通过诱导对TROP?2表达细胞的免疫应答的疾病疗法的制作方法

本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2014年2月21日提交的临时美国专利申请号61/942,752和2014年9月12日提交的临时美国专利申请号62/049,826的权益。每个优先权申请都以引用的方式整体并入本文。

序列表

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领域

本发明涉及能够针对Trop-2表达细胞诸如Trop-2+癌细胞诱导免疫应答的靶向Trop-2和CD3的双特异性抗体的组合物及其使用方法。优选地，将双特异性抗体与一种或多种其他治疗剂组合施用，所述其他治疗剂诸如抗体-药物缀合物、干扰素诸如诸如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ或检查点抑制剂抗体。更优选地，双特异性抗体是与干扰素-α组合施用的抗-Trop-2x抗-CD3抗体。最优选地，抗-Trop-2抗体是hRS7抗体。组合物和方法是用于治疗Trop-2+肿瘤，诸如食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌和直肠癌、膀胱癌、乳房癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌和前列腺癌，更优选地胰腺癌或胃癌。在优选实施方案中，双特异性抗体制备为DOCK-AND-LOCKTM复合物，其中使用来自人蛋白激酶A(PKA)调控亚单位的二聚化和对接结构域(DDD)部分与来自AKAP(A-激酶锚定蛋白质)的锚定结构域(AD)部分之间的结合相互作用来将组分连接在一起。然而，制造双特异性抗体复合物的其他方法是已知的并且可使用。双特异性抗体将效应子T细胞、单核细胞、NK细胞或嗜中性粒细胞重定向至患病靶细胞或组织并且诱导针对靶的免疫应答。

背景

产生双特异性抗体的许多方法是已知的(参见，例如美国专利号7,405,320)。双特异性抗体可通过四价体瘤方法产生，所述方法包括使两种不同杂交瘤融合，每种杂交瘤产生识别不同的抗原位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello,Nature1983；305:537-540)。融合的杂交瘤能够合成两个不同重链和两个不同轻链，其可随机缔合以得到具有10个不同抗体结构的异源群体，其中只有一种(占总抗体分子的1/8)具有双特异性，并且因此必须进一步从其他形式中纯化。融合杂交瘤的细胞基因稳定性通常弱于亲本杂交瘤，使得生产细胞系的产生更成问题。

产生双特异性抗体的另一种方法使用异双官能交联剂来化学系拴两个不同单克隆抗体，以使得所得混合缀合物结合至两个不同靶标(Staerz等人Nature1985；314:628-631；Perez等人Nature1985；316:354-356)。通过此方法产生的双特异性抗体基本上是两个IgG分子的异源偶联物，其缓慢扩散至组织中并且从循环中快速移除。双特异性抗体也可通过将两个亲本单克隆抗体中的每一个还原成相应的半分子，然后混合并允许再氧化以获得杂合结构来产生(Staerz和Bevan.ProcNatlAcadSciUSA1986；83:1453-1457)。替代方案包括使用适当连接子使两种或三种经过单独纯化的Fab'片段化学交联。所有这些化学方法由于较高制造成本、繁重的生产过程、大量的纯化步骤、产量低(<20％)和不均匀的产物而对于商业开发是不合需要的。

靶向CD3和CD19的若干双特异性抗体正在临床开发中。被称为的基于scFv的双特异性抗体构建体(双特异性T-细胞衔接子)使用含有2个抗原结合特异性的单个多肽，每个抗原结合特异性由经由挠性连接子以串联方式连接的同源VH和VL贡献(参见，例如，Nagorsen等人，2009,Leukemia&Lymphoma50:886-91；Amann等人，2009,JImmunother32:453-64；Baeuerle和Reinhardt,2009,CancerRes69:4941-44)。被称为的另一种双特异性抗体(双亲和力再靶向)利用二硫化物稳定的双功能抗体设计(参见，例如，Moore等人，2011,Blood117:4542-51；Veri等人，2010,ArthritisRheum62:1933-43)。和由于其尺寸较小(约55kDa)而展现快速血液清除率，从而需要频繁施用以保持双特异性抗体的治疗水平。

干扰素在抗肿瘤和抗微生物宿主防御中起重要作用，并且作为癌症和传染病的治疗剂已经得到广泛研究(Billiau等人，2006,CytokineGrowthFactorRev17:381-409；Pestka等人，2004,ImmunolRev202:8-32)。尽管用I和II型干扰素(IFN-α/β和γ)进行了大量研究，其在临床环境中的使用由于在患者体内的短循环半衰期、全身毒性和次优响应而受到限制(Pestka等人，2004,ImmunolRev202:8-32；Miller等人，2009,AnnNYAcadSci1182:69-79)。在2003年初IFN-λ家族的发现带来了开发这些未满足的临床适应症的替代IFN剂的令人兴奋的新机会(Kotenko等人，2003,NatImmunol4:69-77；Sheppard等人，2003,NatImmunol4:63-8)。

需要可产生具有更长T1/2、较好药代动力学性质、增加的体内稳定性和/或改善的体内功效的改进的双特异性抗体复合物的方法和组合物。存在对组合疗法的进一步的需要以改善涉及针对各种疾病诸如Trop-2+癌诱导免疫应答的治疗的功效。

发明概要

本发明涉及使用双特异性抗体治疗有关Trop-2+细胞诸如Trop-2+癌细胞的疾病。Trop-2在多种类型实体肿瘤中过表达，诸如食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠和直肠癌、膀胱癌、乳房癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、肾癌和前列腺癌。优选地，使用双特异性抗体治疗胃癌或胰腺癌。施用双特异性抗体诱导为Trop-2+的细胞的免疫应答。虽然Trop-2也在一些正常组织中过表达(例如，Stepan等人，2011,JHistochemCytochem59:701-10)，但以下实例展示可在动物模型系统和人受试对象两者中，以仅可耐受的毒性体内施用抗-Trop-2抗体。在其他优选实施方案中，将双特异性抗体施用到受试对象诱导针对Trop-2+癌细胞的免疫应答，而将细胞因子产生增加至能够诱导细胞因子释放综合征(CRS)的水平。在另选的优选实施方案中，双特异性抗体诱导Trop-2+癌细胞与T细胞之间细胞表面抗原的胞啃(trogocytosis)。

在优选实施方案中，双特异性抗体含有用于Trop-2和用于CD3的结合位点。然而，除CD3之外，可靶向其他T细胞或白细胞抗原。示例性T-细胞抗原选自由以下组成的组：CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69以及CD90。在NK细胞上表达的示例性抗原选自由以下组成的组：CD8、CD16、CD56、CD57、ADAM17、KIR以及CD137。示例性单核细胞抗原选自由以下组成的组：CD74、HLA-DRα链、CD14、CD16、CD64以及CD89。示例性嗜中性粒细胞抗原选自由以下组成的组：CEACAM6、CEACAM8、CD16b、CD32a、CD89、CD177、CD11a、CD11b以及SLC44A2。优选地，T-细胞抗原是CD3或NK细胞抗原是CD16。

可用的示例性抗-TAA抗体包括但不限于hA19(抗-CD19，美国专利号7,109,304)、hRl(抗-IGF-1R，美国专利申请序列号12/722,645，提交于10/3/12)、hPAM4(抗-MUC5ac，美国专利号7,282,567)、hA20(抗-CD20，美国专利号7,251,164)、hIMMU31(抗-AFP，美国专利号7,300,655)、hLL1(抗-CD74，美国专利号7,312,318)、hLL2(抗-CD22，美国专利号7,074,403)、hMu-9(抗-CSAp，美国专利号7,387,773)、hL243(抗-HLA-DR，美国专利号7,612,180)、hMN-14(抗-CEACAM5，美国专利号6,676,924)、hMN-15(抗-CEACAM6，美国专利号7,541,440)、hRS7(抗-EGP-1，美国专利号7,238,785)、hMN-3(抗-CEACAM6，美国专利号7,541,440)、Ab124和Ab125(抗-CXCR4，美国专利号7,138,496)，每个引用的专利或申请的实施例段落以引用的方式并入本文。

优选地，双特异性抗体与一种或多种其他治疗剂组合施用，诸如抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、化疗剂、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光活性剂、染料以及放射性同位素。更优选地，另外的治疗剂是抗体-药物缀合物，干扰素诸如诸如干扰素α、干扰素β或干扰素λ或拮抗性检查点抑制剂抗体。最优选地，治疗剂是干扰素-α。

优选实施方案涉及产生为三价DNLTM复合物的白细胞重定向的双特异性抗体，其具有更长T1/2、更好药代动力学性质和增加的体内稳定性。产生并使用DNLTM复合物的方法是熟知的，该复合物包括结合至来自AKAP的AD部分的来自人PKA调控亚单位RIα、RIβ、RIIα或RIIβ的DDD部分的二聚体(参见，例如，美国专利号7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787；7,666,400；7,906,118；7,901,680；8,003,111和8,034,352，其中每一个的实施例部分以引用方式并入本文。)通过将不同效应子部分如抗体或抗体片段连接至DDD和AD部分，可构建并使用实际上包括效应子的任何组合的DNLTM复合物。

有用的抗体可为各种同种型，优选地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，更优选地包括人IgG1铰链和恒定区序列。抗体或其片段可为嵌合人-小鼠、人源化(人框架和鼠高变(CDR)区域)或完全人，以及其变化，如半IgG4抗体(被称为“单抗体”)，如由vanderNeutKolfschoten等人(Science2007；317:1554-1557)所述。更优选地，抗体或其片段可设计或选择以包括属于特定同种异型的人恒定区序列，从而可在施用至人受试者时导致减小的免疫原性。施用的优选同种异型包括非G1m1同种异型(nG1m1)，诸如G1m3、G1m3,1、G1m3,2或G1m3,1,2。更优选地，同种异型选自nG1m1、G1m3、nG1m1,2和Km3同种异型。

可以组合使用的另一种药剂是干扰素。可用的干扰素在本领域中是已知的并且可包括干扰素-α,干扰素-β、干扰素-λ1、干扰素-λ2或干扰素-λ3。优选地，干扰素是干扰素-α。目标干扰素可作为游离干扰素、PEG化干扰素、干扰素融合蛋白质或缀合至抗体的干扰素来施用。

附图简述

以下附图形成本说明书的一部分并包括在内以进一步展现本发明的某些实施方案。实施方案可通过参考这些附图中的一个或多个以及在本文中呈现的具体实施方案的详细说明来更好理解。

图1.包含抗-CD19F(ab)2x抗-CD3scFv的DOCK-AND-LOCKTM复合物的形成的示意图。

图2A.由(19)-3s介导的Daudi伯基特淋巴瘤与T细胞之间的免疫突触形成。新鲜分离的T细胞以2.5:1的E:T比率与Daudi细胞组合。细胞在室温下用0μg/mL、1μg/mL或5μg/mL的(19)-3s处理30分钟，然后通过流式细胞术分析。抗-CD20-FITC和抗-CD7-APC分别用于识别Daudi和T细胞。共结合指示为CD20+/CD7+事件的％。用(19)-3s处理之后，45.5％流动事件是CD20/CD7双重阳性的，指示Daudi与T细胞联会。

图2B.条件如图2(A)中，但不存在(19)-3s抗体。与图2(A)相比，在无抗体的情况下，仅2％的流动事件是无抗体的CD20/CD7双阳性的。

图2C.加入(19)-3s导致>90％的Daudi与T细胞缔合。

图3A.将Jurkat(T细胞)和Daudi(B细胞)以1:1比率组合，用0.1μg/mL(19)-3s处理30分钟并且用抗-CD20-FITC染色，然后通过荧光显微术分析。

图3B.将Jurkat(T细胞)和Daudi(B细胞)以1:1比率组合，用0.1μg/mL(19)-3s处理30分钟并且用抗-CD20-FITC和抗-CD3-PE染色，然后通过荧光显微术分析。

图3C.图3A和3B的合并图像揭示绿色染色Daudi与红色染色Jurkat细胞之间的突触形成。

图3D.在不存在(19)-3s的情况下，突触形成不明显。

图4.对(19)-3s介导的Daudi和Jurkat细胞的细胞与细胞缔合随(19)-3s浓度增加而变化的剂量反应分析。

图5A.由和DARTTM介导的细胞与细胞缔合的比较。和DARTTM的数据从Moore等人(2011,Blood117:4542-4551获得。

图5B.由(19)-3s介导的细胞与细胞缔合的比较。

图6A.由(19)-3s对照bsAb介导的T细胞和Capan-1胰腺癌细胞之间的突触形成。CFSE标记的Capan-1细胞在bsAb存在下与PKH26标记的Jurkat共孵育。

图6B.由(M1)-3sMUC5ACbsAb介导的T细胞和Capan-1胰腺癌细胞之间的突触形成。CFSE标记的Capan-1细胞在bsAb存在下与PKH26标记的Jurkat共孵育。

图6C.由(E1)-3sTROP-2靶向bsAb介导的T细胞和Capan-1胰腺癌细胞之间的突触形成。CFSE标记的Capan-1细胞在bsAb存在下与PKH26标记的Jurkat共孵育。

图7A.由(19)-3s活化的T-细胞。CD69表达的上调是T-细胞活化中的较早事件。与PBMC组合的Daudi细胞，用所指示抗体处理过夜，并且用抗-CD3-PE和抗-CD69-APC染色，然后通过流式细胞术分析。在通过前向相比于侧向散射对T细胞进行门控以及抗-CD3染色之后，评估CD69表达。Daudi细胞与相等数目PBMC的组合产生1.6％CD69+T细胞。添加3ng/mL(19)-3s诱导27％CD69+T细胞。包含与非靶向F(ab)2融合的Okt3-scFv-AD2模块的对照构建体[(M1)-3s]和hA19-Fab-DDD2模块都不诱导T-细胞活化。

图7B.由(19)-3s活化的T-细胞。与纯化T细胞组合的Daudi细胞，用所指示抗体处理过夜，并且用抗-CD3-PE和抗-CD69-APC染色，然后通过流式细胞术分析。在通过前向相比于侧向散射对T细胞进行门控以及抗-CD3染色之后，评估CD69表达。与未经处理的细胞混合物相比，用(M1)-3s或hA19-Fab-DDD2处理Daudi和纯化的T细胞未增加CD69+T细胞的数目(<4％)。交替地，(19)-3s诱导稳健的T-细胞活化，产生80％CD69+细胞。

图7C.由(19)-3s活化的T-细胞。将仅纯化的T细胞，用所指示抗体处理过夜，并且用抗-CD3-PE和抗-CD69-APC染色，然后通过流式细胞术分析。在通过前向相比于侧向散射对T细胞进行门控以及抗-CD3染色之后，评估CD69表达。在不添加Daudi(靶)细胞的情况下，(19)-3s未诱导CD69表达和T-细胞活化。这些结果证明(19)-3s-介导的T细胞与靶细胞之间的突触形成对于T-细胞活化是需要和足够的。

图8A.通过(19)-3s诱导T-细胞增殖。与IL-2/PHA阳性对照和(14)-3s(非靶结合对照)相比，PBMC与3nM或30pM(19)-3s一起孵育。

图8B.通过(19)-3s诱导T-细胞增殖。在耗竭B细胞的PBMC中未观察到T细胞增殖，指示靶细胞(B细胞)为T-细胞活化和增殖所需要。

图9A.(19)-3sT-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。对于(19)-3sDNLTMbsAb复合物来确定Nalm-6、Raji、Ramos和Namalwa癌细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。

图9B.(19)-3sT-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。对于(14)-3s(非靶向)DNLTMbsAb复合物来确定Nalm-6、Raji、Ramos和Namalwa癌细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。

图9C.使用从两个不同供体和Nalm-6癌细胞获得的PBMC或T细胞观察到一致结果。

图10A.(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。确定由(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT-细胞重定向bsAb诱导的Namalwa细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。

图10B.(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。确定由(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT-细胞重定向bsAb诱导的Jeko细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。

图10C.(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。确定由(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT-细胞重定向bsAb诱导的Daudi细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。

图11A.实体肿瘤细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。与非靶向(19)-3sbsAb相比，确定(14)-3sbsAb的LS174T结肠腺癌细胞系的细胞毒性的剂量响应曲线。

图11B.实体肿瘤细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。与非靶向(19)-3sbsAb相比，确定(E1)-3sbsAb的Capan-1胰腺腺癌细胞系的细胞毒性的剂量响应曲线。

图11C.实体肿瘤细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。与非靶向(19)-3sbsAb相比，确定(E1)-3s和(15)-3sbsAb的NCI-N87胃癌细胞系的细胞毒性的剂量响应曲线。

图12.癌细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性数据的概述。

图13A.使用(19)-3sbsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1x106个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5x106个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。以未经处理的细胞作为对照。

图13B.使用(19)-3sbsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1x106个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5x106个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。用130μg单次剂量处理细胞。

图13C.使用(19)-3sbsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1x106个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5x106个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。用每剂量43μg将细胞处理3次。

图13D.使用(19)-3sbsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1x106个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5x106个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。用每剂量26μg将细胞处理5次。

图14A.重复给药对于使用(19)-3sbsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。NOD/SCID小鼠异种移植物如图13的图例中指示来制备。如箭头所指示来施用(19)-3s。图14A显示未经处理的对照。

图14B.重复给药对于使用(19)-3sbsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量130μg(19)-3s静脉内施用将细胞处理2次。

图14C.重复给药对于使用(19)-3sbsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量130μg(19)-3s皮下施用将细胞处理2次。

图14D.重复给药对于使用(19)-3sbsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量65μg(19)-3s静脉内施用将细胞处理4次。

图14E.重复给药对于使用(19)-3sbsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量43μg的(19)-3s，静脉内施用将细胞处理6次。

图14F.重复给药对于使用(19)-3sbsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量43μg的对照(M1)-3s，静脉内施用将细胞处理6次。

图15A.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功效。NOD/SCID小鼠异种移植物用LS174T结肠腺癌来制备。只向小鼠施用T细胞而没有bsAb。

图15B.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功效。NOD/SCID小鼠异种移植物用LS174T结肠腺癌来制备。如指示，小鼠用(E1)-3sbsAb治疗。

图15C.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功效。用Capan-1胰腺癌制备NOD/SCID小鼠异种移植物。只向小鼠施用PBMC而没有bsAb。

图15D.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功效。用Capan-1胰腺癌制备NOD/SCID小鼠异种移植物。如指示，小鼠用(14)-3sbsAb治疗。

图16A.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3sDNLTM复合物的肿瘤生长的体内抑制。在添加或不添加干扰素-α的情况下，小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物NOD/SCID用抗-TROP-2x抗-CD3bsAb治疗。干扰素-α以TROP-2靶向DNLTM复合物形式添加。

图16B.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3sDNLTM复合物的肿瘤生长的体内抑制。在添加或不添加干扰素-α的情况下，小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物NOD/SCID用抗-TROP-2x抗-CD3bsAb治疗。干扰素-α以可购得(聚乙二醇干扰素α-2a)形式来添加。

图17.在存在或不存在干扰素-α的情况下，用(E1)-3s治疗的NOD/SCID小鼠的存活曲线。对照未被治疗或用单独干扰素-α治疗。

图18.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3sDNLTM复合物的肿瘤生长的体内抑制，与TF12对照进行比较。在添加或不添加干扰素-α(以形式加入)的情况下，NOD/SCID小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物用抗-TROP-2x抗-CD3bsAb治疗，与未经处理的对照、TF12对照或单独相比较。

图19.在存在或不存在干扰素-α的情况下，用(E1)-3s治疗的NOD/SCID小鼠的存活曲线对照未经处理或经单独或单独TF12处理。

图20.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3sDNLTM复合物的肿瘤生长的体内抑制，与TF12对照进行比较。在添加或不添加干扰素-α(以形式加入)的情况下，NOD/SCID小鼠中的NCI-N87人胃癌异种移植物用抗-TROP-2x抗-CD3bsAb治疗，与未经处理的对照、TF12对照或单独相比较。

图21.在存在或不存在干扰素-α的情况下，用(E1)-3s处理的具有NCI-N87胃癌异种移植物的NOD/SCID小鼠的存活曲线对照未经处理或经单独或单独TF12处理。

图22.初期E1-3多肽的示意图。LP，在成熟蛋白质中被除去的前导肽；VH，重链可变区，VK,κ轻链可变区，L1，连接子肽1；L2，连接子肽2；L3，连接子肽3；6H，六组氨酸。

图23A.BxPC3人胰腺癌实体瘤细胞系的体外T细胞重定向杀灭。

图23B.Capan-1人胰腺癌实体瘤细胞系的体外T细胞重定向杀灭。

图23C.NCI-N87人胃癌实体瘤细胞系的体外T细胞重定向杀灭。

图24.NOD-SCID小鼠中NCI-N87胃癌的体内T细胞重定向疗法

图25.(E1)-3s介导的免疫突触形成和双定向胞啃。使纯化的T细胞与BxPC3细胞以5:1比率混合并且与0.1nmol/L的指示bsAb温育60分钟，然后用抗-Trop-2MAbC518和GAM-Fc-FITC染色。使用由前向散射对侧向散射首先选通的未缀合的T细胞和BxPC3细胞，通过流式细胞术分析细胞。通过检测T细胞上的Trop-2，具体地与(E1)-3s的细胞混合物中，显示为Trop-2-阳性未缀合的T细胞的百分比，来自BxPC3细胞的Trop-2对T细胞的胞啃很明显。

图26.(E1)-3s介导的免疫突触形成和双定向胞啃。使纯化的T细胞与BxPC3细胞以5:1比率混合并且与0.1nmol/L的指示bsAb温育60分钟，然后用抗-Trop-2MAbC518和GAM-Fc-FITC染色。使用由前向散射对侧向散射首先选通的未缀合的T细胞和BxPC3细胞，通过流式细胞术分析细胞。胞啃导致了BxPC3细胞上Trop-2的减少，示为几何MFI。

图27A.细胞因子诱导。使(A)PBMC(6x106细胞/孔)与Raji(5x105细胞/孔)混合并且使用0.1nM19-3BiTE(网纹)、(19)-3s(黑色)处理20小时或在无bsAb的情况下温育(白色，未针对D-5测试)。使用商业ELISA试剂盒确定上清液流体中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6以及IL-10的浓度。D-1到D-8是独立的血液供体，其中仅D-5同时用于A和B两者中。

