部和髓质部。
①生殖上皮：位于卵巢皮质的最外层，在幼年家畜为单层柱状或立方上皮细胞所组成，随着年龄增大，这些细胞变成扁平细胞。马卵巢表面上皮仅分布于排卵窝。其余部分被浆膜覆盖。
②白膜：位于生殖上皮之下的一薄层致密结缔组织。
③皮质部：位于白膜下面，是卵巢的外周部分（马的则位于卵巢中央靠近排卵窝处）。皮质部由许多大小不等的发育卵泡、闭锁卵泡、少量黄体以及致密的结缔组织所构成。占卵巢的大部分，与髓质无明显界限。由于皮质部含有卵泡和产生卵巢激素的细胞，故也称“功能层”。
④髓质部：位于卵巢中央（马髓质部在卵巢周围），内含有许多细小的血管、神经和富有弹性纤维的疏松结缔组织。
2．高倍镜观察
①卵泡发育的观察：主要观察卵巢皮质部不同发育阶段的卵泡，卵泡是由位于中央的卵母细胞和围绕在卵母细胞周围的卵泡细胞所组成。有的卵泡在发育过程中可能退化而形成闭锁卵泡。可根据发育程度不同，卵泡可分成以下几种类型。
a原始卵泡：位于皮质部最外层，呈球形。初级卵母细胞位于中央，周围包有一单层扁平的卵泡（颗粒）细胞。卵母细胞的体积比较大，中央有一圆形的泡状核，核内染色质稀少，着色较浅，核仁明显。卵泡细胞体积小，核扁圆形，着色深。原始卵泡中的卵母细胞是由卵原细胞经过多次分裂增殖，最后停止于第1次成熟分裂前期的双线期的初级卵母细胞。所有的原始卵泡在出生前就已形成，并处于贮备状态未再发育。常常在皮质外层外周成群的出现，故称作“卵窝”。据估计，一头出生牛犊卵巢中有大约75000个原始卵泡。
b初级卵泡：呈球形，直径为30-50μm，初级卵母细胞迅速生长，位于卵泡中央，周围包着一层立方形的卵泡细胞。初级卵母细胞体积较大，中央有个圆形的泡状核，核内染色质稀少，着色较浅，核仁明显。胞浆中除含有少量线粒体和和内网器以外，还含有少量卵黄颗粒。
c次级卵泡：初级卵泡经过发育和生长，即成为次级卵泡。卵母细胞体积基本不变，但外围的卵泡颗粒细胞生长。体积增大。卵母细胞由多层颗细胞所包围，其外形成卵泡膜。卵母细胞和颗粒细胞共同分泌黏多糖，聚集在颗粒细胞与卵黄膜之间形成透明带，并由颗粒细胞长出绒毛渗透到透明带内，为卵母细胞提供营养。此时卵泡腔尚未出现。
d三级卵泡：卵泡体积增大，颗粒细胞之间有液体形成并将它们分开，形成许多小卵泡腔。小卵泡腔逐渐合并为不规则的大卵泡腔。随着卵泡液的增多，卵泡腔进一步扩大，卵母细胞被挤向卵泡的一侧，并被包裹在一团颗粒细胞中，形成突出于卵泡腔的半岛，称为卵丘。其中初级卵母细胞逐渐发育增大，胞浆中卵黄颗粒增多。透明带周围的颗粒层细胞呈放射状排列，成为放射冠。在卵泡基膜外形成两层卵泡膜，及血管性内膜和纤维性外膜。
e成熟卵泡：也叫Graafian卵泡。其卵泡体积很大，贯穿于卵巢的皮质部，突出于卵
巢表面。卵泡腔内充满卵泡液。此时初级卵母细胞长大成熟，核呈空泡状，染色质很少，核仁明显，胞浆内富有卵黄颗粒。卵泡膜的内外两层界限明显，内膜增厚，内膜细胞肥大类脂质颗粒增多。由于卵泡液的增多，卵泡腔的扩大，颗粒层随之变薄，细胞排列整齐。为适于卵细胞的排出，有时可见到细胞分裂，透明带增厚，放射冠与周围的卵泡细胞之间出现裂缝，彼此的联系松弛。
