图1.经典量子点结构示意图包括内核、
外壳及有机表面覆层[ZhangY2012]
量子点由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激发后发射荧光。量子点所具有的独特性质是基于它自身的量子效应，当颗粒尺寸进入纳米量级时，尺寸限域将引起尺寸效应、量子表面效应、小尺寸效应、介电限域效应及宏观量子隧道效应，从而展现出许多不同于宏观材料的光学性质。正是由于量子点的独特特性，在生物医学光电领域有特殊的应用价值。正因为如此，2003年，权威《Science》杂志将量子点列为当年度的十大科技突破之一，2006年，另一权威杂志《Nature》将量子点评为最有可能实现大规模应用的四类纳米材料之一。
二、量子点特性
1．荧光发射光谱可调谐
量子点的荧光发射波长可以通过改变量子点的粒径尺寸和其化学组成来“调谐”，即量子点的发射波长可通过控制其粒径大小及组成来实现。量子点的尺寸大小决定了量子点的荧光颜色。量子点的粒径越小，比表面积越大，表面能越高，量子点吸收和发射的能量越大，因此其发射光谱向高能方向移动，即向短波长方向蓝移；反之，量子点吸收和发射的能量越少，其发射光谱向低能方向移动，即向长波长方向红移。例如，用同一波长的光照射不同粒径的CdSe/ZnS量子点，即可获得从蓝色到红色几乎所有波长的光（图2）。同样道理，量子点的化学组成不同，其荧光发射波长可调节的范围也不同，例如CdSe量子点的荧光发射光谱在430~660nm范围可调，CdTe量子点在490~750nm范围可调，而InP量子点的调节范围为620~720nm（图3）。
图2.UV激发CdSe/ZnS量子点所发出的10种
不同波长的发射光[XingY2008]
图3.各种量子点的应用领域及光谱覆盖范围[MedintzIL2005]
2．激发谱带宽而连续
传统荧光染料的激发波长范围很窄，不同荧光染料必须用特定波长的激发光源才能激发，所以要得到不同颜色的荧光，就必须选择不同的荧光染料并且选择多种激发光源；量子点的激发光谱宽且连续分布，任何波长小于其发射波长10nm的激发光源均可用于激发其荧光，这也意味着量子点对激发光源的要求比较低（图4）。
3．荧光发射谱带窄而对称
量子点的发射光谱窄且峰型完美对称分布，半峰宽最窄可达30nm左右，狭窄的发射峰可以确保同时激发多种不同发射波长的量子点，而使发射峰几乎不会出现重叠，或者存在很小的重叠，荧光谱容易区分和识别，从而避免了光谱干扰，使多组分同时检测变得容易；而传统有机染料发射峰的半峰宽很宽，通常在100nm左右，对称性差且大都有严重的拖尾现象，容易发生光谱重叠，大大限制了可以同时使用的荧光探针的数量，不利于分析检测（图4）。
4．斯托克斯位移较大
量子点的斯托克斯位移（StokeShifts）较大，最大甚至可以达到300-400nm，可以有效避免激发峰与发射峰的重叠；而传统的荧光染料的斯托克斯位移较小，激发谱带与发射谱带之间会存在很大程度的重叠（图4）。利用荧光进行检测等操作会带来不可避免的干扰。而量子点恰能克服传统荧光染料的这一缺点，可以更好的用于多重检测，相互之间的干扰小。
图4.一种常规荧光素（A）和水溶性量子点（B）的
激发波长（点线）和发射波长（实线）[XingY2008]
5．荧光强度高
量子点具有非常高的激发重叠区，这意味着它们能吸收大量的激发光；量子点具有很高的荧光量子产率，因此它们能发射大量它们所吸收的光。这两个因素导致量子点的荧光强度高，其荧光强度是有机染料的几十倍乃至几百倍。例如粒径为4nm的CdSe量子点的发光强度相当于罗丹明6G分子的20倍，这就大大提高了量子点灵敏度。
6．荧光寿命长
7．光稳定性强
图5.量子点605(a)和Alexa-488染料(b)的
光稳定性比较[MedintzIL2005]
8．生物相容性好
每种有机荧光染料的分子结构都不同，而要应用到实际检测中，有机荧光染料必须与生物分子进行偶联，这导致与不同有机荧光染料偶联时都需要采用特定的方法才能相互连接，大大增加了工作量。量子点通过修饰，可以使其表面带有羧基、巯基和氨基等多种化学功能的基团，可以与生物分子或配体进行偶联，生物兼容性好，其细胞毒性低，对生物体危害小，使生物活体标记和多功能检测成为可能。量子点这种良好的生物相容性，是许多有机荧光染料难以具备的。
三、量子点合成
1993年随着化学合成技术的发展，才真正突破了量子点化学合成的瓶颈问题，并陆续建立了许多量子点合成方法。这些方法可分为物理方法、化学方法及生物方法三大类。物理方法如研磨、气相沉积以及超声法等一般需要专门的仪器或设备，不易大规模推广使用，因此，目前在量子点合成中广泛采用的是化学方法。化学方法包括气相沉积法、溶胶法、电化学沉积法、微乳液法和溶胶凝胶法等。近年来，溶胶法成为目前应用最广泛的荧光量子点制备方法。溶胶法主要是利用前驱体在适宜的条件下进行晶体生长来制备量子点，并通过加入配体来控制其生长速率和粒子尺寸。溶胶法使用较广泛的主要是两种方法：一种是在有机溶剂中利用胶体化学的方法合成油溶性的量子点；另一种则是直接在水溶液中合成水溶性的量子点。
1.金属有机合成法
有机金属法是目前合成量子点最重要最常用的方法之一，也是迄今为止合成高质量量子点最成功的方法。该方法主要经历了利用有机金属化合物作为前驱体的有机金属法和改进后利用无机金属化合物作为前驱体的“绿色化学”法两个重要的发展阶段。