图27B.在24孔板中将NCI-N87细胞(5x105细胞/0.5mL/孔)培育过夜以允许细胞连接。将PBMC添加到含有连接的NCI-N87细胞的孔中(比率10:1)并且使用0.1nM的(E1)-3s(黑色)、聚乙二醇干扰素α-2a(白色)、(E1)-3s加聚乙二醇干扰素α-2a(网纹)处理20小时或不处理(灰色)。使用商业ELISA试剂盒确定上清液流体中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6以及IL-10的浓度。D-l到D-8是独立的血液供体，其中仅D-5同时用于A和B两者中。

图28A.体外细胞毒性。使用0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(▲，虚线)、0.1nM20*-2b(·,灰色)或介质(■，黑色)将从第一供体分离的纯化的CD8+T细胞预处理24小时，然后与PKH-67绿色荧光标记的NCI-N87细胞以5:1比率混合。使用(E1)-3s的滴定将细胞混合物处理两天，然后通过流式细胞术计数存活NCI-N87细胞的数目。针对每个样品，使用下式，计算溶解百分比的非线性回归分析(S形剂量反应)：[l-(A1/A2)]x100，其中A1和A2分别代表测试和未经处理的样品中活靶细胞的数目对(E1)-3s的摩尔浓度的对数。

图28B.体外细胞毒性。使用0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(▲，虚线)、0.1nM20*-2b(·,灰色)或介质(■，黑色)将从第二供体分离的纯化的CD8+T细胞预处理24小时，然后与PKH-67绿色荧光标记的NCI-N87细胞以5:1比率混合。使用(E1)-3s的滴定将细胞混合物处理两天，然后通过流式细胞术计数存活NCI-N87细胞的数目。针对每个样品，使用下式，计算溶解百分比的非线性回归分析(S形剂量反应)：[l-(A1/A2)]x100，其中A1和A2分别代表测试和未经处理的样品中活靶细胞的数目对(E1)-3s的摩尔浓度的对数。

图29A.T-细胞活化。将纯化的T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合并且使用(E1)-3s处理18小时，然后通过流式细胞术测量CD69表达。在0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a存在(虚线)或不存在(实现)的情况下，CD69-阳性CD4+(·)或CD8+(■)T细胞百分比对(E1)-3s的摩尔浓度的对数的非线性回归分析(S形剂量反应)。

图29B.T-细胞活化。将纯化的T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合并且使用(E1)-3s处理18小时，然后通过流式细胞术测量CD69表达。直方图示出了在NCI-N87细胞的存在下，抗-CD69-APC染色的之后使用0.1nM(E1)-3s(点线)、0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(灰色)或两种试剂的组合(黑色)处理的CD8+T细胞。

图29C.T-细胞活化。将纯化的T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合并且使用(E1)-3s处理18小时，然后通过流式细胞术测量CD69表达。在不存在或存在NCI-N87靶细胞(T)的情况下，在与0.1nM(E1)-3s(E)和/或0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(P)温育后CD69阳性CD8+T细胞百分比。各种处理测定进行三次。误差线，S.D.*,P<0.001。

图29D.T-细胞活化。将纯化的T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合并且使用(E1)-3s处理18小时，然后通过流式细胞术测量CD69表达。在不存在或存在NCI-N87靶细胞(T)的情况下，与0.1nM(E1)-3s(E)和/或0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(P)温育后，CD69+细胞的几何平均荧光。各种处理测定进行三次。误差线，S.D.*,P<0.001。

图30A.与人胰腺和胃癌异种移植物的体内效能。使接种有人T细胞和Capan-1胰腺癌细胞的8组小鼠每天使用50μg的(E1)-3s(▲，实心黑色)或60μgTF12(▼，灰色)处理，持续五天，每周使用0.6μg的聚乙二醇干扰素α-2a(*，实心黑色)、(E1)-3s和聚乙二醇干扰素α-2a方案组合(·,实心黑色)，持续四周或使用盐水(·,虚线黑色)处理。另外的组接种有Capan-1，但无T细胞并且使用聚乙二醇干扰素α-2a(□，虚线黑色)处理。上图，Kaplan-Meyer存活图。下图，平均肿瘤体积(+S.D.)对天。星号标记的数据改编自Rossi等人.(2014,MAbs6:381-91)中的图6C。

图30B.与人胰腺和胃癌异种移植物的体内效能。使接种有人T细胞和Capan-1胰腺癌细胞的8组小鼠每天使用50μg的(E1)-3s(▲，实心黑色)或60μgTF12(▼，灰色)处理，持续五天，每周使用0.6μg的聚乙二醇干扰素α-2a(*，实心黑色)、(E1)-3s和聚乙二醇干扰素α-2a方案组合(·,实心黑色)，持续四周或使用盐水(·,虚线黑色)处理。另外的组接种有Capan-1，但无T细胞并且使用聚乙二醇干扰素α-2a(□，虚线黑色)处理。上图，Kaplan-Meyer存活图。下图，平均肿瘤体积(+S.D.)对天。星号标记的数据改编自Rossi等人.(2014,MAbs6:381-91)中的图6C。

图30C.与人胰腺和胃癌异种移植物的体内效能。使接种有NCI-N87胃癌细胞的8组小鼠每天使用50μg的(E1)-3s(▲，实心黑色)或60μgTF12(▼，灰色)处理，持续五天，每周使用0.6μg的聚乙二醇干扰素α-2a(*，实心黑色)、(E1)-3s和聚乙二醇干扰素α-2a方案组合(·,实心黑色)，持续四周或使用盐水(·,虚线黑色)处理。另外的组接种有Capan-1，但无T细胞并且使用聚乙二醇干扰素α-2a(□，虚线黑色)处理。上图，Kaplan-Meyer存活图。下图，平均肿瘤体积(+S.D.)对天。星号标记的数据改编自Rossi等人.(2014,MAbs6:381-91)中的图6C。

图31.E1-3诱导的细胞因子产生。PBMC以5:1比率与BxPC-3细胞混合并且使用E1-3的滴定处理24小时。使用Single-AnalyteELISArray试剂盒(Qiagen)测量细胞因子浓度。在不存在E1-3的情况下，所有细胞因子水平<10pg/mL。

图32.胰腺和胃癌细胞系的体外重定向T细胞杀灭。将纯化的CD8+T细胞(1.2x105/孔)以6:1与靶细胞(2x104/孔)混合并且在96孔板中使用E1-3的滴定处理。在48小时后，洗涤以除去T细胞并且使用MTS测定测量存活靶细胞密度。针对若干T细胞供体中的一个的结果的示例。

图33A.人胃肿瘤异种移植物的体内疗法。PBMC以2:1与NCI-N87细胞混合并且使用基质胶皮下注射到NOD-SCID小鼠。在第0天和第3天静脉内向动物给予50μg的E1-3。针对肿瘤生长物的迹象，每日监测小鼠，之后在端值测量>1.0cm3的情况下一周两次测量肿瘤。在176后，E1-3治疗组中8个小鼠中7个未达到端值，其中6个动物保持没有肿瘤。

详述

定义

除非另有说明，否则“一个(种)”表示“一个(种)或多个(种)”。

如本文所使用的，术语“和”与“或”可用来指连词或反意连词。也就是说，这两个术语应该被理解为相当于“和/或”，除非另有说明。

“治疗剂”是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光活性剂、染料，和放射性同位素。

如本文使用的“抗体”是指全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段。“抗体”包括单克隆、多克隆、双特异性、多特异性、鼠、嵌合、人源化和人抗体。

“裸抗体”是未与治疗剂或诊断剂连接的抗体或其抗原结合片段。完整裸抗体的Fc部分可提供效应因子功能，如补体固定和ADCC(参见，例如，Markrides,PharmacolRev50:59-87,1998)。裸抗体诱导细胞死亡的其他机制可包括细胞凋亡。(Vaswani和Hamilton,AnnAllergyAsthmaImmunol81:105-119,1998.)。

“抗体片段”是完整抗体的一部分，如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv、dAb等。无论结构怎样，抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合。举例来说，术语“抗体片段”包括由可变区组成的经分离片段，如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段，以及其中轻链和重链可变区由肽连接子连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。“单链抗体”通常缩写为“scFv”，由多肽链组成，其包含相互作用以形成抗原结合位点的VH和VL域。VH和VL域通常通过1至25个氨基酸残基的肽来连接。抗体片段还包括双功能抗体、三抗体和单结构域抗体(dAb)。

如本文中所使用，术语“抗体融合蛋白”是重组产生的抗原结合分子，其中抗体或抗体片段被连接至另一种蛋白质或肽，如相同的或不同的抗体或抗体片段或DDD肽或AD肽。融合蛋白可以包含单一抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性的组合或同一抗体组分的多个拷贝。融合蛋白可以另外地包含抗体或抗体片段和治疗剂。适用于此类融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂和毒素。一种优选的毒素包含核糖核酸酶(RNA酶)，优选地为重组RNA酶。优选免疫调节剂可为干扰素，如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ。

“多特异性抗体”是可以同时结合至少两个具有不同结构的靶标(例如，两个不同的抗原、在同一抗原上的两个不同表位、或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。“多价抗体”是可以同时结合至少两个具有相同或不同结构的靶标的抗体。价态表明抗体对单个抗原或表位具有多少个结合臂或位点；即，一价、二价、三价或多价。抗体的多价性意味着抗体可以使用多种相互作用结合抗原，从而增加结合抗原的亲合力。特异性表明抗体能够结合多少个抗原或表位；即，单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义，天然抗体(例如，IgG)是二价的，因为它具有两个结合臂，但该抗体是单特异性的，因为它结合一个表位。多特异性的、多价的抗体是含有多于一个具有不同特异性的结合位点的构建体。

如果所施用的量具有生理学显著性，则本文描述的抗体制剂或组合物被认为以“治疗有效量”来施用。如果试剂的存在导致受体受试者的生理学方面产生可检测变化，那么其具有生理学显著性。在具体实施方案中，如果抗体制剂的存在引起抗癌反应或缓解传染病状态的体征和症状，则其具有生理学显著性。生理学上显著的效应也可为在受体受试者中引起体液和/或细胞免疫应答，从而导致靶细胞的生长抑制或死亡。

抗-Trop-2抗体

RS7抗体是是抗人原发肺鳞状细胞癌的粗制膜制备物而产生的鼠IgG1。(Stein等人，CancerRes.50:1330,1990)。RS7抗体识别46kDa-48kDa糖蛋白，特征为聚簇13。((Stein等人，Int.J.CancerSupp.8:98-102,1994)。该抗原被命名为EGP-1(上皮糖蛋白-1)，但也称为Trop-2。

Trop-2作为实体癌的治疗性靶的日益增加的兴趣(Cubas等人，BiochimBiophysActa2009；1796:309-14)通过另外报导得以证明，该报导记录了过表达的Trop-2在乳房((Huang等人，ClinCancerRes2005；11:4357-64)、结肠直肠(Ohmachi等人,ClinCancerRes2006；12:3057-63；Fang等人,IntJColorectalDis2009；24:875-84)和口腔鳞状细胞(Fong等人，ModemPathol2008；21:186-91)癌中的临床意义。表达高水平的Trop-2的前列腺基底细胞因体外和体内干细胞样活性而富集的最新证据是特别值得注意的(Goldstein等人，ProcNatlAcadSciUSA2008；105:20882-7)。

流式细胞术和免疫组织化学染色研究已表明RS7MAb检测多种类型肿瘤上的抗原，而有限结合到正常人组织(Stein等人，1990)。Trop-2主要由癌诸如肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌以及前列腺癌表达。在动物模型中使用放射性标记鼠RS7MAb进行的定位和治疗研究已证明肿瘤靶向性和治疗效力(Stein等人，1990；Stein等人，1991)。

已表明在来自肺、乳、膀胱、卵巢、子宫、胃以及前列腺的肿瘤中存在RS7强染色。(Stein等人，Int.J.Cancer55:938,1993)。肺癌病例包括鳞状细胞癌和腺癌两者。(Stein等人，Int.J.Cancer55:938,1993)。两种细胞类型均强染色，指示RS7抗体不能从非小细胞肺癌的组织学分类上区分。

RS7MAb被快速内在化至靶细胞(Stein等人，1993)。RS7MAb的内在化速度常数介于其他两种快速内在化MAb的内在化速度常数之间，其他两种快速内在化已经被证明可用于免疫毒素制备。同上。已大量记载免疫毒素缀合物的内在化对抗-肿瘤活性是必须的。(Pastan等人，细胞47:641,1986)。药物免疫缀合物的内在化也已经被描述为抗-肿瘤效能中的主要因素。(Yang等人，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA85:1189,1988)。因此，RS7抗体表现出治疗应用的若干重要特性。

虽然hRS7抗体是优选的，但其他抗-Trop-2抗体是已知的并且/或可公开获得，并且在另选的实施方案中，可在目标ADC中使用。

虽然对于减少免疫原性，人源化或人抗体是优选的，但在另选的实施方案中，可使用嵌合抗体。如上所论述，抗体人源化的方法是本领域已知的并且可用于将可获得的鼠或嵌合抗体转化为人源化形式。

多个抗-Trop-2抗体在本领域是已知的和/或可公开获得的。如以下所论述，用于制备针对已知抗原的抗体的方法在本领域中是常规的。人Trop-2蛋白质的序列在本领域中也是已知的(参见，例如，GenBank保藏编号CAA54801.1)。用于产生人源化、人或嵌合抗体的方法也是已知的。根据本领域中的常识，阅读本公开内容的普通技术人员将能够制作和使用目标ADC中的抗-Trop-2抗体种类。

抗-CD3抗体

可用于要求保护的方法和组合物中的针对CD3的各种抗体是公开已知的且/或可购得，如从LSBio(目录号LS-B6698、LS-B8669、LS-B8765、LS-C96311、LS-C58677等)；(目录号ab5690、ab16669、ab699、ab828、ab8671等)；SantaCruzBiotechnology(目录号sc-20047、sc-20080、sc-19590、sc-59008、sc-101442等)；和许多其他供应商。

在一个优选实施方案中，用作DNLTM复合物一部分的抗-CD3部分的氨基酸序列如以下在SEQIDNO:96至SEQIDNO:101中公开。然而，本领域普通技术人员将认识到任何已知抗-CD3抗体可用于要求保护的方法和组合物中。优选地，有用的抗体部分是人源化或人抗体。

白细胞重定向双特异性抗体复合物

某些另选的实施方案可涉及抗-CD3x抗-CD19双特异性抗体。各种双特异性抗-CD3x抗-CD19抗体在在本领域中为已知的并且目前在临床开发中，如(双特异性T-细胞衔接子)(例如，Nagorsen等人，2009,Leukemia&Lymphoma50:886-91；Amann等人，2009,JImmunother32:453-64；Baeuerle和Reinhardt,2009,CancerRes69:4941-44)和(参见，例如，Moore等人，2011,Blood117:4542-51；Veri等人，2010,ArthritisRheum62:1933-43)。布利莫单抗(Blinatumomab)是包含用5-氨基酸连接子连接的VH和VL域抗-CD3和抗-CD19抗体片段的抗体，并且表达为粘接至本身以形成抗原结合位点的单一多肽链。认为布利莫单抗起作用的方式是使T-细胞-特异性CD3和B-细胞特异性CD19抗原紧密接近，以引发针对并置B细胞的T-细胞毒性响应，其不需要癌细胞的T-细胞特异性(例如，Portell等人，2013,ClinPharmacol5(增刊1):5-11)。由于它的较短半衰期，布利莫单抗需要连续静脉内输注以便有效，(Portell等人，2013)。患有持续或复发最小残留疾病的B-细胞ALL患者的II期试验报告大约80％的全面缓解率(Portell等人，2013)。

低至0.005mg/m2/天的布利莫单抗剂量报告可有效消除非霍奇金淋巴瘤患者的癌细胞(Bargou等人，2008,Science321:974-77)。从0.015mg剂量水平开始观察到部分和完全缓解并且在0.06mg剂量下测试的全部六个患者经历肿瘤消退(Bargou等人，2008)。在体外，布利莫单抗在10pg/mL浓度下诱导MEC-1细胞的50％细胞溶解(Topp等人，2012,Blood120:5185-87；Bassan等人，2012,Blood120:5094-95)。

针对CD19的各种抗体是公开已知的且/或可购得，如从SantaCruzBiotechnology(目录号sc-390244、sc-373897、sc-18894、sc-18896等)；(目录号ab25232、ab134114、ab140981、ab1255等)；ABBIOTECTM(目录号252262、252248、250585、251063等)和许多其他供应商。

干扰素疗法

已经报告干扰素-α(IFNα)在癌症的动物模型(Ferrantini等人，1994,JImmunol153:4604-15)和人癌症患者(Gutterman等人，1980,AnnInternMed93:399-406)中具有抗肿瘤活性。IFNα可发挥各种直接抗肿瘤效应，包括下调致癌基因、上调肿瘤抑制因子、经由增加肿瘤表面MHCI类蛋白质的表达来增强免疫识别、增强细胞凋亡和对于化学治疗剂敏感化(Gutterman等人，1994,PNASUSA91:1198-205；Matarrese等人，2002,AmJPathol160:1507-20；Mecchia等人，2000,GeneTher7:167-79；Sabaawy等人，1999,IntJOncol14:1143-51；Takaoka等人，2003,Nature424:516-23)。对于一些肿瘤，IFNα可经由活化STAT1而具有直接和有效的抗增殖效应(Grimley等人，1998Blood91:3017-27)。干扰素-α2b在体外和体内与抗肿瘤抗体(如hL243抗-HLA-DR抗体)缀合并且耗竭淋巴瘤和骨髓瘤细胞(Rossi等人，2011,Blood118:1877-84)。

间接地，IFNα可抑制血管生成(Sidky和Borden,1987,CancerRes47:5155-61)并且刺激宿主免疫细胞，这对于总体抗癌反应可为极其重要的但是很大程度上被低估(Belardelli等人，1996,ImmunolToday17:369-72)。IFNα通过对骨髓细胞(Raefsky等人，1985,JImmunol135:2507-12；Luft等人，1998,JImmunol161:1947-53)、T-细胞(Carrero等人，2006,JExpMed203:933-40；Pilling等人，1999,EurJImmunol29:1041-50)和B-细胞(Le等人，2001,Immunity14:461-70)的作用而对于免疫响应具有多效性影响。作为先天免疫系统的重要调节剂，IFNα诱导树突状细胞的快速分化和活化(Belardelli等人，2004,CancerRes64:6827-30；Paquette等人，1998,JLeukocBiol64:358-67；Santini等人，2000,JExpMed191:1777-88)并且增强NK细胞的细胞毒性、迁移、细胞因子产生和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Biron等人，1999,AnnRevImmunol17:189-220；Brunda等人1984,CancerRes44:597-601)。

被称为III型干扰素的IFN-λ是由IFN-λ1、2、3(也分别称为白介素-29、28A和28B)组成的一组新描述的细胞因子，其由位于染色体19上的三个不同基因来编码(Kotenko等人，2003,NatImmunol4:69-77；Sheppard等人，2003,NatImmunol4:63-8)。在蛋白质层面下，IFN-λ2和-λ3是高度同源的，具有96％氨基酸同一性，而IFN-λ1与IFN-λ2和-λ3共有大约81％同源性(Sheppard等人，2003,NatImmunol4:63-8)。IFN-λ经由与I型IFN诱导的途径类似的JAK/STAT途径来启动信号转导，包括活化JAK1和TYK2激酶、磷酸化STAT蛋白质和活化IFN-刺激基因因子3(ISGF3)的转录复合物(Witte等人，2010,CytokineGrowthFactorRev21:237-51；Zhou等人，2007,JVirol81:7749-58)。

已经在若干种人类癌细胞系中确定了IFN-λ的抗增殖活性，包括神经内分泌癌瘤(Zitzmann等人，2006,BiochemBiophysResCommun344:1334-41)、成胶质细胞瘤LN319(Meager等人，2005,Cytokine，31:109-18)、永生化角质细胞HaCaT(Maher等人，2008,CancerBiolTher7:1109-15)、黑素瘤F01(Guenterberg等人，2010,MolCancerTher9:510-20)以及食道癌TE-11(Li等人，2010,EurJCancer46:180-90)。在动物模型中，IFN-λ经由先天和适应性免疫应答来诱导肿瘤细胞凋亡和破坏，表明IFN-λ的局部递送可能是治疗人恶性肿瘤中的有用辅助策略(Numasaki等人，2007,JImmunol178:5086-98)。Fab连接的干扰素λ显示在靶细胞中具有有效的抗肿瘤和抗病毒活性(Liu等人，2013,PLoSOne8:e63940)。

在各种实施方案中，目标白细胞重定向双特异性抗体、ADC和/或检查点抑制剂mAb可以与一种或多种干扰素诸如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-λl、干扰素-λ2,或干扰素λ3组合使用。当与其他药剂一起使用时，干扰素可在其他药剂之前、同时或之后施用。当同时施用时，干扰素可与其他药剂偶联或分开。

检查点抑制剂抗体

使用检查点抑制剂抗体用于癌症疗法的研究已经在先前认为对癌症治疗具有抗性的癌症中产生了前所未有的反应率(参见，例如，Ott&Bhardwaj,2013,FrontiersinImmunology4:346；Menzies&Long,2013,TherAdvMedOncol5:278-85；Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-64；Mavilio&Lugli,)。利用针对诸如CTLA4、PD1和PD-L1的免疫系统检查点的拮抗性检查点阻断抗体的疗法是用于癌症和其他疾病的免疫疗法的最有前景的新手段之一。与大多数抗癌剂相反，检查点抑制剂不直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体或其配体，以提高免疫系统的内源性抗癌活性。(Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)因为此类抗体主要通过调节对患病细胞、组织或病原体的免疫应答起作用，所以它们可以与其他治疗形态组合使用，诸如目标白细胞重定向双特异性抗体、ADC和/或干扰素，以提高此类药剂的抗肿瘤效果。

