据此，针对生化样本中致病菌的高效检测需求，本文在介绍SERS光谱及其增强介质材料和结构的基础之上，结合微流控芯片分析技术对芯片上集成SERS活性基底结构的方法进行了探讨，包括在芯片微通道中注入金属溶胶颗粒、在微流控芯片检测区构建固体纳米结构以及在微通道中原位制备纳米增强基底等进行详细论述；重点综述了基于微流控SERS芯片的致病菌检测方法及其应用，以期对生化样本中致病菌的高效检测提供有借鉴意义的新方法和新途径。
SERS增强机理主要分为电磁场增强（ElectromagneticEnhancement，EM）和化学增强（ChemicalEnhancement，CE）［10］。电磁场增强是由于金属纳米结构上局域表面等离子体共振（LocalizedSurfacePlasmaResonance，LSPR）的形成［11］。化学增强则是由于化学吸附作用、吸附物与基底之间的光子驱动电荷转移以及电子-空穴对与被吸附分子之间的耦合作用［12］。
SERS光谱强度ISERS可以通过以下公式表示［13］：
其中：GEM为EM的增强因子，A（νS）和A（νL）分别是拉曼散射场的增强因子和激光的增强因子，ε0为周围介质的介电常数，εν代表金属纳米结构的介电常数，r代表金属纳米结构的基本单元（如小球）的半径，d为被分析物与金属纳米结构之间的距离，和项（αρσ）nm为CE的增强因子，描述了分子与金属表面的相互作用。从式（2）可以看出电磁场增强因子GEM近似与金属纳米结构所产生的局域电场强度4次方成正比。更重要的是，纳米微结构周围的电磁场并非均匀分布，而是高度局域于空间狭窄区域，如在尖端、间隙处会产生更大的电磁场增强［14］。
优异的SERS活性基底是获得生化样本良好拉曼增强信号的前提条件，而纳米技术的发展为SERS活性基底的研发和拓展提供了广阔的空间。大量的研究显示，纳米材料的种类、纳米颗粒的形貌和尺寸以及检测分子与纳米结构之间的相互作用模式等因素都会影响SERS的增强效果［15-16］。因此，构建具有良好信号放大效果的SERS基底是拉曼光谱技术应用于生化检测的重要环节。
Fe3O4/Ag、Fe3O4@Au、
Ni/Au、Ni/Ag
可以看到，双金属材料的复合，在等离子共振吸收调控方面具有无可比拟的优势，通过双金属的复合能极大地提高SERS增强效果。半导体与金属的掺杂，可提高基底的化学增强效应，并拓展SERS复合基底的催化效能，甚至可使基底具有自清洁效应。磁性纳米复合材料通过外加磁场使携带有目标物的磁性纳米颗粒产生定向的磁力作用，可实现对待测物的高效分离富集，极大地简化复杂基质样品前处理过程并增强待测物组分的SERS光谱信号，有效提高检测灵敏度。石墨烯纳米复合材料能改善金属基底的吸附效能，降低荧光背景，其具备电磁增强与化学增强的协同作用，可进一步提高SERS基底的增强效应。
微流控SERS芯片的核心是将纳米增强基底微结构与微流体通道有机融合，所采用的纳米增强材料、纳米颗粒的形貌、纳米结构的尺寸和间距等都是决定着微流控SESR芯片检测效率的关键因素。用微流控芯片取代传统的样品载体进行SERS检测，具有操作连续一体化、样品消耗少、环境可控且适于生化样本等优点。
2.3.1基于待测物与纳米溶胶混合的微流控SERS芯片
将纳米金属溶胶通过外部注入的方式引入微流控芯片，使其与待测物进行有效混合，进而实现SERS光谱检测。这种外部注入模式操作简单方便，但是其灵敏度和重复性很大程度上依赖于被分析对象和金属纳米粒子间的有效接触和混合。按照有无外界能量驱动的方式，芯片微通道中的混合过程可分为被动混合和主动混合两种。