＂绿色化学＂法是彭笑刚在2001年提出的，是对有机金属法的改进，其特点是用一些毒性较小的前驱体及溶剂进行反应[PengZA2001]。采用更为绿色的也更普通的氯化镉（CdCl2）或者醋酸镉（CdAc2）等无机金属前驱体替代高毒性、价格昂贵且易爆的二甲基镉，仍然利用高温（250-300℃）使纳米晶快速成核及生长，同样得到尺寸分布非常均一的CdSe和CdSe量子点。Peng方法的优点在于摒弃了高毒性的有机镉，反应不需要严格的无水无氧条件，并且反应温度较低，为量子点的合成开辟了一条“绿色”途径，在量子点合成的发展史上同样具有划时代的意义。在此基础上，世界各地的学者相继利用长链的酸、氨及磷酸作为配体，在非配位性的溶剂十八烯（ODE）或长链烷烃（如液体石蜡）以及氢化三联苯（T66）等高沸点有机溶剂中合成了一系列高质量的量子点（如PbSe、InP、InAs、CdS、ZnSAe、ZnS等）。这种方法不仅降低了成本和对设备的要求，更重要的是减少了对环境的污染。有机绿色化学法的这些优势使它成为了制备油相量子点的主流方法，目前己经合成出了一系列的II-VI及III-V族量子点、纳米棒及量子阱等。
2.水相合成法
尽管采用金属有机相合成方法能得到高质量的荧光量子点（荧光量子效率60-85%，荧光光谱半峰宽25-40nm)，但所得到的量子点是油溶性的，仅能分散在非极性或极性较弱的有机溶剂中，因此并不能直接作为荧光探针在生物等方面应用。油溶性的量子点需要通过表面修饰或配体交换形成水溶和生物兼容性的量子点。但是量子点表面修饰或配体交换过程相对比较繁琐，而且会造成量子点量子产率降低和荧光稳定性减弱。因此，发展直接在水相中合成荧光稳定性好和荧光量子产率高的量子点，逐渐成为量子点合成方面的研究新热点。
3.生物合成方法
四、量子点核壳结构包覆
五、量子点表面改性
直接在水溶液中合成量子点尽管具有低毒、操作简单、成本低廉等优势，但与在有机溶液里面合成的量子点相比，直接合成的水溶性量子点仍有晶型较差、粒径分布较宽及量子产率较低等缺点，其光学性能明显要比油溶性量子点要差。在高温有机相中合成的油溶性量子点虽然发光效率较好，但其表面覆盖一层疏水的非极性有机配体，如三正辛基氧化膦（TOPO）、脂肪酸、脂肪胺等，这使得油溶性量子点易溶于氯仿、正己烷等非极性溶剂，但并不能直接溶于水中，而量子点在很多领域的应用最终都是要在水溶液中实现的，尤其是在生物医学领域的应用。另外，由于目前大多数量子点都含有镉，而镉元素作为一种最常见的重金属，对环境和生物体均有很大的危害。由于量子点有非常大的比表面积，导致其表面会存在较多的表面陷阱（通常为表面缺陷及悬挂键）。量子点的表面陷阱会捕获电子或者空穴从而产生非辐射跃迁，减少辐射复合，因此极大地降低量子点的量子产率及由于非辐射复合导致的荧光闪烁等行为。因此，对高温有机合成方法得到的油溶性量子点进行表面功能化修饰，不仅可以克服量子点本身的不足，更重要的是使之发生相转移而具有水溶性，为量子点在各领域的广泛应用奠定了基础。
近年来，随着量子点在生物标记应用中的迅速发展，对量子点进行表面修饰逐步成为研究热点。人们渴望寻找一种理想的修饰技术，理想的功能化修饰必须具备如下优点：
（1）单分散性好，无聚集；
（2）可以将溶于有机溶液的量子点有效地转变为水溶性；
（3）保持量子点原有特异光学性能；
（4）具有良好的生物相容性；
（5）可以保持量子点的荧光量子产率；
（6）外部的修饰层尺寸不能过度的增大量子点的尺寸；
（7）不能对偶联的生物分子活性产生负面的影响。
目前，已经建立成熟的量子点表面功能化方法大体上分为三种：表面配体交换、聚合物包覆及二氧化硅包覆。
1.表面配体交换
用亲水性的巯基或其它极性取代基与油溶性量子点相互作用，从而替换油溶性量子点表面的疏水基团，使量子点表面带上电荷，提高了量子点的水溶性。表面配体交换因其方法简单而且可以在配体表面进一步修饰其它分子而得到了广泛探讨。最初，单配位的巯基被用作亲水性的交换配体，包括疏基丙酸、巯基乙酸、巯基乙胺、巯醇等有机分子及谷胱甘肽、半胱氨酸和组氨酸等生物分子。研究发现，这种单巯基配体包覆的量子点有时稳定性较差，与量子点表面的金属结合力较弱，容易从量子点表面脱落，导致量子点聚集。ClappAR等人利用二氢硫辛酸(DHLA)双齿配体表面修饰CdSe/ZnS量子点，双齿配体协同结合在量子点表面，有效提高了量子点的稳定性[ClappAR2006]。在此基础上，研究者们继续探索，发现多齿配体（巯基小分子的聚合物），可以进一步提高量子点的稳定性。但是由于主要是依靠静电吸附，导致对细胞的非特异性吸附仍较高。研究发现将PEG链段嵌合在高分子链段中，则得到PEG化的多价配位高分子，进一步提高量子点的稳定性，高分子中的PEG链段可以进一步增加量子点在水溶液中的胶体稳定性，同时还可以抑制量子点的非特异吸附。
2.聚合物包覆
3.二氧化硅包覆
目前，常用的二氧化硅包覆方法有两种：1）采用含疏基的硅烷取代量子点表面原来的油溶性配体包覆二氧化硅：因为是取代原先表面的配体，这种方法对量子点的光学性质有一定的影响；2）在原有量子点表面直接包覆二氧化硅：这种方法首先是利用两性的表面活性剂得到含有量子点的胶束，由于量子点表面原有的配体是油溶性的，量子点可以进入这种表面活性剂胶束中，然后通过将有机硅烷分子吸附到量子点表面而在量子点外形成二氧化硅壳层，这样量子点就分散在了水中。这种包覆二氧化硅的方法由于没有破坏量子点表面原有的配体而较好的保持了量子点原来的发光性能。
通过将油溶性量子点包裹到二氧化硅的内部，具有以下特点：