现在已经清楚，肿瘤可以通过强占某些免疫检查点途径而逃避免疫监测，特别是在肿瘤抗原特异性T细胞中(Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)。因为许多此类免疫检查点由配体-受体相互作用引发，所以它们可以通过针对所述配体和/或其受体的抗体被容易地阻断(Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)。虽然针对CTLA4、PD1和PD-L1的检查点抑制剂抗体是临床上最先进的，但其他潜在检查点抗原是已知的，并且可以用作诸如诸如LAG3、B7-H3、B7-H4以及TIM3的治疗抗体的靶标(Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)。

程序性细胞死亡蛋白1(PD1，也称为CD279)编码B细胞和NK细胞中所表达的免疫球蛋白超家族的细胞表面膜蛋白(Shinohara等人,1995,Genomics23:704-6；Blank等人,2007,CancerImmunolImmunother56:739-45；Finger等人,1997,Gene197:177-87；Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)。PD1的主要作用在于限制响应于感染的发炎期间在周围组织中的T细胞活性以及限制自体免疫性(Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)。在活化的T细胞中诱导PD1表达，并且PD1与其内源性配体之一结合通过抑制刺激性激酶而起抑制T细胞活化的作用(Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)。PD1还起抑制TCR“停止信号”的作用(Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)。PD1高度表达于Treg细胞上，且可在配体存在下增加其增殖(Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)。

抗PD1抗体已用于治疗黑素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠直肠癌、头颈癌、三阴性乳腺癌、白血病、淋巴瘤及肾细胞癌(Topalian等人，2012,NEnglJMed366:2443-54；Lipson等人，2013,ClinCancerRes19:462-8；Berger等人，2008,ClinCancerRes14:3044-51；Gildener-Leapman等人，2013,OralOncol49:1089-96；Menzies&Long,2013,TherAdvMedOncol5:278-85)。因为PD1/PD-L1及CTLA4通过不同的途径起作用，所以利用针对各抗原的检查点抑制剂抗体的组合疗法可以提供增强的免疫应答是有可能的。

示例性抗-PDl抗体包括兰利珠单抗(MK-3475，MERCK)、尼鲁单抗(BMS-936558，BRISTOL-MYERSSQUIBB)、AMP-224(MERCK)以及皮地珠单抗(CT-011，CURETECH公司)。抗-PDl抗体可从例如(AB137132)、(EH12.2H7，RMP1-14)以及AFFYMETRIXEBIOSCIENCE(J105，J116，MIH4)商购获得。

程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为CD274及B7-H1)是在活化的T细胞、B细胞、骨髓细胞和巨噬细胞上发现的PD1的配体。虽然PD1存在两种内源性配体，PD-L1和PD-L2，但抗肿瘤疗法已经集中于抗-PD-Ll抗体。PD1和PD-L1的复合物抑制CD8+T细胞增殖且减少免疫应反应(Topalian等人，2012,NEnglJMed366:2443-54；Brahmer等人，2012,NEngJMed366:2455-65)。抗-PD-Ll抗体已用于治疗非小细胞肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌以及血液恶性肿瘤(Brahmer等人，NEngJMed366:2455-65；Ott等人，2013,ClinCancerRes19:5300-9；Radvanyi等人，2013,ClinCancerRes19:5541；Menzies&Long,2013,TherAdvMedOncol5:278-85；Berger等人,2008,ClinCancerRes14:13044-51)。

示例性抗-PD-L1抗体包括MDX-1105(MEDAREX)、MEDI4736(MEDIMMUNE)MPDL3280A(GENENTECH)以及BMS-936559(BRISTOL-MYERSSQUIBB)。抗-PD-Ll抗体还可从例如AFFYMETRIXEBIOSCIENCE(MIH1)商购获得。

细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4，也被称为CD152)也是专门表现在T细胞上的免疫球蛋白超家族的成员。CTLA4起抑制T细胞活化的作用，并且据报告能抑制辅助T细胞活性和提高调节T细胞免疫抑制活性(Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)。虽然CTL4-A的确切作用机制仍在研究中，但已经提出其通过在竞争结合CD80和CD86方面胜出CD28以及积极向T细胞递送抑制信号而抑制T细胞活化(Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)。抗CTL4A抗体已用于临床试验中用于治疗黑素瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(Robert&Ghiringhelli,2009,Oncologist14:848-61；Ott等人，2013,ClinCancerRes19:5300；Weber,2007,Oncologist12:864-72；Wada等人，2013,JTranslMed11:89)。抗CTL4A的显著特征是抗肿瘤效应的动力学性质，其中生理反应所需的初步治疗后停滞期多达6个月(Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)。在一些情况下，治疗开始之后肿瘤尺寸实际上可能增加，随后可见减小(Pardoll,2012,NatureReviewsCancer12:252-264)。

示例性抗-CTLA4抗体包括伊匹单抗(Bristol-MyersSquibb)和曲美目单抗(PFIZER)。抗-PD1抗体可从例如(AB134090)、SINOBIOLOGICAL公司(11159-H03H，11159-H08H)和THERMOSCIENTIFICPIERCE(PA5-29572、PA5-23967、PA5-26465、MA1-12205、MA1-35914)商购获得。伊匹单抗最近已经接到FDA批准用于治疗转移性黑素瘤(Wada等人，2013,JTranslMed11:89)。

刺激针对肿瘤及/或病原体的免疫应答的这些和其他已知药剂可以与单独或进一步与干扰素诸如干扰素α和/或用于改良癌症疗法的抗体-药物缀合物组合的白细胞重定向双特异性抗体组合使用。可以组合使用的其他已知共刺激途径调节剂包括但不限于阿托莫德、贝拉西普、布利莫单抗、CD40配体、抗-B7-l抗体、抗-B7-2抗体、抗-B7-H4抗体、AG4263、依立托仑、抗-OX40抗体、ISF-154以及SGN-70；B7-1、B7-2、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD48、LFA-3、CD30配体、CD40配体、耐热抗原、B7h、OX40配体、LIGHT、CD70以及CD24。

在某些实施例中，抗KIR抗体也可以与白细胞重定向bsAb、干扰素、ADC和/或检查点抑制剂抗体组合使用。当被抗体活化时NK细胞通过自发性细胞毒性和通过ADCC介导抗肿瘤和抗感染剂活性(Kohrt等人，2013,Blood,[印刷前电子版12/10/13])。细胞毒性反应程度由NK细胞接到的抑制信号与活化信号的平衡来决定(Kohrt等人，2013)。杀灭细胞免疫球蛋白样受体(KIR)介导降低NK细胞反应的抑制信号。抗KIR抗体，诸如利利单抗(InnatePharma)和IPH2101(InnatePharma)，已在多发性骨髓瘤中显示抗肿瘤活性(Benson等人,2012,Blood120:4324-33)。在体外，抗KIR抗体防止NK细胞与靶细胞的致耐受性相互作用，并且增加NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性反应(Kohrt等人，2013)。在体内，在与利妥昔单抗(抗CD20)组合时，抗KIR抗体在0.5mg/kg的剂量下诱导的针对淋巴瘤的NK细胞介导的利妥昔单抗依赖性细胞毒性有所增强(Kohrt等，2013)。抗KIRmAb可以与ADC、白细胞重定向bsAb、干扰素和/或检查点抑制剂抗体组合以加强对肿瘤细胞或病原生物体的细胞毒性。

一般抗体技术

用于制备实际上针对任何靶抗原的单克隆抗体的技术为本领域中熟知的。参见，例如，Kohler和Milstein，Nature256:495(1975)和Coligan等人(编著)，CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,第1卷，第2.5.1-2.6.7页(JohnWiley&Sons1991)。简单地说，单克隆抗体可通过以下方式获得：将包含抗原的组合物注入小鼠，移除脾以获得B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生抗原抗体的阳性克隆，培养产生针对该抗原的抗体的克隆，并且从杂交瘤培养物中分离抗体。

可通过多种已确立的技术从杂交瘤培养物分离和纯化MAb。此类分离技术包括使用蛋白A琼脂糖凝胶的亲和色谱法、体积排阻色谱法和离子交换色谱法。参见例如Coligan的第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。还参见Baines等人，“PurificationofImmunoglobulinG(IgG),”于METHODSINMOLECULARBIOLOGY,第10卷，第79-104页(TheHumanaPress,Inc.1992)。

嵌合抗体

嵌合抗体是一种重组抗体，其中人抗体的可变区已置换为例如小鼠抗体的可变区，包括小鼠抗体的互补性决定区(CDR)。嵌合抗体在施用至受试者时显示降低的免疫原性和增强的稳定性。用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术公开例如于Orlandi等人，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA86:3833(1989)。用于构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员熟知的。举例来说，Leung等人，Hybridoma13:469(1994)通过将编码鼠类抗CD22抗体LL2的VK和VH结构域的DNA序列与相应人κ和IgG1恒定区结构域组合产生了LL2嵌合体。

人源化抗体

产生人源化MAb的技术在本领域中是熟知的(参见，例如，Jones等人，Nature321:522(1986),Riechmann等人，Nature332:323(1988),Verhoeyen等人，Science239:1534(1988),Carter等人，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA89:4285(1992),Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)，和Singer等人，J.Immun.150:2844(1993))。嵌合或鼠单克隆抗体可通过将来自于小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区的小鼠CDR转移到人抗体的相应可变结构域中来进行人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也可置换为人FR序列。因为简单地将小鼠CDR转移到人FR中通常导致抗体亲和力降低或甚至丧失，所以可能需要进行额外修饰以恢复鼠抗体的初始亲和力。此举可通过将FR区中的一个或多个人残基置换为其鼠对应物以获得对其表位具有良好结合亲和力的抗体来实现。参见例如Tempest等人，Biotechnology9:266(1991)和Verhoeyen等人，Science239:1534(1988)。总体上，不同于其鼠对应物并且接近或接触一个或多个CDR氨基酸残基而定位的那些人FR氨基酸残基是取代候选物。

人抗体

使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生完全人抗体的方法在本领域中为已知的(例如，Mancini等人，2004,NewMicrobiol.27:315-28；Conrad和Scheller,2005,Comb.Chem.HighThroughputScreen.8:117-26；Brekke和Loset,2003,Curr.Opin.Phamacol.3:544-50)。还可通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建完全人抗体，所有方法和技术在本领域中都是已知的。参见例如McCafferty等人，Nature348:552-553(1990)。预期此类完全人抗体表现比嵌合或人源化抗体甚至更少的副作用并且在体内起基本上内源性人抗体的作用。在某些实施方案中，所要求保护的方法和工序可以使用由此类技术产生的人抗体。

在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等人(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体呈现文库。一般来说，从循环血液淋巴细胞获得总RNA(同上)。从μ、γ以及κ链抗体谱系克隆重组Fab并且将其插入至噬菌体呈现文库中(同上)。将RNA转变成cDNA并用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物制备FabcDNA文库(Marks等人，1991,J.Mol.Biol.222:581-97)。根据Andris-Widhopf等人(2000，于：PHAGEDISPLAYLABORATORYMANUAL,Barbas等人(编)，第1版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY第9.1至9.22页)来进行文库构建。用限制性核酸内切酶消化最终Fab片段并插入噬菌体基因组中以制备噬菌体呈现文库。这类文库可通过如在本领域中已知的标准噬菌体呈现方法来筛选(参见，例如，Pasqualini和Ruoslahti,1996,Nature380:364-366；Pasqualini,1999,TheQuart.J.Nucl.Med.43:159-162)。

噬菌体展示可以多种格式执行，关于其综述，请参见例如Johnson和Chiswell,CurrentOpinioninStructuralBiology3:5564-571(1993)。还可以由体外活化的B细胞来产生人抗体。参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其全文以引用方式并入本文中。熟练技术人员将认识到，这些技术是作为示例并且可利用制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。

在另一替代方案中，可使用已进行基因工程改造以产生人抗体的转基因动物来使用标准免疫方案产生针对基本上任何免疫原性靶标的抗体。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等人，NatureGenet.7:13(1994)、Lonberg等人，Nature368:856(1994)以及Taylor等人，Int.Immun.6:579(1994)公开。这类系统的非限制性实例是(例如，Green等人，1999,J.Immunol.Methods231:11-23)，其来自Abgenix(Fremont,CA)。在和类似动物中，已使小鼠抗体基因失活并置换为功能性人抗体基因，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。

将用含有部分人IgH和Igκ基因座，包括大部分可变区序列连同辅助基因和调控序列的生殖系构型YAC(酵母人工染色体)转化。人可变区谱系可以用来获得产抗体的B细胞，所述B细胞可以通过已知的技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的将通过正常免疫应答产生人抗体，其可收集和/或通过上文所论述的标准技术进行制造。可获得的多种品系，其各自能够产生不同类别的抗体。已证明转基因产生的人抗体具有治疗潜能，同时保留正常人抗体的药代动力学性质(Green等人，1999)。熟练技术人员将认识到，所要求保护的组合物和方法不限于使用系统，而是可利用已进行基因工程改造以产生人抗体的任何转基因动物。

抗体克隆和产生

各种技术，如制造嵌合或人源化抗体，可能涉及抗体克隆和构建的程序。感兴趣的抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可通过各种分子克隆工序获得，如RT-PCR、5’-RACE和cDNA文库筛选。来自表达鼠抗体的细胞的抗体的V基因可以通过PCR扩增来克隆并且测序。为了证实其真实性，可以将克隆的VL和VH基因在细胞培养物中表达为嵌合抗体，如由Orlandi等(Proc.NatlAcadSci,USA,86:3833(1989))所描述。基于V基因序列，然后可以设计并且构建人源化抗体，如由Leung等(Mol.Immunol.,32:1413(1995))所述。

可以通过一般分子克隆技术从产生鼠类抗体的任何已知杂交瘤细胞系或经过转染的细胞系制备cDNA(Sambrook等人，MolecularCloning,Alaboratorymanual,第二版(1989))。可使用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等人,1989)或由Leung等人(BioTechniques,15:286(1993))描述的延伸引物组来扩增抗体的Vκ序列。VH序列可使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等人，1989)或Leung等人(Hybridoma,13:469(1994))所述的退火成鼠IgG恒定区的引物进行扩增。可如Leung等人(Mol.Immunol.,32:1413(1995))所述通过组合长寡核苷酸模版合成和PCR扩增来构建人源化V基因。

可以将Vκ的PCR产物亚克隆进入阶段载体，如基于pBR327的阶段载体(VKpBR)，其含有Ig启动子、信号肽序列以及适宜的限制位点。VH的PCR产物可亚克隆到类似阶段载体中，如基于pBluescript的VHpBS。含有Vκ和VH序列连同启动子和信号肽序列的表达盒可从VKpBR和VHpBS切除并且分别连接到适当的表达载体中，如pKh和pG1g(Leung等人,Hybridoma,13:469(1994))。可以将表达载体共转染进入适当的细胞并且监测上清液中嵌合、人源化或人抗体的产生。或者，可切除Vκ和VH表达盒并亚克隆至单一表达载体如pdHL2中，如由Gillies等人描述。(J.Immunol.Methods125:191(1989)并且也示于Losman等人，Cancer,80:2660(1997)中)。

在一替代实施方案中，可将表达载体转染至已预先适应在无血清培养基中转染、生长和表达的宿主细胞中。可使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见，例如，美国专利号7,531,327；7,537,930和7,608,425；其各自的实施例部分以引用方式并入本文)。这些示例性细胞系是基于以突变型Bcl-EEE基因转染、暴露于甲氨蝶呤以扩增所转染的基因序列并且预先适应无血清细胞系以供蛋白质表达的Sp2/0骨髓瘤细胞系。

抗体片段

可通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体的抗原结合部分，如F(ab')2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、scFv等。F(ab')2片段可通过用胃蛋白酶消化抗体分子而产生，而Fab'片段可通过还原F(ab')2片段的二硫键桥而产生。或者，可构建Fab'表达文库(Huse等,1989,Science,246:1274-1281)以允许快速且容易地鉴别具有所需特异性的单克隆Fab'片段。可通过抗体的木瓜蛋白酶消化来产生F(ab)2片段。

单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合形成靶标结合位点。这两个结构域由肽连接子(L)进一步共价连接。用于制造scFv分子和设计合适肽连接子的方法描述于美国专利号4,704,692；美国专利号4,946,778；Raag和Whitlow,FASEB9:73-80(1995)以及Bird和Walker,TIBTECH,9:132-137(1991)中。

产生单结构域抗体(DAB或VHH)的技术也在此项技术中已知的，如例如在以引用方式并入本文的Cossins等人(2006,ProtExpressPurif51:253-259)中所公开。可以例如采用标准免疫技术从骆驼、羊驼或美洲驼中获得单结构域抗体。(参见例如Muyldermans等人，TIBS26:230-235,2001；Yau等人，JImmunolMethods281:161-75,2003；Maass等人，JImmunolMethods324:13-25,2007)。该VHH可以具有强大的抗原结合能力，并可以与常规VH-VL对所不可及的新表位相互作用。(Muyldermans等人，2001)。羊驼血清IgG含有约50％仅有重链的骆驼IgG抗体(HCAb)(Maass等人，2007)。羊驼可用已知抗原(如TNF-α)免疫并且可分离结合并中和靶抗原的VHH(Maass等,2007)。已鉴定出扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物，并可以将其用来构建羊驼VHH噬菌体呈现文库，可利用所述文库通过本领域熟知的标准生物淘选技术(Maass等人，2007)分离抗体片段。在某些实施方案中，抗胰腺癌VHH抗体片段可用于要求保护的组合物和方法中。

抗体片段可通过全长抗体的蛋白水解或者在大肠杆菌或另一种宿主中表达编码片段的DNA来制备。可通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体来获得抗体片段。这些方法由例如Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647和其中包含的参考文献来描述。还参见Nisonoff等人，ArchBiochem.Biophys.89:230(1960)；Porter,Biochem.J.73:119(1959),Edelman等人，于METHODSINENZYMOLOGY第1卷，第422页(AcademicPress1967)，和Coligan，第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。

抗体同种异型

对于常见的IgG1人抗体而言，最普遍的同种异型是G1m1(Stickler等,2011,GenesandImmunity12:213-21)。然而，G1m3同种异型也常常发生于白种人中(Stickler等人，2011)。已经报道了当向非G1m1(nG1m1)受体(如G1m3患者)施用时，G1m1抗体含有倾向于诱导免疫应答的同种异型序列(Stickler等人，2011)。非G1m1同种异型抗体在施用至G1m1患者时并不同样具有免疫原性(Stickler等人，2011)。

人G1m1同种异型包含重链IgG1的CH3序列中的Kabat位置356上的氨基酸天冬氨酸和Kabat位置358上的亮氨酸。nG1m1同种异型包含Kabat位置356上的氨基酸谷氨酸和Kabat位置358上的甲硫氨酸。G1m1和nG1m1同种异型两者均包含Kabat位置357上的谷氨酸残基，并且该同种异型有时称为DEL和EEM同种异型。针对示例性抗体利妥昔单抗(SEQIDNO：85)和维妥珠单抗(SEQIDNO：86)，显示出G1m1和nG1m1同种异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实例。

利妥昔单抗重链可变区序列(SEQIDNO：85)

K

维妥珠单抗重链可变区(SEQIDNO：86)

Jefferis和Lefranc(2009，mAb1：1-7)综述了作为IgG同种异型的序列变化特征和其对免疫原性的影响。他们报道了与G1m17同种异型中的Kabat214上的赖氨酸残基相比，G1m3同种异型的特征在于Kabat位置214上的精氨酸残基。nG1m1，2同种异型的特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。G1m1，2同种异型的特征在于Kabat位置356上的天冬氨酸、Kabat位置358上的亮氨酸以及Kabat位置431上的甘氨酸。除了重链恒定区序列变异体之外，Jefferis和Lefranc(2009)报道了κ轻链恒定区中的同种异型变异体，其中Km1同种异型的特征在于Kabat位置153上的缬氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，Km1，2同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，并且Km3同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的缬氨酸。

对于治疗性抗体而言，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别是用于治疗多种血液恶性肿瘤和/或自身免疫性疾病的针对抗CD20的人源化和嵌合IgG1抗体。表1比较了利妥昔单抗与维妥珠单抗的同种异型序列。如在表1中所示，利妥昔单抗(G1m17,1)是DEL同种异型IgG1，在利妥昔单抗中的赖氨酸相对维妥珠单抗中的精氨酸在Kabat位置214(重链CH1)上具有额外序列变化。已经报道了在受试者中维妥珠单抗比利妥昔单抗的免疫原性小(参见，例如Morchhauser等人，2009,JClinOncol27:3346-53；Goldenberg等人，2009,Blood113:1062-70；Robak&Robak,2011,BioDrugs25:13-25)，这种作用已经被归因于人源化抗体与嵌合抗体之间的差异。然而，EEM与DEL同种异型之间的同种异型差异也可能解释维妥珠单抗的更低免疫原性。

表1.利妥昔单抗对维妥珠单抗的同种异型

已知的抗体

靶抗原和示例性抗体

如通过流式细胞术所示并且可作为选择免疫疗法的合适抗体的指导的造血恶性细胞上的合适抗原(群集指定，或CD)靶标的综合分析是于2008年1月15日在线预公布的Craig和Foon,Blood；DOL10.1182/Blood-2007-11-120535。

抗癌症抗体已经显示在一些情况下结合于组蛋白。Kato等人(1991,HumAntibodiesHybridomas2:94-101)报告了肺癌特异性人类单克隆抗体HB4C5结合至组蛋白H2B。Garzelli等人.(1994,ImmunolLett39:277-82)观察到经过埃-巴二氏病毒转化的人B淋巴细胞产生针对组蛋白的天然抗体。在某些实施方案中，针对组蛋白的抗体可用于目标组合中。已知的抗组蛋白抗体包括但不限于BWA-3(抗-组蛋白H2A/H4)、LG2-1(抗-组蛋白H3)、MRA12(抗-组蛋白H1)、PR1-1(抗-组蛋白H2B)、LG11-2(抗-组蛋白H2B)以及LG2-2(抗-组蛋白H2B)(参见，例如，Monestier等人,1991,EurJImmunol21:1725-31；Monestier等人,1993,MolecImmunol30:1069-75)。

对于多发性骨髓瘤疗法，已经描述针对例如CD38和CD138(Stevenson,MolMed2006；12(11-12):345-346；Tassone等人，Blood2004；104(12):3688-96)、CD74(Stein等人，ibid.)、CS1(Tai等人，Blood2008；112(4):1329-37和CD40(Tai等人，2005；CancerRes.65(13):5898-5906)的合适的靶向抗体。

巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是先天性和适应性免疫性和细胞凋亡的重要调节因子。已经报告CD74是MIF的内源性受体(Leng等人，2003,JExpMed197:1467-76)。拮抗性抗CD74抗体对MIF介导的细胞内途径的治疗效果可用于治疗多种疾病状态，诸如膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌以及慢性淋巴细胞性白血病(例如，Meyer-Siegler等人,2004,BMCCancer12:34；Shachar&Haran,2011,LeukLymphoma52:1446-54)。米拉珠单抗(hLL1)是用于治疗MIF介导疾病的治疗用途的示例性抗-CD74抗体。

最优选抗体/抗原对的实例是LL1，抗-CD74MAb(不变链，II类-特异性伴侣蛋白，Ii)(参见，例如，美国专利号6,653,104；7,312,318；其各自的实施例部分以引用方式并入本文)。CD74抗原高度表达于B-细胞淋巴瘤(包括多发性骨髓瘤)和白血病、某些T-细胞淋巴瘤、黑色素瘤、结肠癌、肺癌和肾癌、胶质母细胞瘤和某些其他癌症中(Ong等人，Immunology98:296-302(1999))。在癌症中使用CD74抗体的综述包含于Stein等人，ClinCancerRes.2007年9月15日；13(18Pt2):5556s-5563s中，其以引用方式并入本文。优选地用抗-CD74抗体治疗的疾病包括但不限于非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏疾病、黑素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、多形性成胶质细胞瘤、组织细胞瘤、骨髓性白血病和多发性骨髓瘤。

在其他实施方案中，抗体复合物结合至MHCI类、MHCII类或辅助分子，如CD40、CD54、CD80或CD86。抗体复合物也可结合至白细胞活化细胞因子，或细胞因子介体，如NF-κB。

免疫缀合物

在某些实施方案中，抗体或其片段可以与一种或多种治疗剂和/或诊断剂缀合。治疗剂不需要相同，而是可不同，例如药物和放射性同位素。举例来说，131I可并入抗体或融合蛋白质的酪氨酸中并且药物连接至赖氨酸残余物的ε氨基。治疗剂和诊断剂还可连接至例如经过还原的SH基团和/或碳水化合物侧链。用于制造治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白质的共价或非共价缀合物的许多方法在本领域中为已知的并且可利用任何这类已知方法。

治疗剂或诊断剂可以通过二硫键的形成而连接在还原抗体组分的铰链区。替代地，此类试剂可使用异双官能交联剂(如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰酯(SPDP))连接。Yu等人，Int.J.Cancer56:244(1994)。用于此类缀合的一般技术是本领域中众所周知的。参见例如，Wong,CHEMISTRYOFPROTEINCONJUGATIONANDCROSS-LINKING(CRCPress1991)；Upeslacis等,"ModificationofAntibodiesbyChemicalMethods,"MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLESANDAPPLICATIONS,Birch等人(编著)，第187-230页(Wiley-Liss公司，1995)；Price,"ProductionandCharacterizationofSyntheticPeptide-DerivedAntibodies,"MONOCLONALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION,Ritter等人(编著),第60-84页(CambridgeUniversityPress1995)。替代地，可通过抗体Fc区中的碳水化合物部分缀合治疗剂或诊断剂。碳水化合物基团可用于增加结合至硫醇基的相同试剂的负载，或碳水化合物部分可用于结合不同治疗剂或诊断剂。

经由抗体碳水化合物部分将肽缀合至抗体组分的方法是本领域技术人员熟知的。参见例如Shih等人，Int.J.Cancer41:832(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer46:1101(1990)；和Shih等人美国专利号5,057,313，其通过引用方式整体并入本文。一般方法涉及使具有氧化碳水化合物部分的抗体与具有至少一个游离胺官能的载体聚合物反应。此反应产生初始希夫碱(亚胺)键联，其可通过还原成仲胺而稳定以形成最终缀合物。

在免疫缀合物的抗体组分是抗体片段的情况下可能不存在Fc区。然而，有可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154:5919(1995)；Hansen等人，美国专利号5,443,953(1995),Leung等人，美国专利号6,254,868，这些文献均以引用方式整体并入本文。使用经过工程改造的碳水化合物部分来连接治疗剂或诊断剂。

在一些实施方案中，螯合剂可连接至抗体、抗体片段或融合蛋白质和用于螯合治疗剂或诊断剂，如放射性核素。示例性螯合剂包括但不限于DTPA(如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。缀合并使用螯合剂或其他配体来将金属连接至蛋白质的方法在本领域中是熟知的(参见，例如，美国专利号7,563,433，其实施例部分以引用方式并入本文)。

在某些实施方案中，放射性金属或顺磁性离子可通过与具有长尾部的试剂反应来连接至蛋白质或肽，该尾部可连接有多个螯合基团用于结合离子。这样的尾部可以是具有可结合螯合基团的侧基的聚合物，诸如聚赖氨酸、多糖或其他衍生化链或可衍生链，该螯合基团为，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟，和已知可用于此目的的相似基团。

螯合物可直接连接至抗体或肽，例如如美国专利4,824,659中公开，其以引用方式整体并入本文。特别有用的金属螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物，它们与总能量范围为60keV至4,000keV的诊断同位素一起用于放射成像，该同位素为诸如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br。相同的螯合物在与非放射性金属例如锰、铁和钆复合时可用于MRI。如NOTA、DOTA以及TETA的巨环螯合剂可与各种金属和放射性金属一起使用，最特别地分别与放射性核素镓、钇和铜一起使用。可通过根据目标金属调整环的大小而使此类金属螯合物复合物变得非常稳定。本发明包括其他环类型的螯合物如大环聚醚，它们对于稳定地结合核素如用于RAIT的223Ra有价值。

最近，已经公开了用于PET扫描技术中的18F-标记方法，例如通过F-18与金属或其他原子如铝反应。18F-Al缀合物可与直接连接至抗体或用于在预靶向方法中标记可靶向构建体的螯合基团，如DOTA、NOTA或NETA复合。这类F-18标记技术公开于美国专利号7,563,433中，其实施例部分以引用方式并入本文。

在特定优选实施方案中，免疫缀合物可以是抗体-药物缀合物(ADC)。用于ADC生产中的两种示例性药物是SN-38和前药形式的2-吡咯啉并阿霉素(P2PDox)。产生SN-38-缀合的ADC的组合物和方法在例如美国专利号7,999,083；8,080,250；8,741,300；8,759,496中有所公开，这些专利中每个的附图和实施例部分以引用的方式并入本文。产生P2PDoxADC的组合物和方法在例如美国专利号8,877,101中有所公开，这些专利的附图和实施例部分以引用的方式并入本文。

产生双特异性抗体的方法

在各种实施方案中，目标组合疗法可以利用一种或多种双特异性抗体(bsAb)，诸如白细胞重定向bsAb。如本文中所使用的双特异性抗体是含有针对两个不同的抗原或同一抗原上的两个不同表位的结合位点的抗体。尽仅可结合至单一抗原上的单一表位的抗体是单特异性的，不考虑抗体分子上的抗原结合位点数目。

双特异性抗体构建的早期尝试利用化学交联或杂合杂交瘤或四价体瘤以便将两种不同的抗体的两半接合在一起(例如，Staerz等人，1985,Nature314:628-31；Milstein和Cuello,Nature1983；305:537-540；Karpovsky等人，1984,JExpMed160:1686-701)。虽然这些技术用于制造bsAb，但各种产生问题使得此类复合物难以使用，诸如产生含有抗原结合位点的不同组合的混合群体、蛋白质表现方面的困难、需要纯化目标bsAb、低产率、生产费用等。

最近的方法利用经过基因工程改造的构建体，其能够产生单一bsAb的均质产物而无需彻底纯化以去除不需要的副产物。此类构建体包括串联scFv、二抗体、串联二抗体、双可变结构域抗体和使用诸如Ch1/Ck结构域或DNLTM的基元的异源二聚(Chames&Baty,2009,CurrOpinDrugDiscovDevel12:276-83；Chames&Baty,mAbs1:539-47)。

三功能单抗(Triomab)是四价体瘤方法的变化形式，与大鼠/大鼠或小鼠/小鼠四价体瘤中常见的随机配对相比，其使用小鼠IgG2a与大鼠IgG2b抗体的组合以优先产生重组抗体(Chames&Baty,mAb1:539-47)。由此技术产生的抗-CD3x抗-EpCAMbsAb(卡妥索单抗)能够有效地征募巨噬细胞和NK细胞且活化T细胞(Chames&Baty,mAbs1:539-47)。如上文所论述，欧洲已批准卡妥索单抗用于治疗EpCAM阳性癌瘤患者的恶性腹水(Chames&Baty,mAbs1:539-47)。令人惊讶的是，据报告重组bsAb在人类中仅诱导中度抗小鼠和抗大鼠反应(Chames&Baty,mAbs1:539-47)，大概至少部分是由于腹膜腔内施用于腹水的途径。厄妥索单抗是靶向HER2的另一种三功能单抗，其可用于转移性乳腺癌。Bi20是靶向CD20的另一种三功能单抗。在体外，Bi20展现来自CLL患者的B细胞的有效溶解(Chames&Baty,mAbs1:539-47)。

是指由短肽连接子接合的串联scFv(Chames&Baty,mAbs1:539-47)。布利莫单抗是抗-CD19x抗-CD3，其在极低浓度下在诸如非霍奇金氏淋巴瘤和ALL的血液学癌症中具有所报告的效力(Nagorsen等人,2009,Leukemia&Lymphoma50:886-91；Chames&Baty,mAbs1:539-47；Topp等人，2012,Blood120:5185-87；Bargou等人,2008,Science321:974-77)。对EpCAM具有特异性的另一种已经用于胃肠癌、卵巢癌、结肠直肠癌以及肺癌(Amann等人,2009,JImmunother32:452-64；Chames&Baty,mAbs1:539-47)。已经提出靶向CEACAM5的另一种(MEDI-565)用于黑素瘤、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫癌和乳腺癌(Sanders等人,1994,JPathol172:343-8)。已经报告了在皮摩尔或甚至飞摩尔浓度下展现抗肿瘤活性(Chames&Baty,mAbs1:539-47)。

除上文所论述的DARTTM技术以外，其他bsAb产生方法包括四价IgG-scFv融合(Dong等人，2011,MAbs3:273-88)；双作用Fab(DAF)抗体(Bostrom等人,2009,Science323:1610-14)；Igg样双可变结构域抗体(DVD-Ig)(Wu等人,2007,NatBiotechnol25:1290-97)；和使用IgG4分子之间的动态交换(vanderNeutKolfschoten等人,2007,Science317:1554-57)。虽然优选以下所论述的DNLTM技术用于形成白细胞重定向bsAb，但本领域技术人员应认识到，其他类型bsAb也可用于要求保护的方法和组合物中。

DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)

虽然标准DNLTM复合物包括的两个DDD连接至一个AD连接的分子的三聚体，但是复合结构的变化允许形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和其他多聚体。在一些实施方案中，DNLTM复合物可包括结合至同一抗原决定子或两个或更多个不同抗原的两个或更多个抗体、抗体片段或融合蛋白质。DNLTM复合物还可包括一种或多种其他效应因子，如蛋白质、肽、免疫调节剂、细胞因子、白介素、干扰素、结合蛋白质、肽配体、载体蛋白、毒素、核糖核酸酶如豹蛙酶(onconase)、抑制性寡核苷酸如siRNA、抗原或异种抗原、聚合物如PEG、酶、治疗剂、激素、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂或任何其他分子或聚合体。

1968年，首次从兔骨骼肌中分离出PKA，其在受到最彻底研究的由第二信使cAMP结合R亚单位而触发的信号转导途径之一中起关键作用(Walsh等人，J.Biol.Chem.1968；243:3763)。全酶的结构由两个通过R亚单位保持为非活性形式的催化亚单位组成(Taylor,J.Biol.Chem.1989；264:8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚单位(RI和RII)，并且每种类型具有α和β同种型(Scott,Pharmacol.Ther.1991；50:123)。因此，PKA调控亚单位的四个同种型是RIα、RIβ、RIIα和RIIβ，其各自包括DDD部分氨基酸序列。R亚单位仅分离为稳定二聚体并且显示二聚化结构域由RIIα的前44个氨基端残基组成(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6:222)。如下论述，其他调控亚单位的氨基酸序列的类似部分涉及二聚化和对接，其分别位于调控亚单位的N-末端附近。cAMP结合R亚单位造成用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚单位释放，该活性催化亚单位通过PKA的区室化经由其与AKAP对接而面向所选择的底物(Scott等人，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。

我们已发展出一种平台技术，其利用人PKA调控亚单位的DDD和AKAP的AD作为一对优良的连接子模块用于对接任何两个实体(在下文称为A与B)于非共价复合物，该复合物可通过在DDD与AD的至关重要的位置中引入半胱氨酸残基以促进形成二硫键而进一步锁定为DNLTM复合物。该途径的一般方法如下。通过将DDD序列连接至A的前体来构建实体A，产生下文称为a的第一组分。因为DDD序列将实现二聚体的自发形成，因此A将由a2构成。通过将AD序列连接至B的前体来构建实体B，产生下文称为b的第二组分。a2中所含的DDD的二聚基元将产生用于结合b中所含的AD序列的对接位点，由此促进a2与b容易地缔合形成由a2b构成的二元三聚复合物。此结合事件通过随后经由二硫桥共价固定两个实体的反应而加以稳定，这基于有效局部浓度的原则而非常有效地发生，因为初始的结合相互作用会使置于DDD和AD两者上的反应性硫醇基靠近(Chmura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2001；98:8480)从而位点特异性地连接。通过使用连接子、衔接子模块和前体的各种组合，可产生并使用不同化学定量关系的各种各样的DNLTM构建体(参见例如U.S.No.7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400。

通过远离两个前体的官能团连接DDD和AD，还预期所述位点特异性连接将保留两个前体的原始活性。此方法在本质上是模块化的并且可能应用于位点特异性共价连接多种物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和具有多种活性的其他效应子部分。利用构建以下实施例中所述的AD和DDD缀合效应子的融合蛋白法，实际上可将任何蛋白质或肽并入DNLTM构建体中。然而，该技术并不具限制性并且可利用其他缀合方法。

已知用于制备融合蛋白的多种方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。可通过标准分子生物学技术将该双链核酸插入用于制造融合蛋白的表达载体中(参见例如Sambrook等人，MOLECULARCLONING,ALABORATORYMANUAL，第2版,1989)。在此类优选实施方案中，AD和/或DDD部分可连接于效应蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟练技术人员将认识到，AD或DDD部分与效应子部分的连接位点可根据效应子部分的化学性质和效应子部分中参与其生理活性的部分而改变。多种效应子部分的位点特异性连接可使用本领域中已知的技术执行，如使用二价交联试剂和/或其他化学缀合技术。

Dock-and-LockTM(DNLTM)技术用于产生不同格式的多种复合物(Rossi等人，2012,BioconjugChem23:309-23)。通过将与二聚化和对接结构域(DDD)融合的经稳定的(Fab)2与含有附接于每个重链C-末端的锚定结构域(AD)的IgG组合(CH3-AD2-IgG)来构建基于维妥珠单抗(抗-CD20)和依帕珠单抗(抗-CD22)的双特异性六价抗体(bsHexAb)(Rossi等人，2009,Blood113,6161-71)。与其亲本mAb的混合物相比，这些基于Fc的bsHexAb，以下称为“Fc-bsHexAb”，诱导独特信号转导事件(Gupta等人，2010,Blood116:3258-67)，并且在体外展示有效的细胞毒性。然而，Fc-bsHexAb从小鼠循环中清除的速率比亲本mAb快大约两倍(Rossi等人，2009,Blood113,6161-71)。虽然Fc-bsHexAb离体高度稳定，但是在体内可能发生一定程度的解离，例如通过细胞内加工。此外，Fc-bsHexAb缺乏CDC活性。

AD和DDD部分中的结构功能关系

对于不同类型的DNLTM构建体，可利用不同AD或DDD序列。示例性DDD和AD序列提供于下文中。

DDD1

DDD2

AD1

AD2

熟练的技术人员将认识到，DDD1和DDD2是基于蛋白激酶A的人RIIα同种型的DDD序列。然而，在替代实施方案中，DDD和AD部分可基于蛋白激酶A的人RIα形式的DDD序列和相应的AKAP序列，如以下DDD3、DDD3C和AD3所例示。

DDD3

SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQIDNO：5)

DDD3C

MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQIDNO：6)

AD3

在其它替代实施方案中，在DNLTM复合物的构建中可利用AD和/或DDD部分的其它序列变异体。例如，人PKADDD序列仅存在四种变异体，对应于PKARIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分。RIIαDDD序列是上文公开的DDD1和DDD2的基础。四种人PKADDD序列示于下文。DDD序列代表RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。(注意DDD1的序列相对人PKARIIαDDD部分稍有改变。)

PKARIα

SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK(SEQIDNO：8)

PKARIβ

PKARIIα

PKARIIβ

已对AD和DDD结构域的结构功能关系进行了研究。(参见，例如，Burns-Hamuro等人，2005，ProteinSci14：2982-92；Carr等人，2001，JBiolChem276：17332-38；Alto等人，2003，ProcNatlAcadSciUSA100：4445-50；Hundsrucker等人，2006，Biochem.J396：297-306；Stokka等人，2006，BiochemJ400：493-99；Gold等人，2006，MolCell24：383-95；Kinderman等人，2006，MolCell24：397-408，这些文献的整个正文以引用的方式并入本文。)

例如，Kinderman等人(2006，MolCell24：397-408)检查了AD-DDD结合相互作用的晶体结构，并且得出结论：人DDD序列含有许多在二聚体形成或AKAP结合重要的保守氨基酸残基，在下面SEQIDNO：1中加下划线标出。(参见Kinderman等，2006的图1，以引用的方式并入本文)。熟练技术人员将认识到，在设计DDD序列的序列变异体时，将需要避免改变任何加下划线的残基，而对于二聚化和AKAP结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。

如以下更详细论述，已对于二十个常见L-氨基酸中的每一种表征保守氨基酸取代。因此，基于Kinderman(2006)的数据和保守氨基酸取代，基于SEQIDNO：1的潜在替代性DDD序列示于表2。在制定表2中，仅考虑高度保守氨基酸取代。举例来说，带电残基仅取代相同电荷的残基，具有较小侧链的残基经类似大小的残基取代，羟基侧链仅经其他羟基取代等。因为脯氨酸对于氨基酸次级结构具有独特的效应，因此没有其他残基取代脯氨酸。有限数目的此类潜在替代DDD部分序列示于以下SEQIDNO:12至SEQIDNO:31中。本领域技术人员将认识到DDD部分种类内的替代物质可通过标准技术来构建，例如使用市售肽合成器或熟知的定点诱变技术。氨基酸取代对于AD部分结合的效应还可通过标准结合测定容易地确定，例如，如Alto等人(2003,ProcNatlAcadSciUSA100:4445-50)中所公开。

表2.DDD1(SEQIDNO:1)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQIDNO:87。

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRNQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：24)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQNPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：25)

Alto等人(2003，ProcNatlAcadSciUSA100：4445-50)对各种AKAP蛋白的AD序列进行生物信息学分析，以设计被称为AKAP-IS的RII选择性AD序列(SEQIDNO：3)，其对DDD的结合常数为0.4nM。AKAP-IS序列被设计成AKAP与PKA结合的肽拮抗剂。AKAP-IS序列中取代倾向于使与DDD的结合减弱的残基在SEQIDNO：3中加下划线示出。熟练技术人员将认识到，在设计AD序列的序列变异体时，将需要避免改变任何加下划线的残基，而对于DDD结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。表3示出了AKAP-IS(AD1，SEQIDNO：3)序列中的潜在保守氨基酸取代，类似于以上表2中的对于DDD1(SEQIDNO：1)所示的氨基酸取代。

有限数目的此类潜在替代性AD部分序列示于以下SEQIDNO：32至SEQIDNO：49中。另外，基于Alto等人(2003)的数据，可能的AD部分序列种类内的其他物质可由熟练技术人员制备、测试并使用。应注意Alto(2003)的图2示出了可基于实际结合实验在保留对DDD部分的结合活性的同时进行的多个氨基酸取代，。

AKAP-IS

表3.AD1(SEQIDNO：3)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQIDNO：88。

QIEYLAKQIVDNAINQA(SEQIDNO：45)

QIEYLAKQIVDNAIQNA(SEQIDNO：46)

Gold等人(2006，MolCell24：383-95)利用结晶学和肽筛选开发SuperAKAP-IS序列(SEQIDNO：50)，其对PKA的RII同种型表现出与RI同种型相比高5个数量级的选择性。加下划线的残基指示相对于AKAP-IS序列的氨基酸取代位置，该氨基酸取代增强与RIIα的DDD部分的结合。在此序列中，N-末端Q残基编号为第4号残基并且C-末端A残基为第20号残基。可进行取代以影响对RIIα的亲和性的残基是残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等人，2006)。预期在某些替代实施方案中，可用SuperAKAP-IS序列取代AKAP-ISAD部分序列来制备DNLTM构建体。可用来取代AKAP-ISAD序列的其他替代序列示于SEQIDNO：51-53中。相对于AKAP-IS序列的取代以下划线出示。预期如同SEQIDNO：4中所示的AD2序列，AD部分还可包括额外N-末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C-末端残基甘氨酸和半胱氨酸。

SuperAKAP-IS

QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQIDNO：50)

替代性AKAP序列

QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO：51)

QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO：52)

QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO：53)

Gold等人的图2公开了来自以下所示的各种AKAP蛋白质的额外DDD结合序列。

RII-特异性AKAP

AKAP-KL

AKAP79

LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQIDNO：55)

AKAP-Lbc

LIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQIDNO：56)

RI-特异性AKAP

AKAPce

alyqfadrfselviseal(SEQIDNO:57)

riad

leqvanqladqiikeat(SEQIDNO:58)

pv38

feelawkiakmiwsdvf(SEQIDNO:59)

双特异性AKAP

akap7

elvrlskrlvenavlkav(SEQIDNO:60)

map2d

taeevsarivqwtaeav(SEQIDNO:61)

dakap1

qikqaafqlisqvileat(SEQIDNO:62)