牛、羊、猪的卵泡在排卵前（马排卵后）初级卵母细胞完成第一次减数分裂，形成大小不等的2个细胞，大的称为次级卵母细胞，小的称第一极体。透明带变厚。极体呈卵圆形，位于卵周隙内，主要由核质构成，以后逐渐退化。所形成的次级卵母细胞随即开始第2次成熟分裂，但至中期（M）休止，其成熟分裂的恢复并完成是在受精过程，产生合子（受精卵）及第二极体。因此，牛、羊、猪、马等家畜没有真正的卵子存在。
f闭锁卵泡：卵巢内各个发育阶段逐渐退化的卵泡叫闭锁卵泡，退化的卵母细胞存在于未破裂的卵泡中。初级卵泡退化后，一般不留痕迹。但生长卵泡退化时，可观察到萎缩的卵母细胞和膨胀塌陷的透明带。
②黄体：是排卵后卵泡有关组织发育而来的一种富含血管的内分泌器官。牛、羊、猪的黄体位于卵巢皮质，突出于卵巢表面。马的黄体则完全埋藏在卵巢基质内。黄体由粒性黄体细胞核膜性黄体细胞组成，粒性黄体细胞占多数，多位于黄体中央，细胞呈多面体，着色浅，排列紧密，含有球形细胞核；膜性黄体细胞体积较小，多位于黄体外周，为要在粒性黄体细胞的周围或其间，核占胞体的大部分，核与胞质染色较深。黄体的中央有结缔组织。根据黄体发育阶段而分成下列几期：
a血体期：卵泡破裂后，血液流入卵泡腔内，形成血凝块，也叫红体期。
c血管盛开期：血管与结缔组织伸入黄体中心，形成花彩状，黄体细胞清晰可见。
d成熟期：黄体增大到最高峰，黄体内各种结构明显。
e白体期：黄体退化、萎缩，变成白色的痕迹。
三、输卵管与子宫的组织学观察
1.输卵管组织学观察输卵管从内向外有粘膜、肌层和浆膜3层不同细胞层构成。
①黏膜：由上皮和固有膜构成。黏膜形成若干初级纵襞，在壶腹部又分出许多次级纵襞。
a上皮：由单层柱状纤毛上皮和无纤毛的分泌细胞组成。在伞部和壶腹部的纤毛较高，延向子宫端逐渐变低。纤毛向子宫端颤抖，有助于卵子的运送。分泌细胞含有分泌颗粒和糖原，其分泌物可供卵子营养。
B固有膜：由致密的纤维性结缔组织构成，但在壶腹部的组织较疏松；结缔组织可伸入皱襞构成支柱。在伞部固有膜内含有大量的静脉和平滑肌。
②肌层：肌层可分为内层环状或螺旋状肌束和外层纵行肌束。其中混有斜行纤维，使整个管壁能协调性地收缩。靠近子宫端的肌层较厚，伞部的外纵肌消失，仅含有分散的肌细胞。
③浆膜：为输卵管壁最外层，主要有结缔组织构成。在肌层和浆膜之间有很宽的一层
疏松结缔组织，叫浆膜下层，其中含有卵巢和子宫血管的分支、淋巴管、神经和纵行平滑肌。
2.子宫组织学观察
①黏膜：由上皮和固有膜构成。
a上皮：为单层柱状上皮细胞，有时有纤毛。无纤毛的柱状细胞有分泌功能，上皮陷入固有膜内形成子宫腺。
b固有膜：又称内膜基质，为环形的结缔组织。其纤维较细含有网状细胞，网眼中有各种白细胞及巨噬细胞。固有膜内含有大量的淋巴管、血管和子宫腺。
子宫腺：为弯曲的分支管状腺，腺管壁有单层柱状上皮构成，多为分泌黏液的细胞，纤毛细胞较少。子宫腺管壁外围有分层的结缔组织鞘，鞘和固有膜之间存在许多组织间隙。子宫腺以子宫角最发达，子宫体较少，子宫颈则在皱襞之间的深处有腺状结构，其余部分为主状细胞。
②肌层：肌肉层的外层薄，为纵行的肌纤维；内层厚，为螺旋形的环状肌纤维。子宫颈可看作子宫肌的附着点，同时也是子宫的括约肌，其内层特别厚，且有致密的胶原纤维和弹性纤维，是子宫颈皱襞的主要构成部分，内外两层交界处有交错的肌束和血管网。