（1）可以进一步降低量子点的毒性，有效改善量子点的生物相容
性和荧光稳定性，防止量子点在应用环境中降解；
（2）量子点在应用时若不经过处理很容易发生聚集，而二氧化硅
的包覆作用可以减低量子点颗粒的等电位，提高分散性，防止量子点彼此团聚；
（3）二氧化硅的透光性也较好，可以用于调节光电器件中封装材
料和内部发光颗粒（如量子点）的折射率，从而提高透光率；
（4）二氧化硅表面含有丰富的官能团，便于连接含有各种不
同官能团的硅烷偶联剂进行功能化。
以上这些特点使得二氧化硅成为一种理想且廉价的表面修饰材料。但是，二氧化硅包覆步骤繁琐、包覆可控性较差，特别是包覆过程中所用到的碱性催化剂、硅烷前驱体及表面活性剂等试剂均会影响量子点的荧光量子效率，甚至导致荧光淬灭，产物的荧光性能往往较差。为解决这些问题，研究者们仍然在做不懈努力。
以上三种量子点功能化的方法都能使量子点从油相成功地转移至水相溶液中，所以我们需要根据量子点的用途来选择合适功能化的方法。这三种方法最大的区别在于：第一，就是功能化的量子点的尺寸不同，配体交换后的量子点的尺寸几乎没有变化，而包覆量子点的尺寸变大，是因为在油溶性量子点的表面增加了两亲聚合物和二氧化硅的厚度；其次二氧化硅或两亲聚合物包覆的量子点是在其表面形成壳层结构，提高了其对酸碱溶液的稳定性和抗光漂白能力；最后，在生物应用领域中，两亲聚合物和二氧化硅包覆的量子点比短链功能化的量子点毒性更低。
六．量子点工业应用
由于具有独特的依赖于粒径和形貌的吸收性质，量子点也被广泛的用作光俘获剂而用于量子点－敏化的太阳能电池。目前，已经有多种量子点材料被证明可用作太阳能电池以及光解水产氨的敏化材料，例如ZnO、ZnS、CdSe、CdS以及CdTe等。
七、量子点在生物医学上的主要应用
图6.以“quantumdot”为关键词检索PubMed收录的全球范围和我国学者发表的论文
表1.各种量子点与生物分子连接方式优缺点比较
量子点进行生物医学研究的面临的首要问题，就是量子点与生物分子的有效交联。目前已经建立起来的标记方法包括配位取代法、静电相互作用法、共价偶联法以及亲和组装法等。这些标记方法的优缺点及其主要应用范围见表1。
抗体是生物医学特别是诊断领域最常用的分子，因此有关抗体和量子点交联的问题，也是最活跃的领域，在长期的研究中，已经建立起多种量子点与抗体的偶联方式：
1）量子点表面的氨基与抗体片段上二硫键还原生成的巯基连接（图7a）：此种方法需要将抗体还原成单链抗体进行标记，标记效率较高，ThermoFisher公司开发出了基于此方法的商品化标记试剂盒；
2）量子点表面的羧基与抗体片段上的氨基缩合（图7b），尽管标记过程比较复杂，但因为标记效率较高，而且试剂准备比较简单，只需要EDC和NHS，这是目前最常用的一种标记方法；
3）高碘酸钠氧化法，即量子点表面修饰的酰肼与抗体Fc片段上的醛基反应进行定点连接（图7c），与目前免疫学中常用的抗体辣根过氧化物酶标记方法类似；
4）NTA-Ni修饰的量子点与带组氨酸标记的抗体连接（图7d），利用6×His标签能与重金属Ni发生结合的原理而设计；
5）链霉亲和素包覆的量子点与生物素化的抗体连接（图7e），这是一种间接标记方法，尤其适用于抗体亲和力比较低或采用上述直接标记方法无效的抗体样本。
图7.量子点与抗体的交联方式[XingY2007]
时至今日，量子点作为荧光标记物，已经广泛应用于生物诊断和治疗的各个领域，限于篇幅，本文我们重点探讨一下量子点在诊断领域（包括体内诊断和体外诊断）的应用进展情况，而这里所说的体内诊断主要是基于量子点的荧光成像。
1.体内诊断
由于量子点发射荧光的过程中，需要使用激发光，但是受到激发光激发时，生物体内的很多物质，如皮肤、毛发或者很多组织也会发光，对信号的检测有一定的干扰。尤其是当需要检测的靶点位于深部组织时，激发光的能量需要很高才可以成功激发量子点的发光，但是由此带来的问题便是非特异性的生物自发光也随之增强。尽管量子点的荧光量子产率较高，但是这种生物体自发光现象对检测的信噪比还是产生很大的影响，就无疑会降低检测的灵敏度。
前面所述，量子点具备独特的光谱可调谐的性能，即量子点可随着粒子尺寸的增大，发射波长也随之增加，通过调整量子点的粒径可使其发射光谱到达近红外区，近红外光也被称为“诊断窗口”，是指波长处于700nm-900nm之间的光。在这个区域内体液中主要成分如水、血红蛋白、氧合血红蛋白与脂肪的吸光系数最小。近红外量子点与可见光量子点相比具有较大的粒子尺寸及在水溶液中更好的稳定性。近红外量子点不仅保留了可见光量子点的全部优势，而且其自身也具有独特的光学特性，更重要的是，近红外量子点具有更强的穿透力，当其应用于肿瘤靶向成像时，可有效地避免生物组织的吸光和自发荧光的干扰。因此近红外量子点已被广泛地应用于医学诊断、生物荧光标记和肿瘤细胞成像中。迄今为止，研究者们已经合成出各种各样的近红外量子点，包括CdTe、CdHgTe、PbSe、PbS、Ag2S、CuInS2、CuInSe2和AgInSe2等。
2.体外诊断
2.1荧光共振能量转移
荧光共振能量转移（FRET）是一种非辐射能量跃迁，当供体吸收一定频率的光子后被激发到更高能级的电子能态上，在电子回到基态前，通过供体-受体偶极之间相互作用，实现了能量向邻近的受体分子的转移，同时供体荧光分子自身的荧光强度下降。
