本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种适于农作物品种分子身份鉴别和确权鉴定的检测方法。
背景技术：
国以农为本，农以种为先。育种和种业的快速发展，玉米、水稻、小麦等农作物品种数量急剧增加，给品种鉴别和种子管理都带来挑战。仿冒套、多乱杂、一品多名、张冠李戴等问题突出，这些问题严重制约着现代种业的发展。解决这些问题的根本在于对农作物品种、育种材料等进行有效鉴定、监测和保护。
传统的田间种植鉴定受周期长、成本高、环境影响、不易形成标准数据等局限，已不能满足农作物品种鉴定的需求。迫切需要利用先进的分子技术，给每个品种一个明确、有效、易识别的分子身份证。从dna分子水平上对农作物品种进行鉴定是实施品种鉴定、监测和保护的基础，是保障市场公平竞争的迫切需要。许多发达国家将dna分子鉴定技术应用于大田作物和园艺作物品种鉴定中，国际种子检验协会(ista)、国际植物新品种保护联盟(upov)、国际种子联盟(isf)等国际组织推荐dna鉴定技术为品种指纹构建和品种鉴定的辅助方法。
农作物dna分子鉴定技术发展经历了三个重要的阶段，上世纪90年代的第一代标记技术如rflp(限制性片段长度多态性)和rapd(随机扩增多态性)，本世纪初兴起的第二代标记技术ssr(简单重复序列)，近些年的第三代标记技术snp(单核苷酸多态)、以及indel(插入缺失多态)。其中ssr、snp、indel由于均为共显性遗传、染色体定位清楚、能实现高通量自动化在农作物分子鉴定领域被系统研究或推广应用。
基于ssr分子标记：我国于2007年首先颁布了玉米品种鉴定的行业标准，截止到2015年已经有16个作物颁布了ssr指纹鉴定标准；基于上述标准开展我国主要农作物品种标准dna指纹构建工作，其中玉米、水稻已完成两万多份和五千多份样品ssr指纹构建；并且玉米、水稻等主要农作物ssr分子鉴定标准和指纹数据库被广泛应用于品种审定、登记、品种权保护、市场监测、司法鉴定等。国外农作物品种dna指纹构建主要是在upov框架下开展植物品种权保护样品的建库工作，如法国建立1537份玉米品种ssr指纹,德国建立480份欧洲小麦品种ssr指纹等。
虽然农作物品种分子鉴定具有20多年的研究经验，丰富的研究基础，在品种管理、市场监测、司法鉴定中广泛应用，但是现有鉴定标准或技术均相对独立，只能在一类或几类检测需求中发挥作用，没有一套全面系统的检测方法。
技术实现要素：
为了实现本发明目的，本发明提供的适于农作物品种分子身份鉴别和确权鉴定的检测方法，包括以下步骤：
s1、核心dna分子标记位点组合的获得；
s2、扩展dna分子标记位点组合的获得；
s3、两组dna分子标记位点组合的使用。
步骤s1中，所述核心dna分子标记包括可高效区分不同品种，具备高稳定性、高品种区分能力、兼容多平台、兼顾均匀分布及多实验室验证结果，位点数目为几十至几百个量级，能够区分一种作物90％以上品种材料，可用于已经育成品种(单交种、自交系、dh纯系等)标准指纹构建、品种身份鉴别等的分子标记。
步骤s2中，所述扩展dna分子标记是指在步骤s1的核心dna分子标记位点组合之外可选用的分子标记，能够准确评价品种间遗传相似程度，位点均匀分布、兼容中高密度芯片、兼顾位点多态性，位点数目几千至几万个量级，能够区分一种作物99％以上的品种材料，可用于近似品种、派生品种确权鉴定等的分子标记。
步骤s3中，在进行品种鉴定时，首先使用步骤s1的核心dna分子标记位点组合进行检测，如不能有效区分待测样品和对照样品，则采用步骤s2的扩展dna分子标记位点组合继续进行检测，基于遗传相似度参数判定待测样品和对照样品之间的关系。
农作物品种鉴定核心位点和扩展位点的确定：
dna分子标记类型的选择：共显性，多态性丰富，实验重复性好，数据易于整合共享，位点在基因组上分布情况已知，相应分型技术成熟可靠。基于上述原则，推荐ssr、snp、indel等标记类型作为农作物品种鉴定的dna分子标记类型。