被动混合式芯片通过合理设计流体通道的内部结构和几何特性，改变流体的流动方式，增大混合面积来提高混合效率，具有操作简单灵活的特性。Lee等［32］研制的锯齿形聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控通道，如图1（a），可用于高效混合孔雀石绿（MG）和AgNPs，基于SERS对水中MG进行检测的检出限低至12×10-12mg/L。Yea等［33］在含有类似鳄鱼齿形的PDMS微流体通道内，使用SERS光谱技术对水体污染物中的氰化物进行检测，检测灵敏度达到0.5×10-4mg/L水平，如图1（b）。
图1集成混合微通道的微流控SERS芯片示意图［32-33，35-36］
Fig.1MicrofluidicSERSchipintegratedwithmixedmicrochannels［32-33，35-36］
主动混合式芯片则是通过外力（包括电场、磁场、蠕动泵等）的作用在通道内使液体间产生相互运动来达到混合的效果［34］。虽然主动混合的混合效果优于被动混合，但是主动混合式芯片的制备更加复杂，因此根据需求选择合理的混合方式是非常有必要的。
液滴微流体芯片为改善颗粒混合性能提供了新的途径，待测样本在液滴内发生对流流动，可以直接促进其与纳米胶体溶液的混合，避免纳米粒子在连续流动状态下沉积聚集，以及在微通道壁上造成的“记忆效应”等对测定结果产生干扰。Hidi等［35］研制的液滴SERS微流控芯片（图1（c））被用于检测人体尿样中的硝基唑啉（NTX），其检出限为0.57mg/L，线性范围为0.81~8.13mg/L。该平台不仅实现了高通量的多路检测，而且避免了样品的交叉污染。Gao等［36］在如图1（d）所示的液滴微流控芯片上利用SERS光谱技术对血清中前列腺特异性抗原（PSA）进行了检测，其检出限低至10-4mg/L。
2.3.2基于微通道中固定有序纳米基底的微流控SERS芯片
图2微通道中集成有序纳米基底的微流控SERS芯片［41-45］
Fig.2MicrofluidicSERSchipbasedonfixedorderednano-substrateinmicrochannel［41-45］
采用“原位制造”方式获得的微流控SERS芯片，是指直接在微流控通道中进行SERS增强基底的制备，并可在固定的微纳米结构处同步实现待测样本的SERS光谱检测，常用的制备方法有化学法和飞秒激光技术等［46］。
我们课题组［47-49］通过自组装-化学镀法在微流控通道中原位制备了多种SERS基底，其中制备的Au@Ag/TIO2NTs基底对罗丹明6G的最低检出限为10-10mol/L，增强因子为1.15×108。Parisi等［50］首先通过原位电沉积Cu核/C鞘纳米墙，随后采用置换法原位合成Ag纳米颗粒从而制备了新型纳米墙结构的微流控SERS芯片（图3（a））用于结晶紫检测，检出限达5×10-11mol/L，SESR增强因子达1.16×109。Wang等［51］采用化学置换方法，在微通道内制备三维Ag枝晶（图3（b））用于阿莫西林的SERS检测，检测限达到10-3mg/L。Lawanstiend等［52］通过化学还原法将AgCl还原为Ag，在微通道中原位制备了具有SERS活性的介孔Ag结构，对唾液中的硫氰酸盐的检测限达到了10-7mol/L。
图3基于微通道中原位制备有序纳米基底的微流控SERS芯片［50-53］
Fig.3MicrofluidicSERSchipbasedonin-situpreparationoforderednano-substrateinmicrofluidicchannel［42-43，45-46］
飞秒激光技术是另一种可用于在微流控通道中原位制备三维复杂纳米结构衬底的更新颖、强大的技术，其优点主要是可以在微流控通道的任何位置精确而灵活地形成各种图案的纳米结构。Xu等［53］将银盐溶液注入芯片的微通道，利用飞秒激光脉冲聚焦于所需位置，将Ag+还原制备得到银纳米板，如图3（c）。后来，他们课题组［54］用相同的方法制作了银微花阵列，如图3（d），用于原位监测4-硝基苯酚（4-NP）还原反应，对其还原产物4-氨基苯酚（4-AP）实现了监测。Xie等［55］利用激光热效应催化原位制备得到高度可控、灵敏的3DAg@ZnO纳米簇SERS增强基底，由于纳米簇完全在激光光斑范围内生长，因此通过移动激光束可实现对三维Ag@ZnO纳米簇结构位置的编程控制。