目前随着研究的不断深入，一些长荧光寿命的镧系荧光分子开始作为供体，而量子点作为受体也应用在荧光共振能量转移体系中，此外基于量子点和量子点之间的荧光共振能量转移也逐渐被应用在各种分析检测实验中。同时，更多更有效的受体也逐渐被发现，例如石墨烯、碳纳米管、金纳米球、金纳米棒等具有大比表面积的纳米材料作为受体和量子点共同应用在荧光共振能量转移体系中，由于纳米材料具有大的比表面积和高的表面活性，两种纳米材料的引入可以大大提高检测的灵敏度和检测速度。
虽然基于FRET机理的量子点得到如此广泛的应用，但还是存在自身局限性的。这种局限在于：由于量子点在溶液中以胶体状态存在，量子点的尺寸实际上是比染料分子大的，因此染料作为受体并不能离量子点距离很近，也就是说，即使能量供体与受体距离再小，也是会稍大于量子点的半径的。因此，这会限制组装长波长（发红光的染料）与量子点之间的组装。
2.2生化检测
众所周知，量子点表面有着大量的稳定剂，这些稳定剂不仅通过静电排斥作用保证量子点的稳定性，同时也赋予量子点特异性识别目标分子的特性，并引起量子点响应信号的变化。因此引入的分析对象若能与量子点发生一定的物理、化学作用，从而改变量子点表面的电荷或结构组成，甚至引起量子点的电子-空穴重组，那么就会导致量子点荧光强度的增强或猝灭。
前面我们在量子点表面改性一节谈到，当量子点的表面缺陷通过化学反应和其他分子发生作用后，量子点的表面被钝化，量子点荧光增强，同样，当某些分子通过化学作用将量子点表面的稳定剂剥离，量子点表面产生更多的缺陷，被活化的量子点荧光被淬灭。通过这样的反应机理，量子点经常被用在检测一些氧化性强的小分子，如过氧化氢，并通过一些会产生过氧化氢的反应，来检测各种有机分子、酶或者酶的抑制剂，例如农药等物质。此外，利用金属量子点常常直接作为金属离子传感器来检测溶液中的金属离子，例如Cu2+、Ag+、Zn2+和Hg2+等，由于这些离子和Se2-离子的作用要强于Cd2+离子，因此这些金属离子会取代量子点表面的Cd2+，导致量子点荧光的淬灭。为了提高检测的灵敏度和选择性，许多课题组通过在量子点表面修饰上其他功能化分子构建金属传感器，如多肽、BSA和硫酸基分子等，通过这些基团和金属离子的特异性作用，导致量子点的荧光淬灭。
迄今科学家们已经开发出了多种量子点传感器，检测的指标已经突破了单纯的重金属离子，可以检测的指标包括大多数血气分析项目、酶、蛋白质及葡萄糖等。但是必须承认的是，依赖量子点所建立起的各种传感器由于测试的对象不同，原理和种类各异，没有统一的标准，通用性较差，未来可能需要在某个局部获得突破而率先应用到临床上，在此之前，我们还要做许多探索性的工作。
2.3细胞标记
1998年，Alivisatos和Nie课题组第一次使用量子点探针成功实现了对固定的单层细胞标记以来，许多不同的细胞抗原和组织抗原，在固定后使用量子点探针均可以进行相应的标记，甚至可以标记特质膜蛋白、胞浆蛋白及核蛋白等，并可直接用于高分辨透射电镜观察。研究已经证实，对于固定后的细胞标记，量子点较传统荧光染料更具有优势。最近，多光谱的、可定量的量子点标记技术已经在固定和包埋后的多种组织中实现标记，包括前列腺癌组织、乳腺癌组织及冠状动脉和大动脉等。最新的进展包括使用免疫组织化学进行蛋白质的检测，以及使用量子点技术进行荧光原位杂交以检测相应的核酸均已实现。将量子点基础的荧光探针技术引入病理学及分子生物学领域，必将为这些领域带来革命性的改变。
2.3.1流式细胞检测
尽管量子点在流式多重检测上显示出其巨大的应用前景，但是在其应用到临床之前，仍需要解决几个问题：
1.尽管量子点可以实现多重，但是所有标记物最后都要依赖流式
细胞仪来完成，因此流式细胞仪检测的通道通量有可能是限制量子点多重检测的最重要影响因素。
2.目前有一些抗体仍无法进行抗体的标记，因此需要开发出多种
抗体标记手段及质量控制方法，以适用于不同抗体标记的需要。
3.抗体标记量子点后，应建立规范的纯化和质量控制标准，如果
抗体纯化效果不好，存在未标记抗体的量子点，在做细胞表面标志物时，是很容易清洗掉的，但对于细胞内的染色，游离的量子点由于较普通荧光材料尺寸较大很难清洗掉，这就会引起非常强的背景。
4.量子点与抗体交联后，交联后产物会有很大的空间位阻效应，
这种空间位阻不利于细胞内的染色。
5.有些量子点可能对细胞固定和穿膜试剂敏感，导致荧光强度下
降，因此对于量子点流式检测试剂，要做必要的预实验，确认合适的辅助试剂。
2.3.2免疫组化
尽管量子点在体外免疫组织化学应用上显示出强大的应用前景，而且很快就可以走向临床实用阶段，但是在此之前仍有几个问题需要解决。首先，需要对量子点得到的结果与免疫印迹及PCR的结果做系统性的比对，尽管一些学者已经得到一些比较理想的结果，但这远远不够。其次，需要发展更好的量子点表面改性的方法，从而使量子点表面的活性基团满足大量标记分子的需要，并尽可能减少标记后的空间位阻效应，例如量子点交联后的抗体亲和力仍不受影响。第三，需要引进看家基因蛋白标志物如GAPDH和β-actin等，从而实现每批检测结果的定量标准化。最后，需要制定严格的试验操作和质量控制流程，对量子点免疫组化染色和数据处理过程中的关键环节进行控制。特别是目前还缺少统一标准的量子点抗体标记方法（表2显示出同一实验室不同抗体标记方法获得的数据差异）、组织样本准备、多重染色、拍片以及数据处理方法这对于不同单位之间数据的比对极为重要。上述的这一切意味着获得准确的病理诊断结果对于不同单位和不同单位间数据的比对极为重要[XingY2008]。
表2.Nie实验室汇总的各种量子点与抗体标记方法、
特点以及在IHC应用上的效果比较[XingY2007]
