酵母双杂交是研究植物蛋白间互作非常有用的系统(Stasietal.,2015),是筛选和发现新互作蛋白的一项首选技术。然而,由于酵母本身是异源系统,故存在体内无法正常重建蛋白互作原始环境的缺陷。例如,酵母双杂交技术需要2个蛋白同时定位于细胞核,而植物中原始蛋白存在于不同的细胞结构中,会导致出现假阳性结果。因此,酵母双杂交系统获得的候选蛋白必须通过一些其它方法,尤其需要在相似的生物体中进行验证。
Pull-down与Co-IP的原理类似,均是利用亲和配体捕获互作蛋白。不同之处在于Pull-down利用1个纯化且含有标签的蛋白作为诱饵来结合互作蛋白,通常用来证明蛋白之间直接的相互作用;Co-IP则采用固定的抗体捕获互作蛋白,用来证明2个蛋白之间的相互作用,但是不排除通过第3个蛋白介导的间接互作。下面我们将详细介绍GST标签融合蛋白的Pull-down和烟草瞬时表达系统中Co-IP两种技术的实验流程,以期为验证植物中蛋白的相互作用提供参考。
1实验材料
Pull-down:表达质粒及携带各种表达质粒的BL21大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株。
Co-IP:生长约4周的本氏烟草(NicotianabenthamianaD.)幼苗(16小时光照/8小时黑暗,温度为(22±2)°C),表达质粒以及携带各种表达质粒的GV-3101或者EHA105农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株。
2试剂
Pull-down:异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)和GlutathioneSepharoseTM4B(GE-Healthcare17075601)；
Co-IP:商业化琼脂糖凝胶交联的标签抗体珠子(agarose-conjugatedanti-TAGbeads,MBIFermentas)、抗生素和LB(Luria-Bertani)液体培养基,苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂(Cocktail)为Pull-down与Co-IP共用。
3试剂配方
Pull-down(表1)和Co-IP(表2)所用的试剂配方如下。
4仪器设备超声波细胞粉碎机(JY92-IIN,宁波新芝生物科技股份有限公司)为Pull-down技术专用;控温摇床、微量分光光度计(Nano-300)、微量离心机、台式离心机、水浴锅、静音混合器(WH-986,海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、免疫印迹设备和其它基础实验室设备等为Pull-down与Co-IP共用。5实验程序5.1Pull-down的实验方案Pull-down实验的具体操作流程见图1。
5.1.1GST融合蛋白的原核诱导表达
(1)将表达GST融合蛋白(实验组)和GST(对照组)的质粒分别转入BL21菌株中;
(2)分别挑取阳性单克隆于3mL含有抗生素的LB液体培养基中,37°C,200rpm,过夜培养;
(3)将过夜培养的3mL菌液接入300mL(1:100)含有抗生素的LB液体培养基中,37°C,200rpm摇菌2.5-3小时,至OD600=0.8左右;
(4)取0.5mL菌液于4°C保存(作为诱导前菌液);
(5)同时在剩余菌液中加入终浓度为1mmol·L-1的IPTG,16-27°C,100-200rpm,诱导8-16小时;
(6)诱导后取0.5mL菌液于4°C保存(作为诱导后菌液);
(7)4°C,4500×g离心15分钟,收集诱导后菌体,用20mLPBS溶液重悬菌体后,转移至50mL离心管中;
(8)4°C,4500×g离心10分钟,弃上清,液氮速冻,-80°C保存(用于纯化);
(9)4°C,10000×g离心2分钟,收集诱导前菌液和诱导后菌液,用80μL1×SDS上样缓冲液重悬菌体;
(10)100°C,煮沸样品5分钟,15000×g离心2分钟,取上清对诱导结果进行SDS-PAGE检测。
5.1.250%GSTSepharose4Bslurry的准备
(11)将原75%GlutathioneSepharose4Bslurry弹至均匀;
(12)每管取677μL原液,1000×g离心5分钟,弃上清;
(13)加入500μLPBS,颠倒混匀,1000×g离心5分钟,弃上清,反复5次;
(14)加入500μLPBS,颠倒混匀,配成50%GlutathioneSepharose4B,备用。
5.1.3GST融合蛋白的纯化
(15)从-80°C冰箱中取出冻存的样品,冰浴溶解菌体后,加入4mLPBS、40μLPMSF(100mmol·L-1)和40μL蛋白酶抑制剂Cocktail(100×)进行充分重悬;
(16)超声破碎,频率:100-200J·S-1;超声40秒,停止20秒,共5次(菌体由浑浊变为澄清);
(17)4°C,15000×g离心40分钟;
(18)冰上转移细胞裂解液上清至洁净的10mL离心管中;
(19)在细胞裂解液上清中加入50μL50%GlutathioneSepharose4B,4°C,静音混合器上温和旋转孵育30-60分钟;