Dakap2

lawkiakmivsdvmqq(SEQIDNO:63)

Stokka等人(2006,BiochemJ400:493-99)也开发了AKAP结合PKA的肽竞争剂，其示于SEQIDNO:64-66中。肽拮抗剂命名为Ht31(SEQIDNO:64)、RIAD(SEQIDNO:65)和PV-38(SEQIDNO:66)。Ht-31肽对PKA的RII同种型显示较高亲和力，而RIAD和PV-38对RI显示较高亲和力。

Ht31

DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQIDNO:64)

RIAD

LEQYANQLADQIIKEATE(SEQIDNO:65)

PV-38

表4.AKAP肽序列

肽序列

在下文通过参考AKAPIS序列(SEQIDNO：35)以下划线显示在不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基。残基与Alto等人(2003)所观察的相同，其中添加C-末端丙氨酸残基。(参见Hundsrucker等人(2006)的图4，其以引用方式并入本文。)对RIIDDD序列有特别高的亲和力的肽拮抗剂的序列为AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的那些序列。

Carr等人(2001，JBiolChem276：17332-38)检查了来自人和非人蛋白质的不同AKAP结合DDD序列之间的序列同源性程度，并且鉴别出DDD序列中似乎在不同DDD部分中最高度保守的残基。这些残基在下文通过参考SEQIDNO：1的人PKARIIαDDD序列以下划线示出。特别保守的残基进一步以斜体表示。残基与Kinderman等人(2006)提出的对于结合AKAP蛋白质至关重要的那些残基重叠但是不相同。熟练的技术人员将认识到，在设计DDD的序列变异体时，最优选的是避免改变最保守的残基(斜体)，并且优选还避免改变保守残基(加下划线)，而既未加下划线也不是斜体的残基可考虑进行保守氨基酸取代。

基于Carr等人(2001)的数据，DDD1(SEQIDNO：1)序列的一组修饰的保守氨基酸取代示于表5中。即使在这一组经取代序列有所减少的情况下，本领域技术人员也在不进行过度实验的情况下产生、测试并使用了超过65,000个可能的替代性DDD部分序列。熟练技术人员可容易获得此类替代DDD氨基酸序列，如以上公开于表2和表3。

表5.DDD1(SEQIDNO：1)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQIDNO：89。

熟练技术人员将认识到使用本领域中标准的技术以及仅常规的实验，DDD或AD氨基酸序列中的这些和其他氨基酸取代可用于产生AD或DDD部分种类内的替代物质。

氨基酸取代

在替代实施方案中，所公开的方法和组合物可涉及产生和使用具有一个或多个取代氨基酸残基的蛋白质或肽。举例来说，用于制备DNLTM构建体的DDD和/或AD序列可如以上论述来修饰。

熟练技术人员应意识到，一般来说，氨基酸取代典型地涉及将氨基酸置换为具有相对类似性质的另一种氨基酸(即，保守氨基酸取代)。各种氨基酸的性质和氨基酸取代对于蛋白质结构和功能的效应是在本领域中的广泛研究和知识的主题。

举例来说，可考虑氨基酸的亲水指数(Kyte&Doolittle,1982,J.Mol.Biol.,157:105-132)。氨基酸的相对亲水性质有助于蛋白质的次级结构合成，进而限定蛋白质与其他分子的相互作用。已经基于其疏水性和电荷特性来指定每一种氨基酸的亲水性指数(Kyte&Doolittle,1982)，它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。在进行保守取代中，使用其亲水性指数在±2内的氨基酸是优选的，在±1内是更优选的，并且在±0.5内甚至是更优选的。

氨基酸取代还可考虑到氨基酸残基的亲水性(例如，美国专利号4,554,101)。已指定这些氨基酸残基的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)以及色氨酸(-3.4)。将氨基酸置换为具有类似亲水性的其他氨基酸是优选的。

其他考虑因素包括氨基酸侧链的大小。举例来说，用紧凑侧链(如甘氨酸或丝氨酸)、用具有庞大侧链的氨基酸(例如，色氨酸或酪氨酸)来置换氨基酸总体上并非优选的。还考虑了各种氨基酸残基对于蛋白质次级结构的效应。通过实验研究，已经确定不同的氨基酸残基对于蛋白质结构域采用α-螺旋、β-薄片或反转次级结构的倾向性的效应并且在本领域中是已知的(参见，例如，Chou&Fasman,1974,Biochemistry,13:222-245；1978,Ann.Rev.Biochem.,47:251-276；1979,Biophys.J.,26:367-384)。

基于此类考虑因素和广泛实验研究，已经构建了保守氨基酸取代的表格且在本领域中是已知的。举例来说：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。替代地:Ala(A)leu、ile、val；Arg(R)gin、asn、lys；Asn(N)his、asp、lys、arg、gin；Asp(D)asn、glu；Cys(C)ala、ser；Gin(Q)glu、asn；Glu(E)gin、asp；Gly(G)ala；His(H)asn、gin、lys、arg；Ile(I)val、met、ala、phe、leu；Leu(L)val、met、ala、phe、ile；Lys(K)gin、asn、arg；Met(M)phe、ile、leu；Phe(F)leu、val、ile、ala、tyr；Pro(P)ala；Ser(S)、thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe、tyr；Tyr(Y)trp、phe、thr、ser；Val(V)ile、leu、met、phe、ala。

氨基酸取代的其他考虑因素包括是否残基位于蛋白质内部或是暴露于溶剂。对于内部残基，保守取代包括：Asp和Asn；Ser和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu；Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp。(参见，例如PROWL网站rockefeller.edu)对于溶剂暴露残基，保守取代包括：Asp和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同上)已经构建了有助于选择氨基酸取代的各种矩阵，如PAM250评分矩阵、Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、McLachlan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff矩阵、Miyata矩阵、Fitch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵和Risler矩阵(同上)。

在确定氨基酸取代中，还可考虑分子间或分子内键的存在，如形成带正电荷的残基(例如，His、Arg、Lys)与带负电荷的残基(例如，Asp、Glu)之间的离子键(盐桥)或相邻半胱氨酸残基之间的二硫键。

将任何氨基酸取代为所编码的蛋白质序列中的任何其他氨基酸的方法对于熟练技术人员是熟知的并且实际上是常规实验，例如通过定点诱变技术或合成并组装编码氨基酸取代的寡核苷酸并且剪接至表达载体构建体中。

治疗剂

在替代实施方案中，可使用治疗剂如细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前药、毒素、酶或其他药剂，其与目标bsAb、ADC和/或抗体缀合，或在bsAb、ADC和/或抗体之前、同时或之后个别地施用。所使用的药物可具有选自由以下组成的组的药学性质：抗有丝分裂剂、抗激酶剂、烷基化剂、抗代谢物剂、抗生素、生物碱、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂和其组合。

所使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)(例如豹蛙酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。

有用的趋化因子包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β以及IP-10。

治疗剂可以包括光活性剂或染料。荧光组合物(如荧光染料)和其他色原体或染料(如对可见光敏感的卟啉)已经通过将适合的光引导至损伤而用来检测并治疗损伤。在治疗中，这已经被称为光辐射、光照疗法或光动力学疗法。参见Jori等人(编),PHOTODYNAMICTHERAPYOFTUMORSANDOTHERDISEASES(LibreriaProgetto1985)；vandenBergh,Chem.Britain(1986),22:430。此外，已经将单克隆抗体与光活化的染料偶联用于实现光照疗法。参见Mew等人，J.Immunol.(1983),130:1473；同上CancerRes.(1985),45:4380；Oseroff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986),83:8744；同上Photochem.Photobiol.(1987),46:83；Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res.(1989),288:471；Tatsuta等人，LasersSurg.Med.(1989),9:422；Pelegrin等人，Cancer(1991),67:2529。

其他适用治疗剂可包括寡核苷酸，尤其优选地针对致癌基因和致癌基因产物如bcl-2或p53的反义寡核苷酸。治疗性寡核苷酸的优选形式是siRNA。熟练技术人员将认识到任何siRNA或干扰RNA种类可以连接至抗体或其片段用于递送至靶向组织。针对多种靶标的许多siRNA物质在本领域中是已知的，并且在所要求保护的方法和组合物中可利用任何所述已知siRNA。

治疗性治疗的方法

各种实施方案涉及治疗受试者，诸如哺乳动物，包括人、驯养或伴侣宠物，诸如犬和猫的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的细胞毒性剂和/或免疫调节剂的组合。

组合疗法可进一步补充以同时或依序施用至少一种其他治疗剂。例如，“CVB”(1.5g/m2环磷酰胺、200mg/m2-400mg/m2依托泊苷和150mg/m2-200mg/m2亚硝脲氮芥)是用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的方案。Patti等人，Eur.J.Haematol.51:18(1993)。其他合适的组合化疗方案是本领域技术人员熟知的。参见例如Freedman等人，“Non-Hodgkin'sLymphomas,”CANCERMEDICINE,第2卷,第3版,Holland等人(编),第2028-2068版(Lea&Febiger1993)。作为例子，用于治疗中度非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和泼尼松)和CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)。适用第二代化学治疗方案为m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰四氢叶酸)，而适合第三代方案为MACOP-B(甲氨蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。其他适用药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀和苔藓抑素-1。

治疗剂组合可根据已知方法进行配制以制备药学上可用的组合物，由此将bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制剂抗体与药学上合适的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一个实例。其他合适赋形剂是本领域技术人员熟知的。参见例如Ansel等人，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS,第5版(Lea&Febiger1990)和Gennaro(编),REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES,第18版(MackPublishingCompany1990)和其修订版。

更一般来说，bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制剂抗体对于人的施用剂量将根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学病状和以往病史等因素而变化。可能需要为接受者提供在约1mg/kg至25mg/kg范围内的作为单次静脉输注的bsAb、ADC和/或抗体的剂量，但如情况需要也可以施用较低或较高的剂量。例如，对于70kg患者，1mg/kg-20mg/kg的剂量为70mg-1,400mg，或对于1.7-m患者，为41mg/m2-824mg/m2。需要时剂量可重复，例如每周一次持续4-10周，每周一次持续8周，或每周一次持续4周。在维持疗法中，需要时其还可以较低频率给予，如每隔一周一次持续若干个月，或每月或每季度一次持续许多个月。

本领域普通技术人员应认识到，尽管上文所论述的给药计划表是关于ADC、bsAb和/或mAb，但干扰素药剂应以实质上较低的剂量施用以避免系统毒性。干扰素(诸如PEGINTERFERON)用于人类的剂量更典型地在微克范围内，例如可以使用180μg皮下注射，每周一次，或100μg至180μg，或135μg，或135μg/1.73m2，或90μg/1.73m2，或250μg皮下注射，每隔一天一次，视干扰素类型而定。

尽管bsAb、干扰素、ADC和/或检查点抑制剂抗体可以周期性推注形式施用，但在另选的实施方案中，bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制剂抗体可以通过连续输注来施用。为了增加Cmax并且延伸治疗剂在血液中的PK，连续输注可例如通过留置导管来施用。这类设备在本领域中为已知的，如或导管(参见，例如，Skolnik等人，TherDrugMonit32:741-48,2010)并且可使用任何这类已知留置导管。各种连续输注泵在本领域中也是已知的并且可使用任何这类已知输注泵。连续输注的剂量范围可在0.1与3.0mg/kg/天之间。更优选地，bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制剂抗体可通过在2至5小时，更优选地2-3小时的相对较短周期内静脉内输注来施用。

在优选的实施方案中，药剂的组合对癌症的治疗是有用的。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病、骨髓瘤或淋巴恶性疾病。此类癌症的更特定实例如下所述并且包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、尤因氏肉瘤、韦尔姆斯氏肿瘤、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌瘤、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺分化癌、乳癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、阴门癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如细胞未迁移至受试者体内原始恶性疾病或肿瘤部位以外的部位的肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移产生的肿瘤，转移为恶性细胞或肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的次级部位)。有益于本发明的治疗方法的癌症涉及表达、过表达或异常表达IGF-1R的细胞。

本文描述和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶变前病状以及用于预防发展成赘生性或恶性状态，包括但不限于上文所述的那些病症。指示此类用途在已知的或怀疑先前进展至瘤形成或癌症的病状中，具体来说，其中非瘤性细胞生长由过度增生、化生组成，或最具体来说，出现发育异常(针对此类异常生长病状的综述，参见Robbins和Angell,BASICPATHOLOGY.第2版,W.B.SaundersCo.,Philadelphia,第68-79页(1976))。

可治疗的其他赘生前病症包括但不限于良性异常增生性病症(例如良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉或腺瘤以及食道异常增生)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病、农夫皮肤(Farmer'sSkin)、日光性唇炎和日光性角化病。

在优选实施方案中，使用本发明的方法抑制癌症，特别是上文所列癌症的生长、发展和/或转移。

表达载体

其他实施方案可涉及包括编码抗体、抗体片段、细胞因子或如DNLTM构建体的bsAb组成融合蛋白质的核酸的DNA序列。融合蛋白质可包括连接至例如AD或DDD部分的抗体或片段或细胞因子。

各种实施方案涉及包括编码DNA序列的表达载体。载体可含有编码人免疫球蛋白的轻链和重链恒定区和铰链区的序列，其可连接嵌合、人源化或人可变区序列。载体可另外含有在选定宿主细胞中表达所编码的蛋白质的启动子、增强子和信号或前导序列。尤其适用的载体是pdHL2或GS。更优选地，轻链和重链恒定区和铰链区可来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任选地同种异型位置中的至少一个氨基酸更换成在不同IgG1同种异型中发现的氨基酸，并且其中任选地基于EU编号系统的EU的重链的氨基酸253可置换成丙氨酸。参见Edelman等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA63:78-85(1969)。在其他实施方案中，IgG1序列可转化成IgG4序列。

本领域技术人员将认识到基因工程化表达构建体并且插入宿主细胞中以表达工程化蛋白质的方法在本领域中是熟知的并且只需常规实验。宿主细胞和表达克隆抗体或片段的方法描述于例如美国专利号7,531,327、7,537,930、7,785,880、8,076,410、8,153,433和8,372,603中，其实施例部分各自以引用方式并入本文。

试剂盒

各种实施方案可涉及含有适于治疗或诊断患者的患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可以含有如本文中所描述的一种或多种bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制剂抗体。如果含有用于施用的组分的组合物未配制成通过消化道递送，如通过口服递送，那么可包括能够通过一些其他途径递送试剂盒组分的装置。用于如肠胃外递送等应用的一种类型装置是注射器，其用于将组合物注射至受试者体内。还可使用吸入装置。在某些实施方案中，治疗剂可以含有无菌、液体制剂或冻干制剂的预充式注射器或自动注射笔形式提供。

试剂盒组分可包装于一起或分隔于两个或多个容器中。在一些实施方案中，容器可为容纳适于复原的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。试剂盒还可含有一种或多种适于复原和/或稀释其他试剂的缓冲液。可使用的其他容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可无菌包装和保持于容器中。可以包括的另一种组件是提供给试剂盒使用者的说明书。

实施例

提供以下实施例来说明，但是不限制本发明的权利要求书。

实施例1.T-细胞重定向双特异性抗体DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物

一些种类的示例性白细胞重定向双特异性抗体制备为DNLTM复合物，如下所述。该复合物有效诱导针对适当靶细胞的免疫应答，该靶细胞包括但不限于Trop-2+癌细胞。

材料和方法

用于制备并使用DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物的一般技术描述于以下实施例中。具有CD3和CD19的结合位点的示例性白细胞重定向双特异性抗体制备为DNLTM复合物，其被称为(19)-3s(图1)。通过在Fd链的羧基末端的二聚化和对接结构域(DDD2)的重组融合来构建抗-CD19F(ab)2DNL模块。在添加锚定结构域(AD2)的情况下从Okt3mAb来设计抗-CD3-scFv模块，并且以格式VH-L1-VK-L2-6H-L3-AD2(公开为SEQIDNO：105的“6H”)组装，其中经由柔性肽连接子来融合V结构域并且AD2肽前面是6-His连接子(SEQIDNO：105)。抗-CD3可变区、连接子和AD2的序列如以下所示。

抗-CD3scFv的VH序列

L1连接子

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO：97)

抗-CD3scFv的VK序列

L2连接子

GGGGS(SEQIDNO：99)

聚-His-L3连接子

HHHHHHGGGSG(SEQIDNO：100)

在含有0.2μM甲氨喋呤(MTX)的培养基中选择克隆并且通过ELISA筛选蛋白质表达。将Okt3scFv-AD2捕获于Ni-NTAHisSorb板(Qiagen)上并且用抗-AD2mAb检测。用山羊-抗人-κ链捕获CH1-DDD2-Fab模块并且用山羊-抗人-F(ab’)2-HRP检测。通过逐步地增加MTX浓度直到3μM来扩增蛋白质表达的生产力。通过亲和色谱法，分别使用和κ-选择树脂将Okt3scFv-AD2和CH1-DDD2-Fab模块从滚瓶培养物的肉汤中纯化至均质。使用DNLTM方法经由摩尔当量Okt3scFv-AD2和CH1-DDD2-Fab模块的位点特异性缀合来组装(X)-3sbsAb。举例来说，通过将22mgOkt3scFv-AD2与80mgCH1-DDD2-Fab-hA19组合来产生大约100mg(19)-3s。在室温下用1mM还原型谷胱甘肽将混合物还原过夜，然后添加2mM氧化谷胱甘肽。通过使用κ-选择和的连续亲和色谱法从反应混合物中纯化(19)-3s。遵循类似方法，以不同规模来组装额外的(X)-3s构建体。

表6.(X)-3sDNLTM构建体

细胞系和试剂-Raji、Ramos、Daudi、LS174T和Capan-1细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,MD)并且Nalm-6细胞购自DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellinien(DSMZ,Braunchweig,Germany)。除了Capan-1以外，所有细胞系保持于含有10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素和1％MEM非必需氨基酸的RPMI-1640中。用20％FBS来保持Capan-1细胞。所有细胞培养基和补充物购自LifeTechnologies(Carlsbad,CA)。

PBMC和T细胞分离-使用UNI-SEPMAXI试管(Novamed,Ltd,Jerusalem,Israel)从供体全血(NJ血站,EastOrange,NJ)纯化人外周血单核细胞(PBMC)。根据制造商方案，通过使用PanT细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec,Auburn,CA)进行阴性选择而从PBMC中分离CD3-阳性T细胞。在用抗-CD3-PE抗体将经过富集的T细胞染色之后，通过FACS评估T细胞分离效率。在一些情况下，还用CD-19和CD-14进行进一步染色来识别污染细胞。

T细胞活化-将分离的T细胞以2.25x106个细胞/孔的最终密度涂覆于6-孔组织培养板中。将Daudi细胞以1.5x106个细胞/孔的最终密度添加至一些孔，其他孔保持只含有T细胞。替代地，将PBMC以6x106个细胞/孔的最终细胞密度添加至6-孔组织培养板。使每个孔的体积达到3mL。向适当的孔中添加3ng/mL的(19)-3s、(M1)-3s或(19)-DDD2。在37℃下孵育过夜之后，移除1mL的每个样品。将细胞球团化并且在冰上用CD69-APC和CD3-PE标记20分钟。用含1％BSA的PBS将细胞洗涤2次并且使用FACSCALIBERTM流式细胞仪(BDBiosciences,SanJose,CA)进行分析。

T细胞增殖-将PBMC以1x106个细胞/毫升的浓度播种于含有指定试剂的T25烧瓶中。对于B细胞耗竭的烧瓶，根据制造商方案通过使用得自Miltenyi的B细胞分离试剂盒进行阴性选择来移除B细胞。在选择当天，从每个烧瓶中取出100μL培养基，在冰上用抗-CD7-APC标记20分钟，洗涤一次并且再悬浮于含有7-AAD的300μL1％BSA/PBS中。对于每个样品，使用FACSCALIBERTM流式细胞仪来分析总体积。每个样品重复计数两次。使用FlowJo软件来进行分析。对于每个样品，去除死亡(7-AAD+)细胞和残骸(基于前向相比于侧向分散)。最后，选择活的CD7+细胞并且使用Prism软件来作图。

细胞结合测定(Jurkat/Capan-1)-根据制造商方案用PKH26红色荧光细胞连接子试剂盒(Sigma)来将Jurkat细胞染色。根据制造商方案用5μMCFSE(羧基荧光素双醋酸酯琥珀酰亚胺基酯，LifeTechnologies)来将Capan-1细胞染色。将经过标记的Capan-1细胞添加至8-孔腔室载玻片(ThermoWaltham,MA)并且允许连接过夜。第二天，取出培养基并且加入处于含有0.1μg/mL(E1)-3s、(M1)-3s或(19)-3s的培养基中的经PKH26-标记的Jurkat细胞。在37℃下孵育1小时之后，用PBS洗涤载玻片以移除任何未结合细胞并且通过荧光显微术来观察。

细胞结合测定(Jurkat/Daudi)-Jurkat和Daudi细胞分别用抗-CD3-PE和抗-CD20-FITC来标记。然后，在室温下，经过标记的细胞以2.5:1比率与0.1μg/mL(19)-3s共孵育30分钟。然后，等分试样的细胞通过荧光显微术来观察。

细胞毒性测定(血液肿瘤细胞系)-根据制造商方案用PKH67绿色荧光细胞连接子试剂盒(Sigma)来标记靶细胞。简言之，使5x106个靶细胞再悬浮于250μL稀释剂C中。在第二试管中，将1μLPKH26染料添加至250μL稀释剂C。然后，将细胞悬浮液添加至染料溶液，充分地混合并且在室温下孵育2分钟。通过添加相等体积FBS来淬灭反应物。然后，用完整RPMI将经过标记的细胞洗涤3次。在未刺激的情况下，使用经分离的T细胞作为效应细胞。将效应细胞和PKH67标记的靶细胞以10:1比率组合并且涂覆于含有(19)-3s或(14)-3s的连续稀释液的48孔板中。每个孔含有5x104个靶细胞和5x105个效应细胞。在20％RPMI中进行Jeko-1测定。在含有5％CO2的37℃孵育箱中将板孵育18-24小时。在孵育之后，将所有细胞从48孔板中移入流式细胞仪管中并且再悬浮于含有1ug/mL7AAD(以区分活细胞与死细胞)和30,000个COUNTBRIGHTTM绝对计数珠粒(LifeTechnologies)的1％BSA/PBS中。在FACSCALIBERTM流式细胞仪上分析细胞。对于每个样品，8,000个COUNTBRIGHTTM珠粒计数作为标准化参考。使用FlowJo软件(Treestar,Inc.,Ashland,OR)来分析数据。对于每个样品，将死细胞和残骸排除并且对总活靶细胞计数。