交联方法巯基
（共价）氨基
（共价）Fc-糖
（共价）His标签
（非共价）生物素-亲和素
（非共价）
交联配基抗体片段完整抗体完整抗体scFv或肽完整抗体
位点
特异性是否是是否
配基定向固定随机固定固定固定或随机
Ab/OD比率~4~15~15~3-25<3
染色
特异性中低中等高高
染色亮度低高很高高中
背景噪音低中低低低
特殊条件无蛋白溶液无碳水化合物无无
试剂费用中低中高高
整体效果一般差非常好非常好好
2.3.4荧光原位杂交
2.3.5循环肿瘤细胞检测
2.4量子荧光免疫吸附试验（QLISA）
与非均相的试验如ELISA以及基于量子点的QLISA相比，均相免疫分析是反应达到平衡时，无需对反应平衡后结合的和游离的标记物进行分离，便可以直接进行后续检测，省却了洗涤的步骤，可减少操作带来的误差。由于均相免疫分析不需要包埋、冲洗等多个步骤，通常具有灵敏度高、背景荧光值低、信噪比高、应用范围广、性质稳定、便于操作、易于微型化和自动化等化点。
图8.量子点与螯合物Tb荧光共振能量转移示意图[SilviS2016]
2.6免疫层析POCT
免疫层析（Immunochromatography，IC）是一种将免疫学技术和色谱层析技术相结合的快速免疫分析方法，通过毛细管作用，将样品中待检测的物质（如抗原或抗体）层析泳动至特定区域，通过抗原抗体之间的特异性免疫反应来实现对目的物质进行快速检测。最常见的免疫层析技术主要为侧向流（Lateralflow）免疫层析，通常是将目的抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜的测试带（Ｔ线），同时设立质控线（C线），当样品中的目标物质经过毛细管作用至Ｔ线时，形成抗原－抗体－标记物的复合物，该复合物被固定于Ｔ线处，根据T线和C线的信号，通过肉眼或仪器检测可判定结果。免疫层析检测技术的最突出优势在于对样品的一步法检测，无需分离游离的标记物，具有快速、简便、准确和无污染等优点，对操作人员素质和环境等要求很低。因此，自该技术问世以来，就被迅速、广泛地应用至各个领域，如临床医学检测、毒品检测、食品安全检测、植物病原体检测、药物残留检测等。
表3.量子点优势特性引起的免疫层析性能的提升
量子点优势特性在免疫层析上的优势
·激发光谱宽而连续
·荧光强度是有机染料的10-20倍；·更高灵敏度
·不易受光漂白和光降解，稳定性强·更好稳定性
·荧光寿命长，较常规荧光有50ns延时
·表面修饰后，更好的生物相容性；·更有效的消除生物体背景荧光的干扰，非特异少
·一个激发光激发多种荧光
·激发光谱宽，发射光谱窄而对称
·斯托克斯位移较大·更适合于多指标检测
·多指标检测机器更容易小型化
量子点所具有的特性使其在免疫层析上具有独有的技术优势，量子点荧光强度较高，这会显著提升其检测灵敏度，但仍需要将量子点包裹成微球，才能将灵敏度提高另一个数量级以上的水平。量子点荧光微球不仅具备了量子点本身的各种光学特性，它优于裸量子点的方面更表现在：
第一，它在微球壳结构的保护下具有更为稳定的物化性质及光学性质，受外界条件（溶剂、电、热、磁等）影响小。量子点在条件较苛刻的环境（如极酸或疏水性较大的溶液）中容易发生外层高聚物的脱落而引起不可逆聚沉或荧光淬灭，而微球不存在这一现象；
第二，一个量子点微球内部通常包裹了几十甚至上百个量子点颗粒，其发光强度比单个量子点更大，有利于提高检测灵敏度；
第三，量子点微球的纯化也比量子点更方便。常规量子点在标记过程中只能采用超高速离心或超滤方法回收标记产物，而微球粒径在几十纳米至几百纳米不等，在10000rpm的离心速度就能使微球在常用反应液中沉降，操作极为方便。
同时，我们也应该看到量子点免疫层析所面临的一些问题：
1.量子点的材料制备技术要求较高，国内大多量子点生产企业还
在沿用小作坊式的生产方式，导致生产出的量子点稳定性难以满足IVD对于诊断原料的稳定性要求，导致企业生产出的诊断试剂批间稳定性受到影响；
2.量子点的标记技术要求较高，建立稳定可靠的抗体标记方法，
是生产高质量诊断试剂的必要前提；
3.尽管量子点的荧光强度和光稳定性较强，但仍需要配合高亲和
力高质量的抗体原料，才能生产出高性能的诊断试剂；
4.量子点较以往有机荧光染料最大的优势在于其能形成多重检测，
但在免疫层析现有应用上，还没有将量子点多重检测的优势完全发挥出来。究其原因，可能与仪器研发的滞后有一定的关系，现有的仪器因为成本控制因素，多采用常规免疫荧光的仪器设备检测量子点，这些设备在滤光片的设置上只考虑一种荧光，而缺少真正的用于量子点检测的设备，未来期望能够推出装备多种滤光片检测设备，这样甚至可以在一条检测线上通过抗体和量子点的配伍来检测不同的指标，真正实现量子点的多重化检测。
2.7分子诊断
分子诊断是体外诊断的重大分支，也是这几年和未来几年被行业所普遍看好的体外诊断增长板块。由于量子点具有特殊的荧光性能及FRET，因此可以采用多种形式进行DNA检测，如分子探针标记、高密度芯片、分子信标、核酸免疫层析等方法，但因为这方面研究的报道较少，因此笔者将按照传统分子诊断的应用领域即病原体监测、基因分型、甲基化修饰等来向读者介绍这些研究进展。
2.7.1病原体检测
图9.量子点荧光DNA检测方法原理示意图