核心位点和扩展位点的确定：(1)扩展位点：从玉米等农作物的优异标记位点池中，结合单倍型块、连锁不平衡等生物信息分析手段，获得遗传均匀分布的非冗余候选位点集合。选取多类型样本(杂交种、自交系/常规种)，利用芯片、测序等高通量平台进行候选位点实验评估，主要从数据获得率、基因型分型效果、三联体特征进行分析。最后，利用统计学方法确定适于育种材料确权的扩展位点集合，形成中高密度鉴定芯片等。数目为几千至几万个。(2)核心位点：基于育成品种身份鉴别的需求，利用高密度芯片、测序等平台，对大样本(以已知品种为主)进行试验评估，筛选基因型分型效果好、多态性高的候选核心位点。结合多实验室、多平台独立验证结果，确定一套兼容多平台、稳定性高、多态性高的位点集合。基于遗传算法分析筛选最优位点组合(能区分90％以上已知品种)，并进行随机样本测试，优化调整位点组合，最终推荐一套高准确性、高稳定性、高品种区分能力、兼容多平台，兼顾均匀分布的核心位点组合。位点数目为几十至几百个。
本发明中农作物品种鉴定核心和扩展位点组合确定的技术路线见图1。
农作物品种鉴定的步骤：
1、鉴定待测样品a是否为对照样品b：首先利用核心位点进行检测，如果核心位点组合差异位点数达到可以判定样品a与样品b不同，可终止检测试验；如果采用核心位点组合不能判定样品a与样品b不同，则继续采用扩展位点组合进行检测试验，采用遗传相似度方式判定样品a与样品b的关系，根据阈值确定两者的关系属于不同品种、质疑派生品种还是派生品种。
2、鉴定未知待测样品c是属于哪个已知品种：首先利用核心位点建立样品c的指纹数据，将c的指纹与已知品种标准指纹数据库进行两两比较，如果样品c与数据库中的已知品种两两比较均可以判定为不同，则该样品可能为具有特异性的新品种；如果样品c与某一个或多个品种不能判定为不同，则将待测样品c与系列近似样品继续利用扩展位点进行检测试验，采用遗传相似度进行分析，确定与样品c遗传背景相似度最高的品种，并确定是质疑派生还是派生品种。
本发明中农作物品种鉴定技术路线见图2。
本发明提供的检测方法可以在以下任一领域中进行应用。(1)农作物品种标准dna指纹数据构建；(2)农作物品种分子身份鉴别；(3)农作物品种确权鉴定等。该方法可在农作物品种审定、登记、保护、市场监测、司法鉴定等领域进行应用，为品种创新和建立公平竞争的市场环境提供技术支撑和保障。
上述核心dna分子标记位点及其组合和/或扩展dna分子标记位点及其组合可制备成芯片，利用所构建的芯片平台进行农作物分子鉴定/检测。
本发明还提供所述核心、扩展位点组合在农作物品种标准dna指纹数据库构建中的应用。
本发明还提供所述核心、扩展位点组合在农作物品种分子身份鉴别或品种确权中的应用。
本发明依据农作物品种身份鉴别和确权鉴定等不同检测目的要求确定核心和扩展位点组合的方法，利用核心和扩展位点进行品种鉴定技术路线。(1)用少量核心位点解决标准指纹库构建和绝大多数品种的鉴别问题，实现稳定可靠、便捷高效，特别是大幅度降低成本等问题；用高密度芯片或多位点数据解决遗传关系较近、相似度高等近似品种鉴别，以及育种材料确权等问题。(2)核心位点组合确定：主要用于育成品种标准指纹构建、品种身份鉴别等，以高效区分不同品种为目标，本发明中提出了其位点筛选原则要求、过程、位点数目范围。(3)扩展位点组合确定：主要用于近似品种、派生品种、育种材料的确权鉴定等，以准确评价品种间遗传相似程度为目标，本发明中提出了其位点筛选原则要求、过程、位点数目范围。(4)用少量核心位点和扩展位点应用：基于农作物品种现状和检测实践经验，提出首先选用核心位点再利用扩展位点进行检测的二步系统检测方法。
本发明至少具有下列优点及有益效果：