③外膜：为浆膜，由疏松结缔组织和间皮组成。
1．绘出并注明睾丸曲精细管及其所含细胞的构造图。
2．绘出并注明卵巢组织结构及卵泡发育各阶段示意图。
实验三精液品质的常规检查及理化因素对精子的影响
1．掌握精液常规检查的方法，锻炼评定精液品质的能力。
2．验证理化因素对精子运动及生存性能的影响。
*精液品质检查的目的在于确定精液品质的优劣，以此作为精液稀释、保存的依据。同时，也反映种公畜饲养管理水平和生殖器官的机能状态，以及精液在稀释、保存、冷冻和运输过程中的品质变化及处理效果。
1．猪精液品质感官检查、精子密度和活率检查。
2．温度、渗透压、化学药物、pH值等理化因素对精子的影响。
1．精液选用牛、羊、猪、犬、兔任意一种动物的新鲜精液。
2．器械、药品显微镜、显微镜保温箱（或显微镜恒温台）、载玻片、盖玻片、搪瓷盘、温度计、滴管、擦镜纸、pH试纸、红外线灯、冰块、纱布、蒸馏水、3％和0.9％氯化钠溶液、2％煤酚皂溶液、1/1000新洁尔灭溶液、75％酒精、pH为4、7、10的0.9%氯化钠溶液。
3．其他精子密度挂图及有关图表。
一、精液的感官检查
1．测定射精量
2．色泽、气味观察
观察精液的色泽并嗅闻气味。乳白色或浅灰色是精液的正常颜色，精子密度越大，颜色越深，如有其他颜色则不正常，表明公畜生殖器官有病变。精液呈淡绿色时说明已混入脓汁，淡红色表明混入血液，黄色则混入尿液。凡是颜色异常的精液均不得用于输精，同时停止采精并及时查明病因给予治疗。
正常精液微有腥味，若精液中可嗅到尿味或脓腥味时，则不得用于输精，气味异常者常伴有色泽的改变。
3．云雾状的观察
通过透明的玻璃瓶观察精液翻腾滚动的云雾状态。亦可取原精液1滴于载玻片上，不加盖玻片，用低倍镜观察精液的云雾状是否翻腾滚动，主要反映的是高密度和高活率精液的综合指标。并按以下符号记入表内，云雾状显著者以“+++”表示，有云雾状者以“++”
表示，云雾状不明显者以“+”表示。云雾状在牛、羊的精液很明显，猪和马的则不明显。但单采猪精液的中间浓部分亦能观察到云雾状。云雾状越明显说明精子密度越大，活力越高。
4.PH值的检测
用玻璃棒取一滴原精液滴于pH试纸上，立即在标准比色板上比色，然后读出相应的数据，即该精液的pH值。
*若采出的精液继续在体外停留，可能会受到所处的环境温度、精子密度、代谢等因素的影响，常常造成pH不同程度的降低。当精液被微生物污染精子大批死亡时，由于精子自身的分解，氨含量增高，会使pH上升。
二、精子活率评定
1．目测评定法精子的活力受温度影响很大，采精后最好立刻在25℃左右的实验室内进行，将精液处于37℃温度下检查活力，在评定精子活率的同时也可以测定精子的密度。
操作方法：用玻璃棒蘸取1滴原精液或经稀释的精液（马、猪精液的精子密度低，可不须稀释，而牛、羊精液的精子密度大，须用0.9％氯化钠溶液稀释，其温度须与精液温度相近），滴在载玻片上，加上盖玻片，其间应充满精液，不使气泡存在，也可滴在盖玻片上翻放于凹玻片的凹窝上，置于显微镜下放大250-400倍检查。注意显微镜的载物台须放平，最好是在暗视野中进行观察。
精子的活动有3种类型：直线前进运动、旋转运动和原地摆动。评价精子的活率是根据直线前进运动精子数的多少而定的。