跟免疫层析相类似的核酸层析一直是分子诊断POCT追逐的领域。由于常规荧光定量PCR对设备条件的较高要求，学者们一直在探索使用新的技术改进现有PCR以及产物分析过程，并将其应用到现场检测中。核酸侧向层析（NucleicAcidLateralFlowAssay，NALFA）就是将扩增产物应用类似于免疫层析相接近的层析手段进行分析，Chen等人采用抗地高辛抗体捕获地高辛标记的PCR产物，由于产物上携带生物素，因此可以量子点标记的链酶亲和素进行标记，而在C线上则直接用BSA交联的生物素捕获位T线剩余的量子点，根据此方法，可以从人造污染的牛奶和肉的样品中特异性的检测出金黄色葡萄球菌，灵敏度可以达到3CFU/ml和30CFU/g（图10）[ChenX2014]。
此外，编码量子点微球在多元检测中也备受青睐。在这种情况下，聚合物微球首先进行不同序列寡核苷酸功能化，再通过负载不同量子点组分进行不同颜色或不同荧光强度的光学编码。HanM等人是第一个对量子点编码微球进行探索的人。采用6种颜色10种不同密度的量子点，理论上可以至少得到100万种组合。将微球标记上唯一的DNA识别序列，通过杂交，可以特异性的在同一微球上识别微球编码信号和核酸杂交信号，从而鉴定特异性的杂交分子[HanM2001]。在Giril等人最近的研究中，利用九色编码荧光量子点探针实现了艾滋病、疟疾、乙型和丙型肝炎等病原体在内的9种不同基因片段的同时检测，且检测结果具有较高的灵敏度和特异性[GiriS2011]。这预示着量子点编码技术在传染病核酸检测中存在巨大的应用前景。
图10.量子点核酸侧向流层析检测示意图
2.7.2SNP基因分型和基因突变
2.7.3甲基化分析
2.8电致化学发光
量子点的发光性质与量子点的表面状态和大小尺寸有着密切的关系。通过在电极上施加电压后，产生氧化型空穴和还原型电子分别通过电化学氧化还原反应注入到量子点的表面或者中心导带，产生了激发态量子点，当激发态量子点跃迁回到基发态时就产生了电致化学发光，因此量子点成为一种新型的电致化学发光的发光体。
2002年，美国德州大学的Bard课题组首次在Science上报道了Si量子点在有机溶液中的电致化学发光[DingZ2002]，从此，量子点作为一种全新的电化学发光试剂，被引入到电化学发光分析的研究中。此后，该课题组连续报道了CdSe、CdSe、ZnSe和CdTe在有机相中的电致化学发光。这些研究工作奠定了量子点电化学发光的基础，阐述了量子点电化学发光的机理。但由于有机溶剂而限制了其在生物领域的应用，因此水溶性量子点的研究成为热点。该小组在2006年制备了十八烷基包被的水溶性Si量子点，并在含有S2O82-的KOH溶液中发现了SiO2量子点的电化学发光，开拓了量子点在水溶液中的应用。
相对于荧光分析，量子点电化学发光具有以下优点：
1)量子点的通过电化学手段控制，不需要额外的激发光源，背景信
号低，灵敏度高，检测线性范围宽，仪器设备价格低廉。
2)在有机体系中合成的量子点可以直接制备成固态传感器用于相
分析检测物质，而不需要再通过表面改性，避免了降低量子发光效率。
3)不需要很小尺寸的纳米粒子，因而不需要苟刻的合成条件控制量
子点尺寸，荧光很弱或没有荧光的量子点可能具有很强的性质，甚至半导体的本体材料也具有的性质。
虽然量子点的电化学发光在分析领域得到了广泛的应用，但是和传统的电化学发光试剂相比较，量子点的电化学发光强度相对较弱，如何提高量子点的电化学发光强度成为新的研究热点。量子点电化学发光的分析检测方法一般都基于某些物质能够通过电子转移或者能量转移等特异性的增强或淬灭其电化学发光强度。但是由于电化学发光是一个非常复杂而且影响因素较多的体系，电化学发光参数、施加电位、溶液中的共反应物、溶液中是否存在溶解氧、量子点浓度、量子点的种类和量子点的尺寸等均会对量子点的电致化学发光产生不同程度的影响。量子点作为一种易受表面情况影响的纳米材料，明确量子点电化学发光反应的机理对量子点在分析检测领域的进一步应用也有着重要的意义。因此，量子点电致化学发光走向临床应用，目前阶段还不成熟。
2.9微流控检测
八、量子点在治疗上的应用
1.光动力疗法
光动力疗法，是指借助光敏剂进入患者体内后，被肿瘤等细胞选择性吸收，并储存于内部，随后在适当波长局部照射，因光敏剂被激发，产生光敏化效应而产生活性氧等物质，可以致使生物大分子等光氧化失活，因而可以使细胞器损伤而破坏目标组织以达到治疗目的的方法。在光动力治疗中，由于肿瘤细胞等在人体内的深浅不一，使得传统光敏剂的应用受到一定的限制，而量子点由于其纳米尺寸效应，使其吸收光谱能够被调节因而可匹配深浅不同的肿瘤需要，因而，量子点可以直接作为光敏剂或用于能量转移提高传统光敏剂的光动力治疗已被初步研究。量子点可以接受紫外线或红外线的能量（双光子激发）后可以与细胞分子中的氧分子发生能量转移，从而产生具有毒性反应的活性氧（ROS）等，或者被氧化后产生对细胞具有毒性的Cd2+等，促使癌细胞调亡，达到光动力治疗的预期效果。因此，量子点可以作为光敏剂用于光动力治疗，然而大多数量子点含有重金属且释放重金属元素，会对正常细胞产生毒性，因而量子点的毒性是量子点用于临床前必须要解决的问题。
2.药物递送载体
对肿瘤边诊断边治疗是个体化医学一个重要的发展方向，而量子点所具有的独特光学特性，使其成为药物治疗的一个很重要的示踪工具，常用于此类用途的抗肿瘤药物包括阿霉素、顺铂、紫杉醇以及siRNA等。Jing等基于量子点的光学特性，开发了集荧光成像、磁导运载和超声触发释放的多功能核壳胶囊药物输送平台，在该平台上将量子点用于原位监测药物释放的光学信息指标，四氧化三铁用作药物载体的磁性靶向，双层多孔二氧化钛壳作为敏感媒介。二氧化钛的双层壳在超声剌激下破裂时，药物紫杉醇被释放，其破裂程度可以通过超声波频率进行控制[JingYJ2011]。