在微通道中原位制备SERS基底可使SERS检测模式与微流控技术实现完美结合，使整个分析芯片具有多功能一体化和整体集成化的特性。原位制备SERS基底的微流控SERS系统可以实现更可控、更灵活的纳米结构基底制备，提供固定的热点，使样本的SERS信号具有更好的稳定性和重现性，检测灵敏度也更高。并且固定的微纳米结构可进一步修饰改性，在生化样本的检测灵敏度和选择性提升方面显示出强大优势。但是这种SERS基底的集成模式对纳米微结构制备技术要求较高，同时芯片的清洗难度大，难以重复利用。
由于致病菌生物组成复杂且光谱信息丰富，大多数生物分子拉曼散射截面相对较小，实际样品中存在致病菌样本量低、背景干扰复杂、菌种难辨识、菌量测试等问题［56］，使得现有的分析测试技术面临巨大挑战。将微流控芯片分析与纳米技术进行有机融合，为在微芯片上实现生化样本的SERS光谱检测提供了更多的可行性，也为解决生化样本中致病菌快速辨识和监测难题提供了新路径和发展空间。
Walter等［9］利用微流控SERS芯片采集了9个不同大肠杆菌菌株的11200个SESR光谱，建立了SVM分类模型，对9种大肠杆菌的分类正确率为92.6%。Mungroo等［61］以银纳米颗粒为增强介质构建了微流控SERS芯片测试系统，结合PCA-LDA分析方法，对大肠杆菌、鼠伤寒链球菌、肠炎链球菌、铜绿假单胞菌、单核细胞增生性乳杆菌、英诺克李斯特菌、MRSA35和MRSA86这8种病原菌实现有效辨识。Mühlig等［62］设计了一种封闭液滴SERS芯片，采集了6种分枝杆菌的SERS光谱，利用PCA-LDA分析方法，成功区分了这6种细菌，分类正确率高于93%。SERS的光谱分析技术可以快速准确地实现致病菌鉴别，但将SERS光谱分析技术作为临床上可靠快速的致病菌鉴定手段，尚有许多工作需要完善，其中最重要的就是建立和完善细菌的标准SERS图谱数据库，而这需要众多科研工作者的共同努力。
在实际生化样本检测中，细菌浓度低及复杂的背景干扰是制约致病菌快速定量检测的最大难点之一，微流控SERS芯片能够将致病菌的分离、富集及检测集中到一个平台上，从而更加快速、灵敏地实现对实际样本中致病菌的检测。
3.3.1微流控SERS芯片上致病菌的分离富集
致病菌浓度在实际生化样本中通常很低［18］，因此对致病菌进行分离富集并减少实际样品中的杂质干扰，进而获得可靠的致病菌指纹图谱是进行后续光谱分析与处理的前提。微流控SERS结合了微流控的微型、高效、自动化和SERS的高灵敏度等优势，可以在微流控芯片上进行细菌分离、富集等预处理，然后进行高灵敏度的SERS检测，从而实现致病菌的快速检测识别。微流控芯片中细菌富集方法可以分为两种，分别是被动分离富集（过滤、惯性微流等［63-64］）及主动分离富集（离心沉降、介电电泳、光微流控、磁分离富集等［65-67］）。
被动分离富集是指无外加能量而实现对细菌的分离富集，当前最成熟的方法是多孔膜过滤法。图4为用于细菌分离富集和检测的微流控SERS芯片［68-70］。Krafft等［68］设计了一种利用纳米孔膜实现细菌富集和SERS检测的三维微流控芯片，如图4（a），其由纳米多孔膜连接的两个垂直微通道组成，样品在多孔膜上被电驱动而流动，将待测细菌和AgNP簇在多孔膜上捕获、浓缩并进行原位SERS检测，实现了饮用水中大肠杆菌（2.47×108Cells/mL）和台湾假单胞菌（3.8×107Cells/mL的快速检测。Chang等［69］设计了集成膜过滤和SERS增强基底的微流控系统，如图4（b），在芯片上进行了大肠杆菌的富集、代谢物收集和原位SERS测量，对大肠杆菌的最低检出限为103CFU/mL，比离心纯化过程降低了4个数量级。尽管基于过滤膜的微流控芯片制备比较简单，但是却存在吞吐量较低、不可重复使用以及对粘稠度高的生化样本不适用的问题［71］。