精子活率=呈直线前进运动精子数/总精子数×100%
目前评定精子活率等级的方法有两种：
十级制——在显微镜视野中估测直线前进运动精子所占全部精子的百分数。直线前进运动的精子为100％者评为1.0级；90％者评定为0.9级；如此类推。
牛及羊的精液中由于副性腺分泌物少，精子密度大，因此要求精液达到“密0.6”级（即密度为“密”，活率为“0.6”级）或“中0.8”级以上才能作为合格的精液。而马、猪的精液中副性腺分泌物多，精子密度小，因此正常的精液定为“中0.6”或“稀0.8”以上的等级。（猪精液中含有淀粉状的固态胶状物，能凝固，富有粘着性，在自然交配时形成子宫栓防止精液倒流，而在人工授精时应过滤除去。）
在检查活率时，为了取得比较客观的评定结果，应在一个玻片上制作2个样品，每个样品观察3~5个视野，最后综合评定活率。目测评定活力简单易行，但带有一定的主观性，正确的评定需要丰富的实践经验。目前种公牛站及条件较好的人工授精站都有电视生物显
微镜，显示精子图象可供多人观察，因此可综合做出比较客观的评定。
操作方法：取小试管1支，内盛1%刚果红染液1ml，加入精液1~2滴，置37℃水浴浸染15~20min，然后滴1滴于载玻片的一端，再滴1滴5%苯胺黑或苯胺蓝，充分混匀后，马上抹片，用500-600倍显微镜观察，死精子着红色，活精子不着色。计数200个精子即可算出死活精子的百分率。
活精子百分率=活精子数/总精子数×100%
三、精子密度检查测定精子密度通常有3种方法：目测法、血细胞计数法和光电比色法。（本实验用目测法）
取1小滴精液滴在清洁的载玻片上，加上盖玻片，使精液分散成均匀一薄层，不得存留气泡，也不能使精液外流或溢于盖玻片上，置于显微镜下放大250-400倍观察，按下列等级评定其密度。
密——在整个视野中精子密度很大，彼此之间空隙很小，看不清楚各个精子运动的活动情况，这一级属于“密”，每毫升精液含精子数约在10亿个以上，登记时记以“密”字。
中——精子之间的空隙明显，精子彼此之间的距离约有一个精子的长度，可以清楚地看到精子的活动情况。这种精液的密度评为“中”，每毫升所含精子数约在2-10亿个之间，登记时记以“中”字。
稀——精子分散于视野内，精子之间的空隙超过一个精子的长度，这种精液每毫升所含精子数在2亿以下，登记时记以“稀”字。
目测法评定精子密度，主观性大，误差也较大，但方法简便，通常与活率检查同时进行，在生产上有一定的参考意义。
四、理化因素对精子的影响（在低倍镜暗视野中进行）
1．温度的影响①将采得的新鲜原精液1滴滴在载玻片上，置于显微镜下观察其精子活率，再放在45-50℃温度下2分钟，观察精子活率有何变化。②将采得的新鲜精液立即作精子活率评定后，随后即移入0-5℃温度下经2-3分钟，再将精液温度回升到35-37℃下进行精子活率评定，注意观察降温前后精子活率的变化。
2．渗透压的影响将新鲜原精液作出精子活率评级后，分别在3滴原精液内各加入0.9％氯化钠溶液、3％氯化钠溶液和蒸馏水1滴，混合均匀后观察精子活率及精子形态有何变化。
3．化学消毒药物的影响取3滴精液于载玻片上，评定精子活率后分别滴入以下药物，使之进入精液层内：（1）2％煤酚皂溶液；（2）1/1000新洁而灭溶液；（3）75％酒精。分别观察精子活率及形态有何变化。