细胞毒性测定(实体肿瘤细胞系)-遵循与用PKH23染色相同的程序，用PKH67绿色荧光细胞连接子试剂盒(Sigma)来标记靶细胞。所使用的效应细胞如下：对于Capan-1测定，使用从CD8+富集柱(R&DSystems,Minneapolis,MN)纯化之后的CD8+富集T细胞。对于LS174T细胞：使用在含有25U/mLIL-2和50ng/mLOkt3Mab的培养基将PBMC孵育5天之后，随后在含有单独25U/mLIL-2的培养基中孵育2天的经过刺激的T细胞。将效应细胞和经PKH67-标记的靶细胞以3:1比率组合(5x104个靶细胞和1.5x105个效应细胞/孔)并且涂覆于含有(E1)-3s、(14)-3s或(19)-3s的连续稀释液的48孔板上。在20％RPMI中进行Capan-1测定。在含有5％CO2的37℃孵育箱中将板孵育42-48小时。孵育之后，将悬浮细胞与来自所有孔的经胰酶消化的连接细胞组合并且转移至流式细胞仪管。将细胞洗涤一次并且再悬浮于含有1ug/mL7AAD(以区分活细胞与死细胞)和30,000个COUNTBRIGHTTM绝对计数珠粒的1％BSA/PBS中。在FACSCALIBERTM流式细胞仪上分析细胞。对于每个样品，8,000个COUNTBRIGHTTM珠粒计数为标准化参考。使用FlowJo软件(Treestar,Inc.,Ashland,OR)来分析数据。对于每个样品，将死细胞和残骸排除并且将总活靶细胞计数。

结果

由(19)-3s介导的Daudi伯基特淋巴瘤与T细胞之间的免疫突触形成。检查白细胞重定向(19)-3sDNLTM复合物对效应子T细胞靶向CD19+淋巴瘤细胞的效应(图2)。将新鲜分离的T细胞以2.5:1的E:T比率与Daudi细胞组合。在室温下用0、1μg/mL或5μg/mL的(19)-3sDNLTM复合物处理细胞30分钟，然后通过流式细胞术分析。分别使用抗-CD20-FITC和抗-CD7-APC来识别Daudi和T细胞。共结合指示为CD20+/CD7+事件的％。用(19)-3s处理之后，45.5％流动事件是CD20/CD7双阳性的，表明Daudi与T细胞形成突触(图2A)，与对不含抗体的混合细胞所测量的2％(图2B)形成对比。添加(19)-3s导致>90％的Daudi与T细胞缔合(图2C)。这些结果表明(19)-3sDNLTM复合物可有效地将T细胞引导至表达目标抗原的淋巴瘤细胞。

通过荧光显微术来证明T细胞与靶淋巴瘤细胞之间的突触形成(图3)。将Jurkat(T细胞)和Daudi(B细胞)以1:1比率组合，用0.1μg/mL(19)-3sDNLTM复合物处理30分钟并且用抗-CD20-FITC(图3A)和抗-CD3-PE(图3B)染色，然后通过荧光显微术来分析。合并的图像(图3C)显示经绿色染色Daudi与经红色染色Jurkat细胞之间的突触形成。在不存在(19)-3s的情况下突触形成不明显(图3D)。图3C显示靶淋巴瘤细胞与目标T细胞直接接触。

对于(19)-3s介导的T细胞与示例性B-细胞淋巴瘤细胞系的缔合，进行剂量反应系列(图4)。如图4中所示，在此实验的条件下，(19)-3s-介导的T细胞与靶细胞的细胞至细胞缔合在0.037与0.111μg/ml之间的DNLTM复合物浓度下达到饱和。

图5示出了(图5A)、DARTTM(图5A)和DNLTM(图5B)抗-CD3x抗-CD19复合物将T细胞重定向至目标CD19+B细胞的相对效力的对比。和DARTTM的数据从Moore等人(2011,Blood117:4542-51)获得。在0.0005μg/ml最低测试浓度下，(19)-3sDNLTM复合物比或DARTTM更有效地将T细胞靶向B-细胞淋巴瘤(图5)。与相当的和DARTTM复合物相比，(19)-3sDNLTM复合物也诱导稍微较高最大水平的细胞与细胞缔合(图5A)。虽然难以从对于(19)-3sDNLTM复合物产生的单个数据点来推断，DARTTM和DNLTM的EC50水平似乎是相似的(图5)。

(19)-3s、(E1)-3s和(M1)-3s介导的T细胞与靶肿瘤细胞的细胞-细胞缔合。为了评估T-细胞重定向BsAb促进T细胞与其靶肿瘤细胞缔合的能力，将JurkatT细胞与含有(X)-3s的靶肿瘤细胞共孵育并且通过流式细胞术和荧光显微术来评估。JurkatT细胞是CD4+T细胞白血病细胞系，针对其在各种浓度的(19)-3s的存在下显示T细胞结合而不耗竭FITC标记Daudi细胞的能力来选择并且通过流式细胞术分析，以检测指示T细胞-B细胞缔合复合物的双阳性(CD3+CD20+)群体。在用0.5ng/mL(19)-3s处理之后，可见明显表观细胞-细胞缔合，并且用0.1μg/mL处理之后，超过25％的细胞群体存在于细胞-细胞缔合中(图5)。荧光显微术支持此数据，因为在用0.1μg/mL(19)-3s处理之后，免疫突触是明显的(图4)。在不存在(19)-3s的情况下，未见突触形成(数据未示出)。

在胰腺肿瘤细胞系Capan-1中也观察到了此细胞-细胞缔合(图6)。Capan-1表达高水平的TROP2和中度水平的MUC5AC。因此，将TROP2-靶向bsAb(E1)-3s(图6C)，和MUC5AC靶向bsAb(M1)-3s(图6B)与非靶向对照bsAb(19)-3s(图6A)相比较。在这些bsAb存在下将经CFSE标记的Capan-1细胞与经PKH26标记的Jurkat共孵育。如预期，荧光显微术显示由(E1)-3s介导的较大T-细胞/Capan复合物，随后为由(M1)-3s介导的较小但大量的复合物，以及(19)-3s处理之后的相对较低的复合物形成(图6)。

(19)-3s特异性诱导T细胞活化和增殖。在PBMC中(图7A)，或在与DaudiB细胞共孵育的T细胞中(图7B)，通过测量CD69(一种T细胞活化的早期标记物)的表达水平来评估(19)-3s活化T细胞的能力。用3ng/mL(19)-3s处理在与DaudiB细胞共孵育的T细胞中诱导T细胞活化，如与非靶向对照抗体(19)-DDD2和(M1)-3s，以及在没有Daudi靶细胞的情况下用(19)-3s处理的T细胞相比较，CD69表达增加>50倍所指示(图7B)。在抗体与含有T和B细胞的PBMC一起孵育时，观察到相似结果；(19)-3s刺激CD69表达水平比非靶向对照高>20倍(图7A)。在不存在靶细胞的情况下，用(19)-3s处理的纯化T细胞不显示活化(图7C)。

在用各种CD3-靶向抗体处理PBMC之后评估T细胞增殖作为T细胞活化的另一个指示。(19)-3s在3nM或30pM下诱导的T细胞增殖类似于阳性对照IL-2/PHA(图8A)。非靶向对照抗体(14)-3s在最高(3nM)浓度下显示一些非特异性T细胞增殖(图8A)。然而，在耗竭B细胞的PBMC中未观察到T细胞增殖(图8B)，表明靶细胞是特异性(19)-3s诱导的T细胞增殖必不可少的。

(X)-3s重定向的T-细胞介导的杀灭恶性肿瘤细胞系。每个白细胞靶向分子的细胞毒性通过其介导特异性肿瘤靶细胞的溶解的能力来评估。对于血液肿瘤细胞系，在18-24小时测定中，使用未刺激、富集T细胞群体作为效应细胞的10:1E:T比率显示最佳测定条件。CD19靶向bsAb(19)-3s诱导相对较低CD19表达的细胞系Ramos(IC50＝0.17pM，溶解最大＝79％)、Daudi(IC50＝1pM，溶解最大＝60％)和Nalm6(IC50＝6pM，溶解最大＝93％)的最有效特异性杀灭(图9A)。有意思的是，高CD19表达细胞系Namalwa(IC50＝63pM，溶解最大＝60％)和Raji(IC50＝3nM，溶解最大＝41％)对于(19)-3s的敏感性最小(图9A)。非靶向(14)-3sDNLTM构建体在所测试的任何细胞系中具有极小的细胞毒性效应(图9B)。通过从两个不同供体获得的PBMC来获得(19)-3s构建体对于Nalm-6ALL细胞系的一致细胞毒性效应(图9C)。

在多个细胞系中测定(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性效应(图10)。CD22靶向bsAb(22)-3s在CD22阳性Daudi细胞系中显示有效的(IC50＝5pM，溶解最大＝60％)特异性T-细胞介导的溶解(图10C)，但是在CD22阴性Namalwa细胞中不显示(图10A)。

与较低CD20-表达Namalwa细胞系(IC50＝30pM，溶解最大＝53％)(图10A)相比，CD20-靶向bsAb(20)-3s在较高表达CD20细胞系Daudi(IC50＝<0.3pM，溶解最大＝90％)(图10C)和Jeko(IC50＝1pM溶解最大＝90％)中显示最高效力(图10B)形成比较。

在表达HLA-DR的Jeko-1细胞系(IC50＝20pM，溶解最大＝88％)中进行测试HLA-DR-靶向bsAb(C2)-3s(图10B)。

在10:1的E:T比率下，使用分离的T细胞作为效应细胞，bsAb在各种B细胞恶性肿瘤中诱导有效T细胞介导的细胞毒性，包括伯基特淋巴瘤(Daudi,Ramos,Namalwa)、套细胞淋巴瘤(Jeko-1)和急性淋巴细胞性白血病(Nalm-6)(表7)。非肿瘤结合对照(14)-3s在>10nM下仅诱导中度T-细胞杀灭。抗原/表位的性质(尤其是其尺寸和与细胞表面的接近程度)对于T-细胞重新靶向的效力似乎比抗原密度更重要(表7)。可能(20)-3s始终比(19)-3s和(C2)-3s更有效，即使在CD19或HLA-DR的表达大大高于CD20时也是如此，如分别对于Namalwa和Jeko-1所发现(表7)。这可能是因为CD20表位包括紧密接近细胞表面的较小细胞外环。当使用Daudi直接比较时，(22)-3s具有最低有效性。与CD19和CD20相比，以最低密度表达的CD22是快速内在化抗原，并且其表位更远离细胞表面。这些因素中的每一个都可造成其效力下降。最后，对T-细胞重新靶向杀灭的敏感性具有细胞系依赖性，如使用(19)-3s所观察到，其中Raji(IC50>3nM)很大程度上无反应的，然而Ramos(IC50＝2pM)是高敏感性的，虽然前者表达较高CD19抗原密度(表7)。

表7.体外重定向的T-细胞灭杀

1BL，伯基特淋巴瘤；ALL，急性淋巴细胞性白血病；MCL，套细胞淋巴瘤。

2通过流式细胞术测定表达水平且相对于Daudi的表达水平进行标准化。3IC50，实现50％靶细胞杀灭的皮摩尔浓度。

白细胞重定向bsAb的体外细胞毒性效应也在实体肿瘤细胞中确定(图11)。对于实体肿瘤细胞系，最佳测定条件确定为在42–48小时测定中使用经过刺激的T细胞的3:1E:T比率。每个bsAb诱导肿瘤靶细胞的特异性T-细胞介导的溶解。在用(14)-3s处理之后，表达CEACAM5的人结肠腺癌细胞系LS-174T显示有效特异性溶解(IC50＝2pM)(图11A)。(E1)-3s介导了表达Capan-1人胰腺癌细胞系的TROP2的有效特异性溶解(IC50＝29pM)(图11B)。表达高水平的CEACAM6和TROP2的胃癌细胞系NCI-N87对T-细胞靶向分子(15)-3s和(E1)-3s显示非常有效的特异性溶解(分别IC50＝3pM和0.85pM)(图11C)。对于Capan-1和LS174T，非靶向对照抗体(19)-3s在>1nM的浓度下诱导较低(<20％)非特异性溶解，并且在NCI-N87细胞中诱导中度(约40％)非特异性溶解(图11A-C)。各种白细胞重定向bsAb在各种肿瘤细胞系中的体外细胞毒性数据的汇总示于图12。各种构建体显示目标肿瘤细胞的最大细胞溶解高达90％或更大，其中表达目标抗体的细胞系的IC50值一般在较低皮摩尔范围内(图12)。

实施例2.白细胞重定向DNLTM复合物的体内研究

开始随访研究以确定较低频率给药的效力(图14)。9只NOD/SCID小鼠的群组以与上述类似的方式用Raji和PBMC接种。在此项研究中，与第一个研究中的一周相比，治疗延长两周。群组接受静脉内注射(19)-3s共计360μg，作为2x130-μg(图14B)、4x65-μg(图14D)或两周内6x43-μg剂量(图14E)。经SC而非静脉内给药向另一群组施用2x130-μg剂量(图14C)。为了比较，制备未经处理的小鼠(图14A)或经非靶向(M1)-3s抗体处理的小鼠(图14F)的对照组。截至第28天，每个(19)-3s治疗组具有比未治疗的对照显著更小的AUC(P<0.05)。意外地，经由SC途径的两个每周剂量显然地与更大频率静脉内给药一样有效。

实施例3.干扰素-α增强抗-Trop-2x抗-CD3双特异性抗体的细胞毒性

针对由hRS7和OKT3制备为DNLTM复合物的抗人Trop-2x抗人CD3双特异性抗体((E1)-3s)在与人T-细胞混合并且注入小鼠中时延迟Capan-1人胰腺腺癌肿瘤细胞的肿瘤生长的能力来测试其治疗效力。还评估干扰素-α(呈E1*-2b或形式)在与此疗法组合时的效应。

方法

向五周龄雌性NOD/SCID小鼠皮下注射Capan-1(5x106个)和人T-细胞(2.5x106个细胞)与基质胶1:1混合的的混合物(E:T比率为1:2)。存在六个不同治疗组，各有8只小鼠。治疗由在施用Capan-1/T-细胞混合物之后1小时开始每天静脉内接收47μg(E1)-3s历时五天的一个群组组成。两个群组用等摩尔量的IFN治疗，一组接受由IFN-α2b-DDD2-CK-hRS7IgG1制备的DNL分子(E1*-2b；每周皮下2.5μgx4周)，同时另一组接受(Roche；每周皮下0.6μgx4周)。其他两组接受(E1)-3s加上E1*2b或(E1)-3s加上的组合。最后一组对照组保持未经处理。表8总结各个治疗组。

表8.(E1)-3s疗法的治疗组

每日监测小鼠的肿瘤长出迹象。一旦肿瘤开始出现，所有动物的肿瘤每周测量两次。如果其肿瘤体积大小超过1.0cm3，将小鼠安乐死以获得疾病进展。

各个组的平均肿瘤体积示于图16。为了清楚，含有组的数据(图16B)与E1*2b组分开示于图中(图16A)。直至第29天，在与未治疗小鼠相比时，所有治疗就曲线下面积(AUC)而言在控制肿瘤生长方面显著较好，在第29天，将未治疗组中的第一只小鼠安乐死以获得疾病进展(P<0.0009；AUC29天)。(E1)-3s与的组合在肿瘤长出方面引起最佳总体抗肿瘤反应(图16B)。此治疗显著比任何个别治疗显著更好(P<0.042；AUC)并且优于(E1)-3s加上E1*-2b的组合(P＝0.0312；AUC53天)(图16A)。在与单独E1*2b或相比时，(E1)-3s加上E1*2b的组合可显著控制肿瘤生长(P<0.0073；AUC46天)但是在与单独(E1)-3s相比时则不然(图16A-B)。用(E1)-3s、或E1*-2b治疗的小鼠之间没有显著差异(图16A-B)。

实施例4.对含白细胞重定向双特异性抗体的干扰素-α组合疗法的进一步研究

在以上实施例中，(E1)-3s加上的组合被证明在控制肿瘤生长方面是非常有效的治疗。为了证实这些结果且对其进行延伸，进行了研究，其中加入两个新群组。首先包括(E1)-3s对照组，其中向动物施用等摩尔量的TF12。TF12由与一个非靶向679Fab(抗HSG)连接的两个hRS7-Fab分子组成。另外，因为Capan-1对IFN敏感，所以加入另一组，其中在不利用T细胞的情况下评估对Capan-1肿瘤生长的效应。

在给小鼠(40)注射Capan-1/T细胞混合物之后，将其随机分成五个治疗组。一个小时后，一个11只小鼠的群组每天静脉内接受47μg(E1)-3s，肿瘤细胞注射后1h开始且再持续连续四天(qdx5)。一个7只动物的群组每周经皮下接受呈形式的干扰素持续四周。另一组接受静脉内(E1)-3s加皮下的组合。未经处理的对照动物接受Capan-1/T细胞但无治疗。另一对照组接受用量以摩尔数计相当于(E1)-3s的TF12(57μgqdx5)。第6组小鼠(8只动物)接受单独注射仅Capan-1细胞(即，无T细胞)且经治疗。所有疗法注射都是以100μL的体积进行。表9汇总了各个组。

表9.(E1)-3s和TF12疗法的治疗组

每日监测小鼠的肿瘤生长的迹象。一旦肿瘤开始出现，每周两次测量所有动物的肿瘤。如果其肿瘤体积大小超过1.0cm3，将小鼠安乐死以获得疾病进展。

示出了平均肿瘤生长(图18)和存活曲线(图19)。尽管彼此并无不同，但当与TF12和未治疗对照组相比时经(E1)-3s、或(无T细胞)治疗的小鼠显示了显著的抗肿瘤效应(P＜0.0102；AUC)。在本实验结束当天(第59天)，经(E1)-3s加组合治疗的小鼠的平均肿瘤体积是0.083±0.048cm3。总体上，此处理组在与所有其他治疗组相比时显示显著的抗肿瘤效应(P＜0.0072；AUC)。

实施例5.含T细胞重定向双特异性抗体的干扰素-α组合疗法在人胃癌中的效应

使用前两个实施例中所公开的方法和组合物来研究单独或与干扰素-α组合的白细胞重定向bsAb在IFN难治性NCI-N87人胃肿瘤细胞系中的效应。对小鼠皮下注射与基质胶混合的5×106个NCI-N87细胞+2.5×106个T细胞(1∶2E∶T比)且在1h后开始治疗。治疗组示于表10中。

表10.(E1)-3s和TF12疗法的治疗组

人胃癌异种移植物(NCI-N87)在NOD-SCID小鼠中的(E1)-3s疗法

实施例6.抗体-药物缀合物(ADC)在人胰腺癌或结肠癌的临床前模型中的体内治疗性用途

如先前所描述来制备CL2A-SN-38抗体缀合物(参见例如美国专利号7,999,083和8,080,250)。将带有皮下人类胰腺或结肠肿瘤异种移植物的免疫受损无胸腺裸鼠(雌性)用特定CL2A-SN-38缀合物或对照缀合物治疗，或保持未经处理。观察特定缀合物的治疗效力。在Capan1胰腺肿瘤模型中，与对照hA20-CL2A-SN-38缀合物(抗CD20)和未经处理的对照(未示出)相比，hRS7(抗TROP2)、hPAM4(抗MUC5ac)和hMN-14(抗CEACAM5)抗体的特定CL2A-SN-38缀合物显示更好的效力。类似地，在人胰腺癌的BXPC3模型中，与对照治疗(未示出)相比，特定hRS7-CL2A-SN-38显示更好的治疗效力。同样，在人结肠癌的侵袭性LS174T模型中，用特定hMN-14-CL2A-SN-38治疗比不治疗(未示出)更有效。

实施例7.使用ADChMN-14-[CL2-SN-38]、IMMU-130在体内治疗裸鼠中的GW-39人结肠肿瘤肺转移

实施例8.ADC(IMMU-132或hRS7-SN-38)用于治疗疗法难治性转移性结肠癌(mCRC)的用途

患者是患有mCRC的62岁妇女，其最初在2012年1月呈现转移性疾病。她在诊断后数周进行了腹腔镜回肠横向结肠切除术作为第一疗法，且随后在新辅助情形下接受4个循环的FOLFOX(甲酰四氢叶酸、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂)化学疗法，随后在2012年3月进行了右侧肝切除术以去除右肝叶中的转移性病变。这之后在2012年6月恢复辅助FOLFOX方案，持续总计12个FOLFOX循环。8月份由于神经毒性加剧而从所述方案中减去奥沙利铂。她的最后一个5-FU循环是在2012年09月25日。

2013年1月进行的CT显示转移至肝脏。她随后被评估为参与IMMU-132(hRS7-SN-38)调查研究的良好候选人。她的病历中的并存病包括哮喘、糖尿病、高血压、高胆固醇血症、心杂音、食管裂孔疝、甲状腺机能减退、腕管综合征、青光眼、抑郁、不宁腿综合征以及神经病。她的手术史包括输卵管结扎(1975年)、甲状腺切除术(1983年)、胆囊切除术(2001年)、腕管解除(2008年)以及青光眼手术。

在进入本疗法时，她的目标病变是左肝叶中的3.1cm肿瘤。非目标病变包括肝脏中的若干个低衰减块。她的基线CEA为781ng/mL。

按照每周一次的方案通过输注连续2周给予IMMU-132，随后停止一周，由此构成治疗循环。在耐受时重复这些循环。第一次IMMU-132输注(8mg/kg)开始于2013年2月15日，且在无值得注意的事件的情况下完成。她在第一个循环过程中经历了恶心(2级)和疲劳(2级)，且继续治疗，从那以后没有重大不利事件。她在2013年3月报告了脱发和便秘。通过计算机断层扫描(CT)，2013年4月8日进行(在6个剂量之后)的第一次反应评估显示目标病变收缩29％。2013年3月25日，她的CEA水平降至230ng/mL。在2013年5月23日的第二次反应评估(10个剂量之后)中，目标病变收缩39％，因而根据RECIST标准构成部分响应。她继续治疗，接受了由12个剂量的8mg/kghRS7-SN-38(IMMU-132)构成的6个循环。她的总体健康状况和临床症状自开始该调查型研究开始得到了相当大的改良。