(20)1500×g离心5分钟,弃上清,此时Sepharose上即结合了GST融合蛋白或GST;
(21)在管中加入预冷的500μLPBS(沿壁加入,动作轻柔,以免打断珠子与蛋白的连接),轻晃悬浮珠子,将Sepharose洗涤1次,1500×g离心3分钟,弃上清;
(22)用PBS洗涤3次,最后用小枪头吸净珠子表面的水膜,即获得结合有GST融合蛋白或GST的Sepharose,用大口径的移液枪头转移Sepharose至1.5mL尖底离心管中;
(23)如用于检测,在Sepharose中加入15-20μL1×SDS蛋白上样缓冲液,沸水煮3分钟,15000×g离心1分钟,取上清做SDS-PAGE电泳;
(24)如用于Pull-down检测,继续后续操作。
5.1.4GST体外蛋白质结合分析(GSTPull-down)
(25)将结合有GST融合蛋白的GlutathioneSepharose4B悬浮在500μLNETN缓冲液中,加入20-30μL含有其它蛋白(如细胞裂解物或纯化的蛋白)的溶液,同时采用结合有GST的GlutathioneSepharose4B平行操作作为对照;
(26)4°C条件下,在静音混合器上温和孵育5-8小时;
(27)1200×g离心2分钟,吸去上清,注意勿扰动底层的Sepharose;
(28)加入200μLNETN缓冲液对Sepharose进行洗涤,注意贴壁加入,不可直接冲击Sepharose,随后轻柔晃动,使Sepharose重悬即可;
(29)1000×g离心2分钟,吸去上清,注意勿扰动底层的Sepharose;
(30)重复洗涤2-3次;
(31)吸干Sepharose上方的水层后,加入20-30μL1×SDS蛋白电泳上样缓冲液,沸水浴4分钟,-20°C冻存;
(32)做SDS-PAGE和westernblotting检测;
(33)用两种标签的抗体做westernblotting检测,一种检测Pull-down的蛋白,另一种检测互作蛋白。
5.2Co-IP的实验方案(图2)
图2利用烟草瞬时转化体系检测融合Myc的诱饵蛋白与融合Flag的捕获蛋白互作的Co-IP实验流程图
5.2.1烟草的准备
转化前1天将4周苗龄的烟草小苗转移至黑暗中培养,转化当天浇足水分,恢复光照,烟草的状态是决定瞬时表达成功与否的关键。
5.2.2烟草叶片的瞬时表达
第1天
(1)小摇分别将含有不同标签诱饵蛋白和捕获蛋白质粒的农杆菌及P19农杆菌(P19质粒为卡那抗性,转入EHA105农杆菌菌株中,P19有助于目的蛋白的高水平表达和状态维持)接种到3-5mL含有适宜抗生素的LB培养基中,28°C,200rpm,过夜培养;
第2天
(2)大摇将过夜培养的菌液分别转接至10-20mL新的含有适宜抗生素、10mmol·L-1MES和40μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)的LB培养基中,28°C,200rpm,过夜培养至OD600=3;
第3天
(3)收集菌液将农杆菌菌液于3200×g离心10分钟(采用台式离心机),弃上清;
(4)重悬菌液将离心后的菌体分别用10mmol·L-1氯化镁重悬至OD600=1;
(5)静置菌液加入AS至终浓度为200μmol·L-1,室温静置至少3小时;
(6)准备注射液将携带诱饵蛋白和捕获蛋白构建的重悬液等体积混合,以携带诱饵蛋白或捕获蛋白与空载体的组合作为对照,同时每个组合加入等体积的P19重悬液;
(7)注射烟草使用1mL去掉针头的注射器将注射液注入平展的烟草叶片,每株最好注射2枚叶片,做好标记,勿重复使用注射器;
第4-6天
(8)分别于转化后的1、2和3天收取标记过的叶片,-80°C冻存。
5.2.3蛋白粗提液的准备
(9)从-80°C冰箱中取出冷冻烟草叶片,放入液氮,称取约2g冷冻叶片,迅速放回液氮中;
(10)在液氮预冷过的研钵中将烟草叶片研成粉末;
(11)转移粉末至10mL离心管中,用1.5-2mL的裂解提取液NB1重悬,并用振荡器充分混匀;
(12)放置冰上反应30分钟,预冷台式离心机;
(13)4°C条件下,15000×g离心1小时;
(14)冰上取上清,用双层神奇滤布(Miracloth)过滤上清,注意勿起泡沫;
(15)测量每个蛋白粗提液的浓度。
5.2.4IP(以下操作均在4°C条件下进行)
(16)准备IP的样品,在10mL的圆底离心管中补充裂解提取液NB1,使每个蛋白的粗提液体积和蛋白浓度一致;
(17)用大口径移液枪头分别吸取20μL的琼脂糖凝胶交联的标签抗体珠子(agarose-conjugatedanti-TAGbeads)加入各蛋白粗提液中;
(19)孵育后,用台式离心机1000×g离心5分钟,弃上清;
(20)用1mL裂解提取液NB1重悬珠子,并用大口径的移液枪头转移至1.5mL尖底离心管中;
(21)静音混合器上温和旋转孵育5分钟;
(22)1000×g离心5分钟,弃上清;
(23)用1mL裂解提取液NB1清洗珠子,并旋转孵育5分钟;
(24)1000×g离心5分钟,弃上清;
(25)重复(23)和(24)步骤至少3次;
(26)加入适量1×SDS蛋白上样缓冲液到珠子中,100°C煮沸5分钟,5000×g离心1分钟,准备westernblotting检测;
(27)用2种标签的抗体做westernblotting检测,一种检测免疫沉淀蛋白,另一种检测Co-IP的蛋白。