4．pH值的影响将新鲜原精液作出精子活率评级后，分别在3滴原精液内各加入pH为4、7、10的0.9%氯化钠溶液一滴，静置片刻后，再观察精子的活率及形态的变化。
[注意事项]
1、取样要准确。
2、使用药品时滴管要专用。
3、用高倍镜检查精液时要加盖玻片，且由低倍到高倍。
4、观察活率要在暗示野中进行
[作业]
1、将本次实验所观测结果填入下列表内。
表10-1种公畜精液品质检查登记表
表10-2理化因素对精子活率影响记载表
2、评定该实验用精液品质。
*精液品质检查的基本原则：
1.避光，恒温；
2.迅速检查；
3.检查过程和环境不得损害精液品质；
4.取样要有代表性；
5.常规重点检查和定期全面检查相结合；
6.全面综合分析，准确评定精液质量等级。
实验四精子数量计数和畸形率的测定
1.掌握血细胞计数法和光电比色计测定每毫升精液所含精子数量的方法。
2.掌握精子畸形率的操作要点。
3.测定每输精头份精液中的有效精子数。
4.学习精液抹片染色方法。
1．精子数量测定。
2．测定精子畸形率。
1．材料任选一种公畜或雄性实验动物的新鲜精液及冷冻精液。
2．器械枪、枪头、小试管、显微镜、载玻片、盖玻片、小精瓶、玻棒、打气球、红细胞及白细胞稀释管、血细胞计算板、手钣计数器。
3．药品3%NaCl、染色液、蒸馏水。
4．血细胞计数室挂图、畸形精子形态图。
*目前大型家畜冻精站采用精子密度测定仪，其测定结果迅速、可靠。
1．精子计数（测定1ml精液的精子数）-血细胞计数测定法
每块血球计数板有上下两个计数室，使用时物镜只须对准其中1个就行。每个计数室面积为1mm2，深为0.1mm，由25个大方格构成（双线），每个大方格又分为16个小方格（单线）。
（1）清洗器械先将血细胞计算盘及盖玻片用蒸溜水冲洗，使其自然干燥。
（2）精液的稀释①根据稀释倍数的要求，用100-1000μl移液器（枪）准确吸取3％NaCl180μl或190μl于小试管中。②用10-100μl的枪吸取精液20μl或10μl注入到小试管中。③盖上试管口，振荡2-3min使其混合均匀。
（3）精子的计数①将擦洗干净的计算盘置于显微镜载物台上，在计算室上盖上盖玻片，并在低倍镜下找到计算室（暗视野）。②将试管中稀释好的精液，用玻棒取一滴于计算室上盖玻片的边缘，使精液自动渗入计算室。注意不要使精液溢出于盖玻片之外，也不可因精液不足而致计算室内有气泡或干燥之处，如果出现有上述现象应重新再做。③静置3min以400-600倍显微镜检查。④统计出计算室的四角及中央共5个中方格即80个小方格内的精子数。（计数时按头部压线精子采用计上不计下，计左不计右的原则，以免重复或漏掉。⑤将所统计的精子数（X）代入下列公式即得出每毫升的子数。
X（5个中方格精子数）×5×10×稀释倍数×1000=每毫升精液所含精子数
为了减少误差，必须进行两次精子计数，如果前后两次误差大于10％，则应作第三次检查。最后在3次检查中取两次误差不超过10％的，求其平均数，即为所确定的精子数。
表11-1精液稀释倍数
表11-2精子浓度计算查对表
（4）血细胞计数板用后的洗涤用蒸馏水或自来水冲洗后用气球吹干或自然干燥，最后用抹镜纸包好放回原来的盒子。