实施例9.IMMU-132用于转移性实体癌症的ADC疗法

IMMU-132是包含通过pH值敏感性连接子与hRS7抗Trop-2人源化单克隆抗体缀合的CPT-11活性代谢物SN-38的ADC(平均药物-抗体比＝7.6)，当与Trop-2结合时，其展现快速内在化。IMMU-132靶向以高流行率和特异性表达于许多癌瘤中的I型跨膜蛋白Trop-2。此本实施例报告了在3种(中值)先前治疗(一些包括拓扑异构酶I和拓扑异构酶II抑制药物)失败后的25名不同的转移性癌症(胰腺癌，7例；三阴性乳腺癌[TNBC]，4例；结肠直肠癌[CRC]，3例；胃癌，3例；食道癌、前列腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌[SCLC]、肾癌、扁桃体癌、膀胱癌，各1例)患者的I期临床试验。

IMMU-132以重复21天循环施用，在第1天和第8天给予各治疗。在3+3试验设计中，起始剂量为8mg/kg/剂量(即，16mg/kg/循环)，并且升高至18mg/kg直至遇到剂量限制性中性粒细胞减少症。疲劳、脱发和偶尔轻度至中度腹泻是较常见的非血液学毒性中的一些，其中2名患者还报告了皮疹。通过CT，在各种转移性癌症中，24名可评估患者中超过80％具有稳定的疾病或肿瘤收缩(SD和PR)作为最佳反应。通过RECIST，三名患者(CRC、TNBC、SCLC)具有PR；所有患者的中值TTP＞18周，不包括胰腺癌患者。通过剂量减至8-10mg/kg/剂量(16-20mg/kg/循环)来控制中性粒细胞减少症。

免疫组织化学显示Trop-2强表达于大部分存档患者肿瘤中，但在血清中未检测到它。血液肿瘤标记物效价(例如CEA、CA19-9)的相应降低体现了肿瘤反应。尽管重复给药，但未检测到抗-抗体或抗SN-38抗体。血清中IMMU-132浓度的峰和谷评估值显示缀合物在7天内完全清除，这是基于体外研究的意料之中的发现，所述研究显示每天在血清中释放50％的SN-38。这些结果表明，以介于16-24mg/kg/循环范围内的剂量给予的这种新颖ADC在多样性转移性实体癌症中显示高治疗指数。

实施例10.MMU-130(靶向CEACAM5的SN-38ADC)在转移性结肠直肠癌(mCRC)中具有治疗活性

IMMU-130(由pH值敏感性连接子(7.6平均药物-抗体比)缀合于人源化抗CEACAM5抗体(拉贝珠单抗)的SN-38的ADC)正在完成两个I期试验。在两者中，要求患有晚期mCRC的合格患者进行过失败/复发标准治疗，即拓扑异构酶I抑制药物CPT-11(伊立替康)且具有升高的血浆CEA(＞5ng/mL)。

在第一种方案(IMMU--130-01)中，每14天(EOW)以始于2.0mg/kg的剂量施用IMMU-130。在24mg/kg下，三分之二的患者中出现了发热性中性粒细胞减少症；另外，在≤16mg/kg下，在7名患者中观察到中性粒细胞减少症(≥2级)，其中一名还经历血小板减少症。一名患者[在接受≥4个剂量(2个循环)的8名患者中]显示肝脏(起始于7cm)和肺目标病变在4.7个月内减少40.6％(PR，通过RECIST)，无重大毒性，耐受总计18个16mg/kg剂量。该研究以12mg/kgEOW继续进行。

实施例11.单独或与抗-Trop-2x抗-CD3bsAb、IFN-α或抗-Trop-2ADC组合的检查点抑制剂抗体

为了确定示例性检查点抑制剂抗体伊匹单抗(抗CTLA4)的抗肿瘤活性是与其他治疗剂协同还是因加入其他治疗剂而受到抑制，在鼠类肿瘤模型中评估了单独或与示例性T细胞重定向bsAb(E1)-3s、与干扰素-α或与示例性ADChRS7-SN-38(IMMU-132)组合的CTLA4mAb。基于对各种药剂和CTLA4封锁的不同敏感性而选择了M109肺癌、SA1N纤维肉瘤和CT26结肠癌模型。将人T细胞与所述抗体共同施用。

所有化合物均在其最佳剂量和时程下进行测试。当组合使用时，在IMMU-132、(E1)-3s或干扰素-α的第一个剂量之后一天开始CTLA4mAb。使用肿瘤生长抑制百分比和达到目标肿瘤尺寸的天数来评估效力。抗肿瘤活性评分为：完全消退(CR；非可感知肿瘤)或部分消退(PR；肿瘤体积减小50％)。协同定义为抗肿瘤活性显著(p＜0.05)优于各药剂的单一疗法的活性。

在对CTLA4封锁敏感且对(E1)-3s、干扰素-α和IMMU-132适度敏感的SA1N纤维肉瘤肿瘤模型中，界线协同作用在CTLA4mAb与(E1)-3s组合的情况下是明显的，而在干扰素-α下未观察到效应。IMMU-132单一疗法不产生显著的SA1N抗肿瘤活性。然而，，组合IMMU-132与CTLA4mAb产生协同作用。在M109肺转移模型和CT26结肠癌模型中，在CTLA4mAb与IMMU-132、(E1)-3s和干扰素-α中的每一者组合时检测到协同作用。

总之，向干扰素-α、IMMU-132或(E1)-3s中加入CTLA4mAb产生了模型依赖性协同活性。在不考虑肿瘤的免疫原性和仅当至少一种疗法具有活性时观察到了协同作用。所有组合方案都被充分耐受并且组合疗法看似不抑制CTLA4mAb活性。在对单独CTLA4mAb无反应的肿瘤中观察到协同作用，表明其他治疗剂可能诱导免疫原性细胞死亡。

实施例12.用于治疗难治性转移性非小细胞肺癌的使用抗-Trop-2ADC(IMMU-132)和干扰素-α的组合疗法

患者是经诊断患有非小细胞肺癌的60岁男性。给予该患者卡铂、贝伐单抗的化学疗法方案持续6个月，且显示了反应，且随后在进展之后，接下来的2年内接受含卡铂、依托泊苷、吉西他滨的其他化学疗法疗程，偶然反应持续不超过2个月。该患者随后呈现测量为6.5cmx4cm的左纵隔块和胸腔积液。

在签署知情同意书之后，每隔一周以18mg/kg的剂量给予该患者IMMU-132。在治疗第一周之后，给予该患者含IMMU-132和的组合疗法。在前两次注射期间，经历了短期中性粒细胞减少症和腹泻，在4小时内有4次排便，但这些在2天内被对症用药解决或作出反应。在总计6次IMMU-132输注和5次输注之后，指数病变的CT评估显示22％减少，刚好在部分反应部分响应以下但存在明确的肿瘤收缩。患者再继续该疗法两个月，此时通过CT注意到指数病变直径总和的45％肿瘤收缩的部分反应，因而根据RECIST准则构成部分反应。与分开施用两种药剂相比，组合疗法看似提供了协同反应。

实施例13.用于治疗晚期结肠癌的使用ADC(IMMU-130)和T细胞重定向bsAb(MT100)的组合疗法

患者是初步诊断为患有转移性结肠癌(IV期)的75岁妇女。她进行了右部半结肠切除术和小肠切除术，且随后接受FOLFOX、FOLFOX+贝伐单抗、FOLFIRI+雷莫芦单抗和FOLFIRI+西妥昔单抗疗法持续一年半，此时她显示疾病进展，疾病扩散至后穹窿、网膜，骨盆中出现腹水且胸腔右侧出现胸腔积液。就在此疗法之前，她的基线CEA效价是15ng/mL。她被连续2周每周两次给予6mg/kgIMMU-130(抗CEACAM5-SN-38)，然后休息一周(3周的周期)。在第一个循环之后，给予该患者含IMMU-132和白细胞重定向bsAbMT110的组合疗法，按照同样的3周循环通过连续输注施用。在耐受性非常良好而无任何主要血液学或非血液学毒性的5个循环之后，她的血浆CEA效价适度降至1.3ng/mL，但在8周评估中，她显示了指数肿瘤病变的21％收缩，这在13周时增至27％收缩。令人惊讶的是，此时患者的腹水和胸腔积液均减少(后者消失)，因而显著改良了患者的总体状态。与分开施用两种药剂相比，组合疗法看似提供了协同反应。

实施例14.用于治疗具有IV期转移性疾病的胃癌患者的使用ADC(IMMU-130)、抗-Trop-2x抗-CD3bsAb((E1)-3s)和干扰素-α的组合疗法

随后按照8mg/kg的每周方案给予患者含IMMU-130(抗CEACAM5-SN-38)的实验治疗。在第一周之后，开始使用IMMU-130、(E1)-3s和干扰素-α的组合疗法。患者在随后的4周内未展现腹泻或中性粒细胞减少症的证据。随后对患者进行CT研究以测量其转移性肿瘤尺寸和察看原始胃切除术区域。根据RECIST准则，放射科医师测量转移性病变总和与治疗前基线相比减少23％。原始胃切除术区域内似乎不存在任何明确的病变。此时患者的CEA效价是7.2ng/mL，相对于基线值14.5ng/mL大幅降低。患者继续每周一次组合疗法，且在总计13次输注之后，他的CT研究显示一个肝脏转移已经消失且所有转移性病变的总和减少41％，从而构成部分反应(通过RECIST)。患者的一般状况得到改善，且恢复其日常活动，同时继续每三周接受维持疗法。在最后一次测量血液CEA时，值是4.8ng/mL，这对于吸烟者(这是该患者的情况)来说在正常范围内。

实施例15.DOCK-AND-LOCKTM的一般技术

以下论述的一般技术可用于使用所公开的方法和组合物来产生具有连接至任何抗体或抗原结合抗体片段的AD或DDD部分的DNLTM复合物。

已使用质粒载体pdHL2来产生多种抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等人，JImmunolMethods(1989),125:191-202；Losman等人，Cancer(Phila)(1997),80:2660-6。双顺反子哺乳动物表达载体引导IgG的重链和轻链的合成。许多不同IgG-pdHL2构建体的载体序列基本上相同，仅有的差异存在于可变结构域(VH和VL)序列中。使用本领域的技术人员已知的分子生物学工具，可将这些IgG表达载体转化成Fab-DDD或Fab-AD表达载体。

为了产生Fab-DDD表达载体，将重链的铰链、CH2和CH3结构域的编码序列用编码铰链的前4个残基、14个残基连接子和DDD部分例如人RIIα的前44个残基的序列(称为DDD1，SEQIDNO:1)替代。为了产生Fab-AD表达载体，将IgG的铰链、CH2和CH3结构域的序列用编码铰链的前4个残基、具有15个残基的连接子和诸如使用生物信息学和肽阵列技术产生并显示以非常高的亲和性(0.4nM)结合RIIα二聚体的具有17个残基的合成AD(称为AKAP-IS)的AD部分(称为AD1，SEQIDNO：3)的序列置换。参见Alto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A(2003)，100：4445-50。设计两个穿梭载体以促进IgG-pdHL2载体向Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体的转化，如下文所述。

CH1的制备

使用pdHL2质粒载体作为模板，通过PCR扩增CH1结构域。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5′)端和SacII限制性核酸内切酶位点(其为CH1编码序列的5′)组成。右侧引物由编码铰链(PKSC，SEQIDNO：102)前4个残基的序列组成，随后是4个甘氨酸和丝氨酸，其中最后两个密码子(GS)包含BamHI限制位点。将410bpPCR扩增引物克隆到PCR克隆载体(Inc.)中，并针对T7(5’)方向的插入片段来筛选克隆。

合成双链寡核苷酸，以编码DDD1的氨基酸序列，该氨基酸序列前面是连接子肽的11个残基，前两个密码子包含BamHI限制位点。终止密码子和EagI限制位点附接于3’端。所编码的多肽序列于下文示出。

合成在其3’端有30个碱基对重叠的两个寡核苷酸(命名为RIIA1-44顶部和RIIA1-44底部)，并对它们进行组合从而包含174bpDDD1序列的中心154个碱基对。使该寡核苷酸退火并用Taq聚合酶进行引物延伸反应。引物延伸后，通过PCR扩增双链体。将该扩增引物克隆到中，并针对T7(5’)方向的插入片段进行筛选。

合成双链寡核苷酸，以编码AD1的氨基酸序列，该氨基酸序列前面是连接子肽的11个残基，前两个密码子包含BamHI限制位点。终止密码子和EagI限制位点附接于3’端。所编码的多肽序列于下文示出。

合成编码上述肽序列的两个互补重叠的寡核苷酸(命名为AKAP-IS顶部和AKAP-IS底部)，并使其退火。通过PCR扩增双链体。将扩增引物克隆到载体中并针对T7(5’)方向的插入片段进行筛选。

连接DDD1与CH1

用BamHI和NotI限制酶将编码DDD1序列的190bp片段从中切除，并接着连接至中的相同位点中以产生穿梭载体

连接AD1与CH1

利用BamHI和NotI从中切除含有AD1序列的110bp片段，然后将其连接到中的相同位点处从而产生穿梭载体

利用这种模块设计，可以将CH1-DDD1或CH1-AD1并入到pdHL2载体中的任何IgG构建体中。通过从pdHL2移除SacII/EagI限制性片段(CH1-CH3)并将其置换为从相应穿梭载体切除的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI限制性片段将整个重链恒定结构域置换为上述构建体之一。

C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2

C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，其具有DDD2(SEQIDNO：2)的二聚化和对接结构域序列，该DDD2经由14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接子附接至hMN-14的Fd羧基末端。所分泌的融合蛋白由通过DDD2结构域的非共价相互作用保持在一起的两个相同拷贝的hMN-14Fab构成。

表达载体如下进行工程改造。合成制备包含部分连接子肽和DDD2的残基1-13的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸。使该寡核苷酸退火并用T4PNK磷酸化，从而在5’和3’端产生适合于与分别用限制核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接的悬突。

将双链体DNA与通过用BamHI和PstI消化制备的穿梭载体连接以产生穿梭载体用SacII和EagI从中切除507bp片段，并将其与通过用SacII和EagI消化而制备的IgG表达载体hMN-14(I)-pdHL2连接。最终表达构建体命名为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。已利用类似技术来产生多种不同人源化抗体的Fab片段的DDD2融合蛋白。

h679-Fd-AD2-pdHL2

h679-Fab-AD2经设计与C-DDD2-Fab-hMN-14配对。h679-Fd-AD2-pdHL2是用于产生h679-Fab-AD2的表达载体，其具有通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接子接附于CH1结构域的羧基末端的AD2的锚定结构域序列(SEQIDNO:4)。AD2在AD1的锚定结构域序列之前具有一个半胱氨酸残基并且在其后具有另一个半胱氨酸残基。

表达载体如下进行工程改造。合成制备包含AD2和部分连接子序列的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸(AD2顶部和AD2底部)。将该寡核苷酸退火并用T4PNK磷酸化，从而在5'和3'端上产生适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接的悬突。

将双链体DNA连接到通过用BamHI和SpeI消化制备的穿梭载体中以产生穿梭载体利用SacII和EagI限制酶从该穿梭载体中切除含有CH1和AD2编码序列的429碱基对片段，并将其连接到通过用这些相同的酶消化制备的h679-pdHL2载体中。最终表达载体为h679-Fd-AD2-pdHL2。

TF2DNLTM构建体的产生

通过使C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应获得三聚DNLTM构建体，命名为TF2。如下以>90％产率产生TF2的试验批次。将经蛋白质L-纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4:1的摩尔比混合。总蛋白质浓度为于含1mMEDTA的PBS中1.5mg/ml。后续步骤包括TCEP还原、HIC色谱、DMSO氧化和IMP291亲和色谱。在添加TCEP前，SE-HPLC未显示任何a2b形成的迹象。添加5mMTCEP快速引起与针对二元结构预期的157kDa蛋白质一致的a2b复合物形成。通过IMP291亲和色谱将TF2纯化至接近均质(未示出)。IMP291是含有679Fab结合到其上的HSG半抗原的合成肽(Rossi等人，2005,ClinCancerRes11:7122s-29s)。IMP291未结合部分的SE-HPLC分析证明a4、a2和游离κ链从产物的移除(未示出)。

通过测定法测定TF2的功能性。将TF2、C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a2b复合物的对照样品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作未还原a2和b组分的对照样品)稀释至1μg/ml(总蛋白质)并流经固定有HSG的感测芯片。TF2的反应约为两个对照样品的反应的两倍，表明对照样品中仅h679-Fab-AD组分结合并保留于感测芯片上。随后注入的WI2IgG、针对hMN-14的抗独特型抗体证明仅TF2具有与h679-Fab-AD紧密缔合的DDD-Fab-hMN-14组分，如另外的信号响应所指示的。由WI2与固定于感测芯片上的TF2结合引起的反应单位的额外增加与各自由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚单位促成的两个完全功能性结合位点相符。此由TF2结合WI2的两个Fab片段的能力所证实(未示出)。

TF10DNLTM构建体的产生

使用类似方案产生包含C-DDD2-Fab-hPAM4的两个拷贝和C-AD2-Fab-679的一个拷贝的三聚TF10DNLTM构建体。使用针对产生(抗CEA)2×抗HSGbsAbTF2所公开的方法，如上所述产生TF10双特异性([hPAM4]2×h679)抗体。TF10构建体带有两个人源化PAM4Fab和一个人源化679Fab。

在稳定转染的骨髓瘤细胞中独立地表达两个融合蛋白(hPAM4-DDD和h679-AD2)。组合组织培养上清液，得到两倍摩尔过量的hPAM4-DDD。反应混合物在室温下在使用1mM还原型谷胱甘肽的温和还原性条件下孵育24小时。还原后，DNL反应通过使用2mM氧化型谷胱甘肽轻微氧化而完成。通过亲和色谱使用IMP291-affigel树脂分离TF10，该树脂以高特异性结合h679Fab。

实施例16.从多个抗体产生AD和DDD连接的Fab和IgG融合蛋白

采用前述实施例中描述的技术，构建表11中示出的IgG和Fab融合蛋白，并将其并入到DNLTM构建体中。该融合蛋白保留了亲本抗体的抗原结合特征，并且DNLTM构建体表现出所并入抗体或抗体片段的抗原结合活性。

表11.包含IgG或Fab的融合蛋白

实施例17.NK靶向的白细胞-重定向bsAb的用途

使用bsAb重新靶向白细胞不限于针对T细胞的抗体。在替代的实施方案中，结合于单核细胞、NK细胞或嗜中性粒细胞的bsAb也可以用于重新靶向目的。

CD16是针对由NK细胞的CD56dim子集高度表达的IgG的活化低亲和力Fc-γ受体(Gleason等人，2012,MolCancerTher11:2674-84)。除其在NK细胞重新靶向方面的用途以外，包含抗CD16抗体组分的bsAb能够通过CD16的直接信号转导来活化NK介导的细胞毒性，从而诱导溶解性颗粒定向分泌和靶细胞死亡的能力(Gleason等人，2012)。

使用如先前所报告的DNA改组和连接技术(Vallera等人，2005，ClinCancerRes11：3879-88)，根据Gleason等人，2012，MolCancerTher11：2674-84)制备CD16/CD19双特异性杀灭细胞衔接子(BiKE)和CD16/CD19/CD22三特异性杀灭细胞衔接子(TriKe)。通过相继进行离子交换和尺寸排阻柱色谱法来纯化所表达的BiKE和TriKE。在CD16/CD19BiKE或CD16/CD19/CD22TriKE存在(10μg/mL)下将其余PBMC暴露于原发性ALL和CLL肿瘤细胞。与无重新靶向抗体时的细胞相比，在BiKE或TriKE存在下观察到对肿瘤细胞的细胞毒性显著增加。肿瘤细胞在不存在PBMC的情况下暴露于BiKE或TriKE时未观察到效应。相对于BiKE，TriKE对肿瘤细胞毒性具有较大作用，表明与额外肿瘤细胞抗原结合可以增强重新靶向效应。使用经过纯化的NK细胞代替PBMC观察到了类似的结果。

如Wiernik等人(2013)，ClinCancerRes19：3844-55中所公开来制备CD16/CD33BiKE。将BiKE施用于已注入与人PBMC共同施用的人HL60早幼粒细胞性白血病异种移植细胞的裸鼠。与经对照bsAb治疗的小鼠相比，经BiKE治疗的小鼠显示死亡率和肿瘤生长率降低。加入抗CD33-SN-38ADC进一步增强了BiKE的细胞毒性效应。

实施例18.用于治疗性用途的三价抗体

如专利EP1309795B1中所描述来制作三价三特异性细胞靶向构建体，包括：(i)对如专利US618728中所描述的衍生出EP1309795的技术方案1的Fab的小鼠抗CD16mab进行嵌合或人源化；(ii)构建由US7,238,785中所描述的人源化抗HLA-DR抗体的Fv构成的单链抗体，且通过连接子将所述scFv接合于(i)的抗CD16Fab的轻链的羧基末端；和(iii)构建由US8486395中所描述的人源化抗CD19抗体的Fv构成的单链抗体，且通过连接子将所述scFv接合于(ii)的抗CD16Fab的CH1的羧基末端。

将该三价构建体与IMMU-132组合施用于患有转移性胰腺癌的受试者。观察到部分反应并且肿瘤显示尺寸消退，持续12个月。

实施例19.抗-Trop-2x抗-CD3双特异性抗体

用于哺乳动物细胞中E1-3的表达的质粒载体的构建

合成双链DNA序列(SEQIDNO：106)并且组装到pUC57质粒载体中。通过用XbaI和EagI限制性内切核酸酶消化将SEQIDNO：106从pUC57切除并且连接到通过用相同的酶消化制备的pdHL2哺乳动物表达载体中。编码序列指向包含前导肽的单个多肽(SEQIDNO：107)、hRS7VK(SEQIDNO：108)、LI(SEQIDNO：109)、hRS7VH(SEQIDNO：110)、L2(SEQIDNO：111)、Okt3VH(SEQIDNO：112)、L3(SEQIDNO：113)、Okt3VK(SEQIDNO：114)以及6-His(SEQIDNO：105)的合成。串联scFvE1-3的示意图在图22中示出。