九、总结与未来展望
量子点材料在过去10年因为技术上的突破，已经应用到生命科学的各个领域，特别是在体内动物造影上，越来越显现出其独特的技术优势，但是由于量子点自身的材料学特点所决定，目前量子点在体内应用（包括体内影像和药物治疗）还仅仅限于试验动物阶段，未来如果应用到临床人体上去，还需要面临并解决许多问题：
1）量子点材料的安全性问题；
2）量子点与体内的血液系统是否会发生凝集反应；
3）量子点与体内的免疫系统是否会发生免疫排斥；
周期、体内器官分布以及体内排泄主要途径、在体内的半衰期等等。
以上这些问题均是量子点真正走向临床体内造影和药物治疗所要面临的问题，在此领域还要做大量的探索性研究工作。
十、参考文献
AdegokeO,ParkEY.Theuseofnanocrystalquantumdotasfluorophorereportersinmolecularbeacon-basedassays.NanoConverg.2016;3(1):32
AkermanMEetal.Nanocrystaltargetinginvivo.ProcNatlAcadSci,2002,99(20):12617-12621
AlivisatosAP.Semiconductorclusters,nanocrystals,andquantumdots.Science1996,271,933-937.
BaileyVJetal.MS-qFRET:Aquantumdot-basedmethodforanalysisofDNAmethylation.GenomeRes.2009Aug;19(8):1455-61
BruchezMJretal.Semiconductornanocrystalsasfluorescentbiologicallabels.Science.1998Sep25;281(5385):2013-6.
ChanWC,NieS.Quantumdotbioconjugatesforultrasensitivenonisotopicdetection.Science.1998Sep25;281(5385):2016-8
ChattopadhyayPKetal.Quantumdotsemiconductornanocrystalsforimmunophenotypingbypolychromaticflowcytometry.NatMed.2006Aug;12(8):972-7.
ChenMJetal.Quantum-dot-basedhomogeneoustime-resolvedfluoroimmunoassayofalpha-fetoprotein.AnalChimActa.2012Sep5;741:100-5
ChenXetal.Developmentofarapidandsensitivequantumdot-basedimmunochromatographicstripbydoublelabelingPCRproductsfordetectionofStaphylococcusaureusinfood.FoodControl46(2014)225e232
ChenZHetal.Anovelhomogeneoustime-resolvedfluoroimmunoassayforcarcinoembryonicantigenbasedonwater-solublequantumdots.JFluoresc.2013Jul;23(4):649-57
ClappAR,GoldmanER,MattoussiH.CappingofCdSe-ZnSquantumdotswithDHLAandsubsequentconjugationwithproteins.NatProtoc.2006;1(3):1258-66.
ColvinVLetal.Light-emittingdiodesmadefromcadmiumselenidenanocrystalsandasemiconductingpolymer.Nature.1994:370,354-357
DingZetal.Electrochemistryandelectrogeneratedchemiluminescencefromsiliconnanocrystalquantumdots.Science.2002May17;296(5571):1293-7.
GaoX,NieS.Quantumdot-encodedbeads.MethodsMolBiol.2005;303:61-71
GazouliMetal.SpecificdetectionofunamplifiedmycobacterialDNAbyuseoffluorescentsemiconductorquantumdotsandmagneticbeads.JClinMicrobiol.2010Aug;48(8):2830-5
GerionDetal.Room-temperaturesingle-nucleotidepolymorphismandmultialleleDNAdetectionusingfluorescentnanocrystalsandmicroarrays.AnalChem.2003Sep15;75(18):4766-72.