2
（1）抹片用玻棒蘸取精液1滴于载玻片的右端，取另一边缘光滑的载玻片（或盖玻片）呈35℃角自精液滴的左面向右接触样品，样品精液即呈条状分布在两个载玻片接触面，将上面的载玻片贴着平置的载玻片表面自右向左移动，带着精液滴均匀地涂抹在载玻片上。制作另一抹片时，须重新换取载玻片，在抹片的右端背面用记号笔标号，每份精液样品须同时制作两个抹片。
（2）干燥抹片于空气中自然干燥。
（3）染色用改良苯酚品红染色液染色10min，蒸馏水轻轻冲洗、候干即可镜检。（4）镜检将制好的抹片置于显微镜下，查数不同视野的500个精子，计算出其中所含的畸形精子数，求出畸形精子百分率。
畸形率=畸形精子数/计算精子总数（畸形+正常）×100%形态和结构不正常的精子称为畸形精子。畸形精子多由于遗传、年龄、精子发生过程中受到破坏、输精管道系统分泌物的病理变化及在精液处理过程中操作不当等原因引起的。牛、羊正常的精液中，畸形精子率一般不超过15%，超出20%以上者不宜用做输精或制作冷冻精液。
1、初级畸形：指睾丸生精功能障碍所致的畸形，主要表现为头部畸形。包括头部异常和顶体缺陷。
2、次级畸形：指由附睾和输出管功能障碍引起的畸形，表现为尾部中段有原生质滴。
3、三级畸形：指精子在体外受不良环境因素影响所致的畸形，表现为其他尾部缺陷。
●导致精子畸形的主要原因
①精子生成过程中不良内外环境的影响。如高温、睾丸早期发育不良等。
②副性腺及输精管道分泌物的病理变化。
③精液处理不良，精子遭受外界不良环境的影响。
④繁殖管理或饲养管理不当。如采精过频、营养不良等。
⑤季节。繁殖季节下降、高温季节上升。
⑥其他。遗传、年龄等因素。
●根据精子形态变化的不同部位，畸形精子一般可分为4类
①头部畸形：头部巨大，瘦小，细长，圆形或双头，缺损皱缩，轮廓不明显等。
②颈部畸形：颈部膨大，纤细，曲折，双颈，带有原生质滴等。
③中段畸形：中段膨大，纤细，弯曲，曲折，双体，不全等。
④主段畸形：主段弯曲，曲折回旋，短小，长大，缺陷，双尾等。
1．精子数量测定时取样要均匀、准确。
2．测定精子畸形率制片时不可将精液滴作“推”抹涂片，以免人为造成畸形精子。3．如所检测的为牛、羊原精液，在做抹片前，精液需用0.9％NaCl经1~2倍稀释，以形成分散的精子分布，便于显微镜下观察。
2．分析所得数值和一般常数值的差异。
实验五不同畜种精液稀释液的优化
头孢拉定0.5g/支=50万微克→1ml
加头孢拉1000微克/ml
50ml稀释液加头孢拉50万微克→0.1ml
1.开阔思路，培养学生进行动物繁殖学试验设计及对实验结果综合分析的能力。
1.精液稀释液配方设计；
2.稀释液配制、精液稀释保存；
1．新鲜牛或猪精液。
2．柠檬酸钠、葡萄糖、鲜鸡蛋（10个）、氨苯磺胺、氯化钠、蒸馏水、青霉素（4支）、链霉素、75%酒精。
3.小精瓶、量筒、漏斗、滤纸、玻棒、载玻片、盖玻片、温度计、天平、烧杯、注射器（1、10、20ml）、三角架、药勺、酒精灯、显微镜、水浴锅、大方盘、纱布、药棉、肥皂、平皿、铝盒。
4.生物显微镜、生化培养箱。
一、常用精液稀释液类型
1.即用稀释液适用于采精后立即授精，一单纯扩大精液容量、增加输精母畜头数为目的。此类稀释液以简单的等渗糖类和奶类为主体。
