本发明涉及从棉花中分离的基因的新用途，尤其涉及陆地棉ghpub21基因在调控植物黄萎病抗性中的用途，属于陆地棉ghpub21基因的新用途领域。
背景技术：
技术实现思路
1、本发明的目的之一是从棉花中分离获得与调控黄萎病抗性的基因；
3、本发明的目的之三是将从棉花中分离获得的基因应用于调控植物抗黄萎病或用于培育抗黄萎病植物品种。
4、为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：
6、(a)seqidno.1所示的多核苷酸序列；(b)与seqidno.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸；(c)与seqidno.1所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；(d)在seqidno.1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的突变体，且该突变体仍具有调控黄萎病抗性的功能或活性。
7、另外，本领域技术人员可以将seqidno.1所示的核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率；例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。
8、将本发明的seqidno.1所示的基因与其他基因相嵌合或连接得到的嵌合基因或表达盒均属于本发明的保护范畴；含有所述的嵌合基因或表达盒的重组表达载体同样也属于本发明的保护范围之内。
9、本发明还公开了含有所述ghpub21基因的重组表达载体；优选的，所述重组表达载体可以为重组原核表达载体或重组真核表达载体。
10、本发明进一步公开了含有所述ghpub21基因的重组宿主细胞或重组菌；其中，所述重组菌包括但不限于重组大肠杆菌或重组真核细胞；所述的重组真核细胞包括但不限于重组真菌或重组植物细胞。
11、本领域人员可以通过常规的基因编辑技术或基因敲除载体的构建方法构建ghpub21基因的编辑载体，或者按照本领域的常规方法构建含有基ghpub21基因的重组植物表达载体，这些方法均为本领域技术人员所熟练掌握。譬如，将所述ghpub21基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体包含启动子，ghpub21基因的cds序列和终止子；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子，终止子序列可取自根癌农杆菌的ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草剂抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。
12、本发明的另一方面是提供了ghpub21基因在调控植物黄萎病抗性中的应用，包括：通过调控ghpub21基因在植物中的转录和翻译水平实现调控植物对于黄萎病抗性；相应的，通过改变ghpub21基因在植物的转录和翻译水平来实现黄萎病抗性调控或通过改变ghpub21基因在植物中的转录和翻译水平来调控黄萎病抗性都应属于本发明的保护范围。
13、关于如何提高或者降低ghpub21基因在棉花或植物中的表达水平，均是本领域技术人员可以通过各种常规的技术手段来实现；譬如，通过构建ghpub21基因的过表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化法转化植物，获得ghpub21基因的过表达株系，提高植物对于黄萎病抗性；或者通过crispr、vigs方法敲除或者干涉棉花体内的ghpub21基因，使棉花中的ghpub21基因产生缺失或突变或降低ghpub21基因的表达量，降低棉花对于黄萎病抗性。
14、作为本发明的一种优选的具体实施方案，本发明提供了一种提高植物对于黄萎病抗性的方法，包括：构建ghpub21基因过表达载体；将所述ghpub21基因在植物中进行过表达，所得到的转基因植物的对于黄萎病抗性提高。
15、作为本发明的另一种优选的具体实施方案，本发明提供了一种培育抗黄萎病植物品种的方法，包括：构建ghpub21基因过表达载体；将ghpub21基因在植物中进行过表达；从获得的转基因阳性植株中，筛选得到对于黄萎病抗性提高提高的转基因植物新品种。
16、在本发明中，可以采用任何植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体转化到目标植物的组织、细胞中得到转化体，再由转化体通过植物组织培养的方法再生得到完整的植物及其无性系或其后代，所述的转化方法包括农杆菌介导的遗传转化、原生质体转化、植物病毒载体、显微注射法、电击法等。
17、本发明中所述的目标植物包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。最优选的，所述的目标植物优选是棉花或拟南芥。
18、本发明利用亚细胞定位和病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing，vigs)技术、转基因超表达拟南芥技术对棉花ghpub21基因在棉花抗黄萎病中的功能进行初步研究，结果发现，将棉花中ghpub21基因沉默后，显著降低了棉苗植株抗黄萎病能力；将ghpub21基因在拟南芥中超表达后能够显著提高拟南芥抗黄萎病能力，由此确定ghpub21基因能够正向调控植物对于大丽轮枝菌所导致黄萎病的抗性。
19、本发明所涉及到的术语定义
20、除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
21、术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna(肽核酸)、在反义技术中所用的dna类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。
22、术语“同源性”指多核苷酸序列之间在百分比核苷酸位置同一性(即序列相似性或同一性)方面的相似性或百分同一性的水平。此处所用的术语同源性也指不同多核苷酸分子之间相似的功能特性的概念，例如具有相似功能的启动子可能具有同源的顺式元件。当多核苷酸分子在特定条件下特异性地杂交以形成双链体分子时，它们是同源的。在这些条件下(称为严谨杂交条件)一个多核苷酸分子可以用作鉴定共有同源性的另一个多核苷酸分子的探针或引物。
24、本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。
25、术语“启动子”指多核苷酸分子，所述多核苷酸分子在其天然状态位于可读框(或蛋白质编码区)的翻译起始密码子上游或5’，并参与rna聚合酶ii及其它蛋白质(反式作用转录因子)的识别和结合以启动转录。
26、术语“可操作地连接”指第一个多核苷酸分子(例如启动子)与第二个可转录的多核苷酸分子(例如目的基因)连接，其中多核苷酸分子如此排列，从而第一个多核苷酸分子影响第二个多核苷酸分子的功能。优选的，两个多核苷酸分子是单个连续多核苷酸分子的部分，且更优选是临近的。例如，如果启动子在细胞内调节或介导目的基因的转录，则该启动子与目的基因可操作地连接。
27、术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的dna载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：t-dna转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性dna序列等。
28、术语“转化”：将异源性dna序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
29、术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。
30、术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。