GiriSetal.Rapidscreeningofgeneticbiomarkersofinfectiousagentsusingquantumdotbarcodes.ACSNano.2011Mar22;5(3):1580-7
GoldmanERetal.Avidin:anaturalbridgeforquantumdot-antibodyconjugates.JAmChemSoc.2002Jun5;124(22):6378-82.
GoldmanERetal.Multiplexedtoxinanalysisusingfourcolorsofquantumdotfluororeagents.AnalChem.2004Feb1;76(3):684-8.
HanMetal.Quantum-dot-taggedmicrobeadsformultiplexedopticalcodingofbiomolecules.NatBiotechnol.2001Jul;19(7):631-5.
HildebrandtNetal.Quantumdotsasefficientenergyacceptorsinatime-resolvedfluoroimmunoassay.AngewChemIntEdEngl.2005Nov25;44(46):7612-5
HuMetal.Ultrasensitive,multiplexeddetectionofcancerbiomarkersdirectlyinserumbyusingaquantumdot-basedmicrofluidicproteinchip.ACSNano.2010Jan26;4(1):488-94
JingYJetal.Ultrosound-triggeredsmartdrugreleasefrommultifunctionalcore-shellcapsulesone-stepfabricatedbycoaxialelectrospraymethod.Langmuir,2011,27(3):1175-1180
KarakotiASetal.Surfacefunctionalizationofquantumdotsforbiologicalapplications.AdvColloidInterfaceSci.2015
KlostranecJMetal.Convergenceofquantumdotbarcodeswithmicrofluidicsandsignalprocessingformultiplexedhigh-throughputinfectiousdiseasediagnostics.NanoLett.2007Sep;7(9):2812-8
LingerfeltBMetal.Preparationofquantumdot-biotinconjugatesandtheiruseinimmunochromatographyassays.AnalChem.2003Aug15;75(16):4043-9.
MedintzILetal.Quantumdotbioconjugatesforimaging,labellingandsensing.NatMater.2005Jun;4(6):435-46.
MurrayCB,NorrisDJ,BawendiMG.SynthesisandcharacterizationofnearlymonodisperseCdE(E=sulfur,selenium,tellurium)semiconductornanocrystallites.J.Am.Chem.Soc..1993,115,8706-8715
PengZA,PengX.Formationofhigh-qualityCdTe,CdSe,andCdSnanocrystalsusingCdOasprecursor.JAmChemSoc.2001Jan10;123(1):183-4.
PisanicTR2ndetal.Quantumdotsindiagnosticsanddetection:principlesandparadigms.Analyst.2014Jun21;139(12):2968-81
RajhTetal.Synthesisandcharacterizationofsurface-modifiedcolloidalCdTequantumdots.JPhysChem,1993,97:11999-12003
RieggerLetal.Read-outconceptsformultiplexedbead-basedfluorescenceimmunoassaysoncentrifugalmicrofluidicplatforms.Sens.Actuat.A2006,126,455-462.
RogachALetal.Synthesisandcharacterizationofasizeseriesofextremelysmallthiol-stabilizedCdSenanocrystals.JPhysChem.1999,103(16):3065-3069
ShiCetal.QuantumDots-basedmultiplexedimmunohistochemistryofproteinexpressioninhumanprostatecancercells.EurJHistochem,2008,52(2):127-134
SilviSetal.InterfacingLuminescentQuantumDotswithFunctionalMoleculesforOpticalSensingApplications.TopCurrChem(J).2016Oct;374(5):65
SpanhelLetal.PhotochemistryofcolloidalsemiconductorssurfacemodificationandstabilityofstrongluminescingCdSparticles.JAmChemSoc.1987,109(19):5469-5655
VannoyCHetal.BiosensingwithQuantumDots:AMicrofluidicApproach.Sensors2011,11,9732-9763
WuXetal.ImmunofluorescentlabelingofcancermarkerHer2andothercellulartargetswithsemiconductorquantumdots.NatBiotechnol.2003Jan;21(1):41-6.
XingYetal.Quantumdotbioconjugatesforinvitrodiagnostics&invivoimaging.CancerBiomark.2008;4(6):307-19
XingYetal.Bioconjugatedquantumdotsformultiplexedandquantitativeimmunohistochemistry.NatProtoc.2007;2(5):1152-65.
XuFetal.Quantumdot-basedimmunochromatographyteststripforrapiddetectionofCampylobacterjejuni.Journalofnanoscienceandnanotechnology,2013,13(7):4552-4559.
XuHetal.MultiplexedSNPgenotypingusingtheQbeadsystem:aquantumdot-encodedmicrosphere-basedassay.NucleicAcidsRes.2003Apr15;31(8):e43.
YeomSYetal.MultiplexedDetectionofEpigeneticMarkersUsingQuantumDot(QD)-EncodedHydrogelMicroparticles.AnalChem.2016Apr19;88(8):4259-68
Yu-HongWetal.Aquantumdotsandsuperparamagneticnanoparticle-basedmethodforthedetectionofHPVDNA.NanoscaleResLett.2011Jul20;6:461.
ZhangYetal.Quantumdotenabledmolecularsensinganddiagnostics.Theranostics.2012;2(7):631-54
ZhouJetal.TowardBiocompatibleSemiconductorQuantumDots:FromBiosynthesisandBioconjugationtoBiomedicalApplication.ChemRev.2015Nov11;115(21):11669-717.
ZouZetal.Quantumdot-basedimmunochromatographicfluorescentbiosensorforbiomonitoringtrichloropyridinol,abiomarkerofexposuretochlorpyrifos.Analyticalchemistry,2010,82:5125-5133.