2.常温保存稀释液适用于精液在常温下做短期保存，以糖类和弱酸盐为主体，具pH偏低的特点。
3.低温保存稀释液适用于精液低温保存，具有含卵黄或奶液为主体的抗冷休克特点。
4.冷冻保存稀释液适于精液超低温冷冻保存，含有甘油或DMSO等抗冻物质。
二、精液保存途径
2.精液稀释是在精液中加入一定量按特定配方配制，适于精子存活并保持受精能力的稀释液。目的是扩大精液容量，提高可配母畜数，降低精子能量消耗，补充适量营养和抑制精液中微生物的活性，延长精子寿命，便于精液保存和运输等。
3.稀释液的基本要求是与精液有相等的渗透压。如生理盐水、葡萄糖等。
三、各种家畜精液常用稀释液及配方
1．猪精液常用稀释液配方及配制方法
①葡萄糖-柠檬酸钠-卵黄液（低温保存）
基础液：柠檬酸钠0.5g葡萄糖5g蒸馏水100ml
稀释液：基础液97ml卵黄3ml
青霉素1000IU／ml链霉素1000微克／ml。
配制方法：先将基础液中的药品称量并溶解于蒸馏水中，过滤后，煮沸消毒，待冷却后加入卵黄及抗生素即可。
②葡萄糖-柠檬酸钠液（常温保存）
稀释液：基础液100ml
配制方法：先将基础液中的药品称量并溶解于蒸馏水中，过滤后，煮沸消毒，待冷却后加入抗生素即可。
③葡萄糖-柠檬酸钠-EDTA钠液（常温保存）
基础液：柠檬酸钠0.3g葡萄糖5gEDTA钠0.1g蒸馏水100ml
配制方法：同上。
④奶-卵稀释液（常温保存）
鲜牛（羊）奶100ml卵黄8ml青霉素20IU
鲜奶需经92~95℃水浴消毒20min，等温度降至40℃，加入卵黄和青霉素，混合均匀。
⑤奶-糖-柠稀释液（常温保存）
鲜牛（羊）奶30ml5%葡萄糖30ml2.9%柠檬酸钠30ml卵黄10ml青霉素20IU
鲜奶消毒方法同上。
2．牛精液常用稀释液配方及配制方法
①柠檬酸钠-卵黄液（低温保存）
基础液：柠檬酸钠2.9g蒸馏水100ml
稀释液：基础液75ml卵黄25ml
②葡萄糖-柠檬酸钠-卵黄液（低温保存）
基础液：柠檬酸钠1.4g葡萄糖3g蒸馏水100ml
稀释液：基础液80ml卵黄20ml
四、精液稀释方法
1．精液的准备猪精液用4-6层消毒纱布过滤，以除去精液中的胶质（牛、羊的不需要过滤），镜检精子的活率。
2．稀释液的准备根据稀释倍数（猪精液一般稀释2-4倍），准确量取精液稀释液。3．等温将精液与稀释液置于30℃下等温（用30℃水浴锅或盛装30℃温水的面盆均可）。4．稀释将同温度的精液稀释液沿精液瓶壁或玻棒缓慢地加入到精液中，轻轻摇匀即可。
5.稀释后精液的活率检查稀释后精液的活力不得低于原精液，否则，应检查操作过程是否恰当。
6.保存对稀释后合格的精液按要求进行保存。
1.定时评定精子活率对保存的精液每隔4~6h，采用无菌操作方法取一滴精液于载玻片上，覆加盖玻片，置于37℃下镜检精子活率，记录结果，如此检查直到无直线运动的精子为止。（每个样本每次检查最少制2个片并取其平均值为实验结果）
1．接触精液的所有物品都必须清洁消毒，操作室的温度应保持在18℃-25℃，同时避免阳光、药水、烟气等对精子产生不良影响。
2．抽取卵黄时，蛋壳破开处应先消毒、擦干；破开位置应偏向大头，蛋黄留在小头一端，并除去