图4用于细菌分离富集和检测的微流控SERS芯片［68-70］
Fig.4MicrofluidicSERSchipforbacteriaseparated，concentratedanddetection［68-70］
主动分离富集是指通过外加能量，如外加电场、磁场、激光操纵、声表面波等实现对细菌的分离富集。Cheng等人［70，72-73］研制了多种DEP微流控SERS芯片对细菌进行分离、富集和SERS检测。他们通过在同心圆微流控器件的中心电极上制作纳米Au，如图4（c），在外加电压下可从人体血液中快速提取稀有病原菌，并使其富集于芯片SERS增强基底位置上进行SERS检测，利用获取的SERS光谱成功识别出了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌，三种菌的的检出限分别为3×103、1×104和5×103CFU/mL［70］。Witkowska等人［74］利用磁分离微流控芯片将牙龈卟啉单胞菌从复杂样本中分离出来，获得了更好的牙龈卟啉单胞菌SERS信号。
3.3.2基于SERS-Tag的致病菌的高效定量检测
微流控SERS芯片能够提供一种高灵敏度及可重复性的检测条件［67，75］，同时集成微流控SERS平台可以避免光谱干扰，提高细菌检测的灵敏度，因此将SERS和微流体器件结合是实现灵敏检测、可重复性测量及良好定义空间检测区域的理想平台［37］。当前致病菌主要依赖于SERS标签（SERS-Tag）进行定量检测。
Madiyar等［77］报道了一种DEP微流控SERS芯片，通过在微流控芯片底部嵌入垂直排列的碳纳米纤维电极阵列，将SESR-Tag标记的大肠杆菌捕获和浓缩到200μm×200μm区域上进行SERS检测，实现了对大肠杆菌的定量检测，检测限低至210CFU/mL，线性范围为5~109CFU/mL。Shi等［79］设计了一种基于SERS的横向流动免疫分析法的生物传感器用于快速检测生物样品中的大肠杆菌O157∶H7。通过制备经两层拉曼报告分子DTNB和单克隆抗体修饰的金壳二氧化硅核纳米球结构作为SERS-Tag，与大肠杆菌O157∶H7有效结合后，在测试纸上形成三明治免疫复合物。通过测量DTNB的特征峰强度，可以轻松实现对大肠杆菌O157∶H7的定量检测，对PBS溶液中的大肠杆菌O157∶H7的检测限低至50Cells/mL，对自来水、牛奶、人尿、生菜提取物和牛肉等生物样品中大肠杆菌O157∶H7的检出限为100Cells/mL。Catala等［78］设计了一种用于快速超灵敏定量检测人体体液中金黄色葡萄球菌的微流控芯片，通过检测经抗体或适配体功能化的SERS-Tag的报告分子MBA在1078cm-1处的拉曼峰的强度，实现了对尿液、血液、胸膜积液及腹水中金黄色葡萄球菌的检测，浓度低于15CFU/mL。
集成微流控SERS芯片检测方法和技术具有多功能单元的集成、较少的样品量及微流体的一体化控制等优势，可为致病菌的高灵敏度、快速和高通量分析测试提供更好的平台，在致病微生物检测中具有良好的应用前景。
但是，集成微流控SERS芯片用于广泛的应用检测仍然面临诸多难题和挑战。现有研究显示，多数集成SERS的微流控芯片存在着信号重复性低和被分析物污染的问题。对于复杂样品，目标分析物与其它混合物的拉曼光谱可能有严重重叠，这时就需对目标物进行分离、富集等预处理，但是如何设计不同的功能区构型，实现芯片上样品的预处理和高通量、高灵敏度的SERS检测，建立集成SERS微流控芯片分析系统和方法，还需要进行大量的探索。