鉴于目前农作物品种分子鉴定存在的问题，本发明提供一种适于农作物品种分子身份鉴别和确权鉴定的一种系统检测方法，与现有鉴定方法相比能全方位应用于农作物品种身份鉴别、育种材料确权、近似或派生品种鉴定等需求中，拓展了分子检测的应用范围；核心和扩展位点的灵活应用，在提高效率降低成本的基础上，突破了位点数目的限制，实现了在基因组水平的品种鉴定；本发明为农作物品种分子身份鉴别、育种材料确权、以及种质资源评估提供了新的思路和方法，该方法可在农作物品种审定、登记、保护、市场监测、司法鉴定中进行应用，为品种创新和建立公平竞争的市场环境提供技术支撑和保障。
附图说明
图1为本发明农作物品种鉴定核心和扩展位点评估确定技术路线图。
图2为本发明农作物品种鉴定技术路线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1玉米(二倍体植物)品种鉴定的核心和扩展snp标记位点组合的获得
1、扩展位点组合的确定：
(1)玉米优异snp位点池：选取国内外代表性玉米自交系样品(涵盖了9类种质群，以及热带、甜糯、地方品种等)进行全基因组深度测序(10×)，从高质量重测序数据中挖掘、定位snp位点，基于生物信息方法确定单拷贝、二态的snp位点；结合已公布的芯片中的snp位点或单倍型图谱中snp位点，形成较全面的玉米优异snp位点池(位点数目大于2000万)。
(2)适于玉米品种鉴定的候选位点集合：上述优异snp位点信息提交美国两家芯片生产公司affymetrix、illumina，设计团队基于探针设计和生物化学反应的要求对snp位点进行评估。根据评估反馈信息，删除不符合芯片设计要求的位点，删除评估分值低于0.6的位点，剩余位点基于自交系重测序的数据进一步进行分析评估。评估参数为，maf(minorallelefrequency)值大于等于0.2，杂合率小于0.05，位点两侧或至少一侧60bp序列具有保守性(60bp长度的序列兼顾了affymetrix和illumina两大芯片设计探针长度的要求)。经上述评估之后的位点，按照均匀分布的原则(结合物理位置和单倍型块进行分析)、连锁不平衡分析等方法，获得基因组上均匀分布的非冗余的候选位点集合(位点数目大于200万)。
(3)利用筛选芯片进行评估：上述候选位点集合提交affymetric公司进行评估设计，并形成筛选芯片。选取约200个评估样本，包括不同遗传背景的自交系、三联体(双亲及f1杂交种)、育种材料等，进行试验评估。评估参数为，是否为phr(polyhighresolution)类的位点，数据获得率大于等于95％，maf值大于等于0.2，三联体样本符合孟德尔遗传，三种基因型能自动区分，位点杂合率小于0.05，删除不符合要求位点，获得高效高质量的snp位点。
(4)扩展位点组合确定：上述经筛选芯片评估的位点，根据均匀分布原则进一步优化，提交affymetrix公司进行评估设计，订制一款高密度snp芯片(位点数目约9万个)。基于该订制芯片，扩大样本数量，选取获得玉米品种权保护的自交系和骨干自交系材料进行评估，样本数量约2000个，建立这些自交系的指纹数据。评估参数为，被分类为phr类的位点，数据获得率大于等于97％，maf值大于等于0.2，位点杂合率小于0.05，删除不符合要求位点。利用统计学方法、根据均匀分布的原则进一步优化，获得适于玉米品种鉴定的扩展位点组合(位点数目约5万个)。
2、核心位点组合的确定：
(2)多平台、多实验室独立进行位点验证：上述候选核心位点，在芯片、kasp、taqman等多个平台进行验证，同时提交给其他三家实验室进行独立验证，每轮试验验证样本数量约200个。结合多平台、多实验室验证的反馈结果，对上对候选核心位点进行质量分类，获得一套兼容多平台、稳定性高、多态性高的位点集合(数目为几百个)。
(3)基于遗传算法分析最优位点组合：从约5000个样本的高密度芯片指纹数据中抽取上述几百位点的数据，基于遗传算法进行组合优化分析，筛选出一套高分辨率snp位点，能区分90％以上的样本，并考虑均匀分布原则，确定一套最优的snp位点组合(位点数目100个以内)。