包含E1-3插入物的合成DNA序列

推导的E1-3的氨基酸序列

hRS7VK的氨基酸序列

连接子L1的氨基酸序列

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO：109)

氨基酸序列hRS7VH

连接子L2的氨基酸序列

GGGGS(SEQIDNO：111)

Okt3VH的氨基酸序列

连接子的L3氨基酸序列

VEGGSGGSGGSGGSGGVD(SEQIDNO：113)

Okt3VK的氨基酸序列

SpESF骨髓瘤细胞中稳定产生克隆的开发

通过使用SalI限制性内切核酸酶消化使E1-3-pdHL2载体线性化，并且使用850V和10μF的脉冲通过电穿孔，使用30μg稳定地转染1x107个SpESFX骨髓瘤细胞(Rossi等人，2011，BiotechnolProg27：766-75)。从用0.2μM甲氨蝶呤(MTX)来补充选择和产生培养基。在96孔组织培养板中选择转染的克隆并且使用Ni-NTA96孔板通过ELISA针对E1-3表达进行筛选。使用树脂，通过固相金属亲和力色谱法(IMAC)，之后通过尺寸排除高效液相色谱法(SE-HPLC)将E1-3蛋白从滚瓶的培养基肉汤纯化。通过SDS-PAGE将纯化产物分解为单SE-HPLC峰值(未示出)和单个多肽带(未示出)，其中相对运动性符合其所计算的分子尺寸53,423Da。

实施例20.活体外Trop-2表达实体瘤细胞的重定向T细胞杀灭

从两个健康供体的血液标本(NJ血站)的血沉棕黄层制备外周血单核细胞(PBMC)并且用于分离CD8+T细胞(Miltenyi)。将Capan-1(胰腺癌，157,000Trop-2/细胞)、BxPC3(胰腺癌，500,000Trop-2/细胞)和NCI-N87(胃癌，247,000Trop-2/细胞)细胞系(ATCC)用作表达低、高和中等水平的Trop-2的靶细胞。BxPC3和NCI-N87保持在RPMI1640培养基中，该培养基补充有10％FBS，而将Capan-1细胞保持在20％FBS/RPMI1640中。CD8+T细胞(1.2x105细胞/孔)与靶细胞(2x104细胞/孔)以6∶1的比率在96孔组织培养基板中混合。将E1-3和(E1)-3s滴定添加到测定板。在37℃下在48小时温育后，使用PBS将板洗涤两次以除去T细胞，然后将补充有30％MTS试剂(CELLTITERAqueousOneSolution，Promega)的150μL的新鲜培养基添加到每个孔。在1-2小时后于37℃下，使用ENVISION测量490nm处的吸光度。

使用针对每个细胞系来自三个供体的T细胞，比较在三个Trop-2-表达的细胞系(BxPC3、Capan-1和NCI-N87)中，E1-3双特异性抗体与等同的DNL构建体(E1)-3s的体外效力(图23)。基于IC50值(表12)，当与来自相同供体的T细胞比较时，在所有细胞系中，E1-3比(E1)-3s至少强效5倍，它对E1-3的相对敏感度看起来与Trop-2-抗原密度有关。然而，在所使用的供体T细胞中，效力是变化的。体外，E1-3介导了BxPC3[IC50＝0.09(±0.04)pM]、Capan-1[IC50＝1.2(±l.l)pM]和NCI-N87[IC50＝1.2(±1.2)pM]靶细胞的高强效的T-细胞溶解。

表12.使用E1-3和(E1)-3s的Trop-2+癌细胞系的体外T细胞重定向杀灭的IC50值

IC50值＝导致50％杀灭的pM浓度。

*未实现50％杀灭。针对每个供体，供体1和2是相同的。供体3、4和5是独立的供体。

实施例21.E1-3对(E1)-3s的实体瘤的体内疗法

E1-3(P)和(E1)-3s均显著地延缓了NCI-N87肿瘤的生长(P≤0.001；AUC第25天)(图24)。E1-3优于(E1)-3s(P＝0.0324,AUC第36天)(图24)。三天，体内两次分开给予50μg剂量的E1-3治愈具有NCI-N87异种移植物的全部小鼠(N＝8)(P＝0.0005；数秩)。在第39.5天，对照组(仅PBMC)中的肿瘤达到端值(TV>1cm3)。在78天后，E1-3组中所有小鼠都没有肿瘤。

实施例22.由抗-CD3x抗-Trop-2双特异性抗体诱导的胞啃

Trop-2在正常组织中存在受限，但在各种不同的上皮癌中高度表达。如以上实施例所论述，(E1)-3s是T细胞重定向三价双特异性抗体(bsAb)复合物，其包含共价连接到Trop-2靶向的Fab的稳定二聚体的抗-CD3scFv。我们在此第一次显示bsAb介导的双向胞啃发生在靶细胞与T细胞之间并且涉及免疫突触的形成。

BxPC3细胞与胰蛋白酶(不影响Trop-2)分离并且与纯化的T细胞混合。在37℃下，用0.1nmol/LbsAb将细胞混合物处理1小时。使用以下中任一个对细胞进行染色：(i)抗-Trop-2MABC518，然后GAM-FITC或(ii)抗-Trop-2-PE克隆MR54和抗-CD4-APC。通过前向和侧向散射以及Trop-2和CD4，从细胞缀合物荧光门控单个BxPC3和T细胞。

(E1)-3s诱导T细胞与靶细胞之间免疫突触的形成。这使用Capan-1胰腺癌细胞示出(Rossi等人，2013,MAbs6:381-91)。在此，将0.1μg/mL(E1)-3s分别添加到使用红色和绿色荧光膜标记的纯化的CD8+T细胞和NCI-N87胃癌细胞的混合物，导致缀合物的形成，这通过荧光显微法显而易见(未示出)。在(19)-3s(未示出)或TF12(未示出)存在的情况下，未观察到分别仅结合T细胞或NCI-N87的缀合物。将载玻片浸入盐水中洗掉含有(19)-3s或TF12的孔中的大部分T细胞，然而许多T细胞保持结合至使用(E1)-3s处理的孔中的粘着的NCI-N87细胞。

实施例23.双特异性抗-CD3x抗-Trop-2抗体和细胞因子释放

如以上实施例中所论述，我们研究了干扰素-α(IFNα)对人胃和胰腺癌细胞系的(E1)-3s-介导的T-细胞杀灭的影响。使用外周血单核细胞(PBMC)或T细胞体外评估T-细胞活化、细胞因子诱导和细胞毒性，其中NCI-N87胃癌作为靶细胞。在靶细胞和PBMC的存在下，(E1)-3s未引起细胞因子过量产生。当与(E1)-3s混合时，单独不增加T-细胞活化或在基线上提升细胞因子水平的聚乙二醇干扰素α-2a增加了CD69表达但未显著地增加细胞因子诱导。IFNα增强了(E1)-3s的治疗功效而不将其他细胞因子的产生增加至可诱导细胞因子释放综合症(CRS)的水平。与IFNα或其他细胞因子的辅助疗法可普遍适用于增强T-细胞免疫疗法的功效。

使用允许连接过夜的5x105个细胞/0.5mL/孔的NCI-N87或Raji体外测量细胞因子释放。将刚分离的PBMC(5x106个细胞/0.4mL/孔)添加到每个孔。针对每个试剂，将包含(19)-3s、19-3BiTE、(E1)-3s、聚乙二醇干扰素α-2a或(E1)-3s加上聚乙二醇干扰素α-2a的治疗物(100μL，l0x)添加到0.1nmol/L。另选地，对于剂量反应研究，使用1pmol/L至10nmol/L范围内的滴定。在37℃下20小时轻柔摇动温育后，上清液流体以1:2(或当需要时更大)稀释并且根据制造商的方案，使用Single-AnalyteELISArray试剂盒(Qiagen)测量TNFα、IFNg、IL2、IL6以及IL10的浓度。

Trop-2xCD3BiTE(或等同物)不能与(E1)-3s相比较。然而，具有与(E1)-3s相同的(X)-3s分子构型的(19)-3s和具有与CD19xCD3BiTE布利莫单抗相同的氨基酸序列的19-3BiTE两者的可用性使头对头比较变得可能以评估两种bsAb形式的相对细胞因子-诱导效力。

初始，将(19)-3s和19-3BiTE的滴定添加到PBMC(两个独立供体)和RajiNHL细胞的混合物并且在20小时后测量TNFα、IFNγ和IL6的水平(未示出)。从单独PBMC检测最小细胞因子水平，即使是在添加bsAb的情况下。然而，由于Raji与供体PBMC之间发生的混合淋巴细胞反应(对于供体A更强)，针对TNFα(200pg/mL和50pg/mL)、IFNγ(600pg/mL和200pg/mL)和IL6(190pg/mL和220pg/mL)中的每一个，未经处理的细胞混合物中的细胞因子水平升高。仅在≥1nmol/L(19)-3s下，TNFα和IL6的水平增加到未治疗的水平以上。显而易见，在较低浓度下，(19)-3s抑制TNFα和IL6产生。相比之下，在所测试的19-3BiTE的所有浓度下(≥1pmol/L)，TNFα和IL6评估为>1,000pg/mL。通过(19)-3s，IFNγ的水平未增加，然而19-3BiTE显示了剂量依赖性增加到>2,000pg/mL。

对于所有进一步比较，在0.1nmol/L下测试试剂，这与在使用BiTE的类似研究中所使用的近似(Brandi等人，CancerImmunolImmunother2007,56:1551-63)。使用4个不同的供体，我们比较由来自混合有PBMC的Raji的0.1nmol/L(19)-3s或19-3BiTE诱导的TNFα、IFNγ、IL2、IL6以及IL10的水平(图27A)。对于4个供体中的每一个，相比于(19)-3s，使用19-3BiTE的五种细胞因子中每一个的水平都显著更高。使用19-3BiTE的平均TNFα浓度(2,284pg/mL±1,483pg/mL)比(P＝0.0001)使用(19)-3s的平均TNFα浓度(280±188pg/mL)高8倍。对于19-3BiTE，相比于(19)-3s，使用19-3BiTE治疗使得IFNγ(3,002pg/mL±560pg/mL对416pg/mL±169pg/mL)、IL2(13,635pg/mL±2,601pg/mL对1,024pg/mL±598pg/mL)、IL6(981pg/mL±364pg/mL对168pg/mL±96pg/mL)和IL10(4,006pg/mL±2,520pg/mL对493pg/mL±242pg/mL)的水平高7倍、13倍、6倍以及8倍(对于每个，P<0.0001)。这些结果表明(X)-3sbsAb形式在细胞因子释放的诱导者方面效力远低于BiTE形式。

一般来讲，在PBMC和靶细胞的存在下，(E1)-3s比(19)-3s引起甚至更少的细胞因子产生，因为不存在淋巴细胞反应以升高基线水平(图27B)。5个供体中的4个，对于IFNγ(<100pg/mL)、TNFα(<100pg/mL)和IL2(<250pg/mL)的促炎细胞因子水平保持较低。5个供体中的3个，IL6水平低(<400pg/mL)，并且供体D-2和D-5水平中等(800-1,100pg/mL)。对于IFNγ(1,000pg/mL)和TNFα(190pg/mL)，供体D-2还比其他更多地响应于(E1)-3s。5个供体中的3个，通过(E1)-3s，IL10，抗炎细胞因子显著(P<0.0001)提升至>1,200pg/mL。值得注意的是，在使用(E1)-3s处理后，具有独特强效促炎反应的供体D-2产生了相对低水平的IL10(230pg/mL)。相比于背景，仅聚乙二醇干扰素α-2a不增加任何细胞因子的水平。将聚乙二醇干扰素α-2a添加到(E1)-3s一贯地比仅(E1)-3s增加IFNγ(约1.5-3倍)。对于剩余细胞因子，使用组合存在明显中度增加产生的趋势；然而，未观察到持续影响。

实施例24.由双特异性抗-CD3x抗-Trop-2抗体诱导的体外细胞毒性

进行进一步研究以检查由抗-CD3x抗-Trop-2双特异性抗体诱导的体外细胞毒性。

使新鲜分离的CD8+T细胞与0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a、0.1nM20*-2b或仅培养基温育24小时。治疗或未治疗T细胞和PKH67绿色荧光标记的NCI-N87细胞以5:1比率(5x104个靶细胞和2.5x105个效应细胞/孔)在含有(E1)-3s的系列稀释液的48孔板中混合，一式三份。在合适的细胞混合物中，聚乙二醇干扰素α-2a或20*-2b保持在0.1nM。板在37℃孵育48小时。除去悬浮液细胞，并且使用胰蛋白酶-EDTA分离连接的细胞，并且与对应的悬浮液混合。洗涤细胞并且重悬在含有30,000COUNTBRIGHTTM绝对计数珠(AbsoluteCountingBeads)(LifeTechnologies)和1μg/mL的7-AAD的1％BSA-PBS中。通过流式细胞术计数总存活靶细胞(7-AAD-/PPKH67+)。对于每个样品，8,000个COUNTBRIGHTTM珠粒计数为标准化参考。使用下式计算具体溶解(％)：[1-(A1/A2)]x100，其中A1和A2分别代表测试中存活靶细胞的数目和未经处理的样品。针对IC50(导致50％溶解的浓度)、EC50(50％有效浓度和溶解最大(最大靶细胞溶解)，使用Prism软件通过F检验在非线性回归(S形剂量反应)曲线上确定统计显著性(P≤0.05)。

实施例25.通过抗-CD3x抗-Trop-2双特异性抗体的T细胞活化的剂量反应曲线

添加0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a中度而非显著地增强了使用(E1)-3s处理的T细胞上的CD69上调。对于测量CD69+T细胞％的(E1)-3s剂量反应实验，在IFN-α的存在下，针对CD4+T细胞，EC50从26pM降低至16pM(P＜0.0001)，针对CD8+T细胞，从11pM降低至6pM(P＝0.0204)(图29A)。与(E1)-3s混合的聚乙二醇干扰素α-2a产生更多CD69+细胞(图29B，图29C，P＜0.0001)，并且同样，使用IFN-α活化细胞具有显著更高的CD69表达(图29B,图29D；MFI＝907对726；P＜0.0001)。在不存在(E1)-3s的情况下，聚乙二醇干扰素α-2a诱导的CD69表达最小。同样，在不存在靶细胞的情况下，(E1)-3单独或与聚乙二醇干扰素α-2a组合未活化T细胞。

实施例26.使用IFN-α增强了使用(E1)-3s的扩展体内存活

将以上实施例3中报告的体内存活的初步数据进一步扩展至长达126天。如以下所示，(E1)-3s与IFN-α的组合为具有Trop-2+异种移植物肿瘤的动物提供最大的益处。

向4-8周龄NOD/SCID雌性小鼠(CharlesRiver,Wilmington,MA)皮下注射混合有等体积的基质胶的5x106个肿瘤细胞(Capan-1或NCI-N87)与T细胞(2.5x106)的混合物。根据BiTE方法学，通过静脉内注射，1小时后开始治疗(Dreier等人，2003,JImmunol170:4397-402)。每个实验中的处理方案、剂量和动物数目描述于图例中。每周两次，通过使用卡尺进行二维测量来确定肿瘤体积，体积定义为：Lxw,2/2，其中L是肿瘤的最长尺寸并且w是最短尺寸。

对于NCI-N87胃癌异种移植物模型(图30C)，(E1)-3s和聚乙二醇干扰素α-2a的组合(MST>88天)优于仅(E1)-3s(MST＝49天；P＝0.0007,数秩)。相比于仅具有T细胞的对照组(MST＝32天)，具有T细胞的仅聚乙二醇干扰素α-2a提供较小但显著的存活优势(MST＝35天；P＝0.0276)。(E1)-3s加上聚乙二醇干扰素α-2a但无T细胞未显著改善存活。

针对NCI-N87[247,000(±65,000)Trop-2/细胞]和Capan-1[157,000(±37,000)Trop-2/细胞]测量的抗原密度无显著不同。通过聚乙二醇干扰素α-2a，Capan-1细胞比NCI-N87对直接抑制的敏感度>5倍(IC50＝2nM对>10nM)体外(未示出)。(E1)-3s不与小鼠Trop-2或CD3交联反应(未示出)，并且NOD-SCID小鼠T-细胞不足。

讨论

此部分讨论实施例23-26中呈现的结果。在以上实施例1和2中，我们使用若干示例构建体，讨论了用于造血和实体瘤两者的重定向T细胞介导的疗法的(X)-3sbsAb形式的用途，该构建体包括(E1)-3s、(19)-3s和(20)-3s。在根据那个研究的一个体内实验中，使用(E1)-3s在该实验中处理Capan-1异种移植物，我们包括了具有聚乙二醇干扰素α-2a的组，因为先前(未公布)数据显示Capan-1被IFN-α抑制。添加IFN-α所观察的突出增强促使进一步探索，从而产生了现在的研究。本文报告了使用T细胞重定向双特异性抗体与聚乙二醇干扰素α-2a组合的研究结果。扩展研究直到所有组达到它们的MST，从而证实了IFN-α可增强IFN-α敏感性细胞系的T-细胞杀灭的体内功效。IFN-α还可增强对IFN-α的直接作用不敏感的细胞系的T细胞介导的杀灭。在包括给药和方案的方法后进行这些体内研究，通常与BiTE构建体一起使用。

我们观察到供体T细胞的效力的相当大的变化。图28中示出的体外结果代表我们所测试的具有最大活性和最小活性的T细胞，其中用于杀死NCI-N87的效力相差100倍(IC50＝0.37pM对39pM)；然而，IC50＝1-5pM是最优代表性的(>10个供体)并且低活性T细胞是非典型的。值得注意的是，通过IFN-α的使用较弱的T细胞的溶解比使用强效T细胞的溶解加强得更多。

这是由bsAb介导的靶肿瘤与T细胞之间的胞啃的第一份报告。此发现展示了使用(E1)-3s诱导的靶/T-细胞缀合物具有功能性免疫突触。我们在B细胞与T细胞之间观察到类似的双向胞啃，这由(19)-3s(未公布数据)介导并且认为这可能是使用T-细胞重定向bsAb的常见现象。

实施例27.对E1-3双特异性抗体的进一步研究

技术实现要素：

使用hRS7(人源化抗-Trop-2mAb)和Okt-3(抗-CD3mAb)的可变结构域，T-细胞重定向双特异性串联scFv，E1-3如以上实施例19中所述产生。此实施例中报告的研究延续并且扩展实施例20-25中示出的结果。马上报告的结果与实施例20-25中显示的结果之间任何矛盾均基于另外收集的数据。使用PBMC或纯化的T细胞体外评估T-细胞活化、增殖、细胞因子诱导和细胞毒性，其中将人胰腺(Capan-1和BxPC-3)和胃(NCI-N87)癌细胞系用作靶细胞。使用皮下接种的NCI-N87异种移植物，在具有两倍数目的人PBMC和基质胶的混合物中测定体内活性。

在靶细胞和PBMC的存在下，E1-3强效地诱导T-细胞活化、增殖、IL-2(>2ng/mL)、IL-6(>1ng/mL)、IL-10(>7ng/mL)、TNF-α(>1ng/mL)以及IFN-γ(>50ng/mL)的剂量依赖性细胞因子产生。使用3-5个不同的T细胞供体，E1-3T-细胞介导了BxPC-3[IC50＝0.09(±0.04)pM]、Capan-1[IC50＝1.2(±1.1)pM]和NCI-N87[IC50＝1.2(±1.2)pM]靶细胞体外高度强效的T细胞溶解。体内两次分开给予50μg剂量的E1-3治愈具有NCI-N87异种移植物的8个小鼠中的六个(P＜0.0001；数秩)。在39.5天的中值，对照组(仅PBMC)中的肿瘤达到端值(TV>1cm3)。8个动物中7个未达到端值，其中当实验在176天后终止时，在E1-3组中，小鼠中的6个保持不具有肿瘤。

T-细胞活化和增殖-纯化的CD8+T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合，使用0.01nME1-3处理18小时并且通过流式细胞术分析。在靶细胞的存在下通过E1-3上调CD69(未示出)。省略E1-3或NCI-N87靶细胞的处理未诱导CD69表达(未示出)。另外，在存在E1-3和靶细胞的情况下培育后，T细胞经历前向(FSC)散射和侧向散射(SSC)并且增加(未示出)。三天后，T-细胞增殖是显而易见的(P<0.005，数据未示出)。

细胞因子释放-确定作为剂量的函数的诱导细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6以及IL-10的释放的E1-3双特异性串联scFv的能力。如图31中所示，在皮摩尔浓度范围内，E1-3双特异性抗体有效地诱导细胞因子释放。

体外T-细胞介导的杀灭-在存在纯化的CD8+T细胞的情况下(1.2x105/孔)，确定E1-3诱导靶胰腺和胃癌细胞的T-细胞介导的杀灭的能力。使用来自代表性供体的T-细胞的示例性剂量反应曲线在图32中示出。在此实验中，针对Capan-1，E1-3的IC50值为0.6pM，针对BxPC-3，0.1pM并且针对NCI-N87，0.3pM。

E1-3的体内抗肿瘤效应-分三天给予两个50μg剂量的E1-3来治疗具有NCI-N87异种移植物的裸鼠。治疗(图33A)治愈了具有人胃癌异种移植物的8个小鼠中的6个(P<0.0001；数秩)。相比于对照组的肿瘤(仅使用PBMC治疗)，其在39.5天的中值达到端值(TV>1cm3)(图33B)。在176天研究终止后，E1-3组中8个动物中的7个未达到端值。

结论

以上研究显示Trop-2是用于胰腺、胃和其他上皮癌的T介导的杀灭的有吸引力的靶标。E1-3抗-Trop-2x抗-CD3双特异性抗体诱导T-细胞活化和细胞因子产生。E1-3在体外和体内杀灭实体瘤方面是高度有效的。