(4)核心位点组合的确定：上述最优位点组合，随机选取1000个玉米样本进行测试，调整最优位点组合，依据玉米已知品种snp指纹数据状况，适当考虑未来品种的发展，综合推荐一套适于玉米身份鉴别的高准确性、高稳定性、高品种区分能力、兼容多平台的核心位点组合(位点数目为几十个)。
实施例2小麦(六倍体)品种鉴定的核心和扩展snp位点组合的获得
(1)小麦优异snp位点池：基于小麦全基因组遗传变异位点的物理图谱信息，全面解析snp位点在亚基因组内与亚基因组间的分布，拷贝数量，同源性及多态性水平，筛选具有鉴别同源染色体能力，且在栽培种内具有高度保守性的特异标记，建立六倍体小麦a亚组、b亚组、d亚组染色体特异snp优异标记位点池。
(2)适于小麦品种鉴定的候选位点集合：上述优异snp位点信息提交美国两家芯片生产公司affymetrix、illumina进行评估。芯片设计评估和基于生物信息评估与实施例1中的玉米对应原则相同。经上述评估之后的位点，基于均匀分布、连锁不平衡分析方法，结合亚组间与亚组内snp标记多态性水平、区段碱基组成与结构特点，获得三个亚组相对均匀分布的候选位点集合。
(3)利用筛选芯片进行评估和扩展位点组合的确定：筛选芯片的评估和扩展位点组合的确定方法与实施例1中玉米对应原则相同。
(2)多平台、多实验室独立进行位点验证：上述候选核心位点，在芯片等多个平台进行验证，同时提交给其他三家实验室进行独立验证，每轮试验验证样本数量约100个。结合反馈结果，获得一套兼容多平台、稳定性高、多态性高的位点集合(数目为几百个)。
(3)基于遗传算法分析最优位点组合：从约1000个样本的高密度芯片指纹数据中抽取上述几百位点的数据，基于遗传算法进行组合优化分析，筛选出一套高分辨率snp位点，能区分90％以上的样本，并考虑均匀分布原则，确定一套最优的snp位点组合(位点数目在100个以内)。
(4)核心位点组合的确定：上述最优位点组合，随机选取200个小麦样本进行测试，调整位点组合方案，推荐一套适于小麦身份鉴别的高准确性、高稳定性、高品种区分能力、兼容多平台的核心位点组合(位点数目为几十个)。
实施例3玉米dna指纹数据库的构建
(1)参照品种：选用玉米杂交种京科968的两个亲本京724和京92作为参照品种，其样本的纯合度利用扩展位点组合进行检测，纯合度达到99.9％以上。
(2)玉米品种dna制备：每个样品混合30个单株的绿叶，液氮研磨，dna提取具体步骤按照玉米dna分子鉴定标准执行(王凤格等，2014)。用紫外分光光度计和琼脂糖电泳分别检测所提取dna的质量，琼脂糖电泳显示dna条带单一，没有降解；紫外分光光度计检测a260/280介于1.8-2.0之间；a260/230大于1.8。稀释dna形成工作液，浓度为20ng/μl。
(3)玉米品种指纹构建平台选择：基于各检测平台样本和位点的通量，结合实际情况选择合适的平台进行指纹构建。本发明中玉米标准样品数目在5000个以上，位点数目为几十个，所以适合选择样本高通量、试验流程简单的kasp平台。
(4)pcr扩增：选用1536孔酶标板、水浴pcr仪进行pcr反应。反应体系为1μl，包括1.5μl总dna(烘干)，0.5μlkasproxstandardreactionmix(kbiosciences,hertsuk)，0.014μl引物混合物，0.5μl去离子水。反应程序为94℃15min；采取降落pcr方式，61℃降落到55℃，循环10次，每个循环降低0.6℃；94℃20sec，58℃1min，循环30次。
(5)指纹数据采集：将扩增产物利用bmgpherastar(lgc，middlesex，uk)仪器进行荧光信号扫描，获得原始数据。原始数据导入kraken软件(lgc，middlesex，uk)进行分析获得每个玉米品种每个位点的指纹数据。指纹数据记录格式为a/b，纯合基因型记录为aa或bb，杂合基因型记录为ab，并同时利用参照品种对a和b进行定义。
实施例4核心和扩展snp位点组合在玉米品种鉴定中的应用
(1)鉴定待测玉米样品(代号为d)是否为已知的对照玉米品种京科968(代号为e)。
dna提取及质量测定：提取待测玉米样品(代号为d)和对照玉米样品京科968(代号为e)的基因组dna，具体方法同实施例3中步骤(2)。
检测试验流程：首先利用核心位点，基于kasp平台进行检测试验。pcr扩增和指纹采集，具体方法同实施例3中步骤(4)和(5)。
数据分析与判定：样品d与样品e的指纹，逐个位点进行比对，差异位点数目达到判定d与e不同，判定待测玉米样品d不是对照玉米品种京科968。
(2)鉴定待测玉米样品(代号为f)是否为已知的对照玉米品种京科968(代号为e)。
dna提取及质量测定：提取待测玉米样品(代号为f)和对照玉米样品京科968(代号为e)的基因组dna，具体方法同实施例3中步骤(2)。
第一次指纹数据分析与比对：样品f与样品e的指纹，逐个位点进行比对，差异位点数目不能判定f与e不同，继续采用扩展位点组合进行检测试验。
扩展位点组合检测试验：基于各检测平台样本和位点通量结合实际情况选择合适的平台进行试验。本发明中玉米扩展位点数目约5万个，试验样本数目为2个，所以选择位点高通量芯片平台。f和e两个样本分别利用150ngdna，两个样本dna与其他试验样本一起被分配到1个96孔格式芯片板上。基于affymetrix公司genetitan芯片技术平台进行snp芯片基因分型试验。操作流程依据affymetrix公司公布的axiom2.0assaymanualworkflow指南进行。
指纹数据采集：经过芯片扫描之后获得原始数据cel格式文件导入到axiomanalysissuite软件，采用bestpractices设置进行自动分析，导出f和e的指纹数据。
第二次指纹数据分析与比对：基于样品f和样品e的指纹数据，采用遗传相似度参数判定待测玉米样品f与对照玉米品种京科968之间的关系，根据阈值确定样品f是与京科968是属于不同品种、质疑派生品种、派生品种关系。
(3)鉴定待测玉米样品(代号为g)是属于已知品种玉米品种中的哪一个。
dna提取及质量测定：提取待测玉米样品(代号为g)的基因组dna，具体方法同实施例3中步骤(2)。
检测试验流程：首先利用核心位点，基于kasp平台建立样品g的指纹数据。pcr扩增和指纹采集，具体方法同实施例3中步骤(4)和(5)。
第一次数据分析与比对：将样品g的指纹与已知品种标准指纹数据进行两两比较分析，如果样品g与数据库中的已知品种两两比较均可以判定为不同，则该样品g可能为具有特异性的新品种。如果样品g与某一个或多个品种无法判定为不同，则将待测样品g与系列近似样品继续利用扩展位点进行检测。
扩展位点组合检测试验：基于affymetrix芯片技术平台进行试验。g和系列近似样本分别利用150ngdna，与其他试验样本一起被分配到1个96孔格式芯片板上。基于affymetrix公司genetitan芯片技术平台进行snp芯片基因分型试验。操作流程依据affymetrix公司公布的axiom2.0assaymanualworkflow指南进行。
指纹数据采集：经过芯片扫描之后获得原始数据cel格式文件导入到axiomanalysissuite软件，采用bestpractices设置进行自动分析，导出g和系列近似样本的指纹数据。
第二次指纹数据分析与比对：基于样品g和系列近似样本的指纹数据，采用遗传相似度参数进行分析，确定与待测样品g遗传背景相似度最高的品种，并根据阈值确定样品g与该品种之间是属于质疑派生品种还是派生品种关系。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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