Inductionofsecretionofinterleukin8fromlungepithelialcellsbytrypsin
【Keywords】trypsin；epithelialcells;interleukin8;lung
【关键词】胰蛋白酶；上皮细胞；白细胞介素8；肺
0引言
蛋白酶激活受体（proteaseactivatedreceptor，PAR）属G蛋白耦联受体家族中的亚类，目前有PAR144个成员组成，PAR2可在人呼吸道上皮细胞和多种呼吸道肿瘤上皮细胞系表面表达［1-5］.胰蛋白酶主要由胰腺分泌，在体内主要参与肠道消化功能.最近研究表明，胰蛋白酶还是PAR2的激动剂，胰蛋白酶在人PAR2的R34S35LIGKV处切断受体的N末端暴露系锁配体SLIGKV，从而激活PAR2参与肺部炎症［6］，而PAR2的缺乏可以降低气道炎症反应［7］.因此，我们利用人肺癌上皮细胞系A549细胞探讨胰蛋白酶对上皮细胞IL8分泌的影响.
1材料和方法
1.1材料
胰蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、α1抗胰蛋白酶(α1AT)、青、链霉素均购于Sigma公司，DMEM培养液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶EDTA消化液均购自Gibco公司.
1.2方法
1.2.1细胞培养人肺癌上皮细胞系A549细胞（购自中国科学院上海细胞研究所）接种于50mL培养瓶内，用DMEM完全培养液（含100g/LFBS，10×104U/L青霉素和100mg/L链霉素），于37℃，50mL/LCO2培养箱中培养.
1.2.2上皮细胞激发实验待细胞铺满瓶底后，用2.5g/L胰蛋白酶EDTA消化液消化，将获得的细胞分种于12孔培养板各孔内，用1mL完全培养液培养至细胞相互融合后，换无血清培养液培养16h.然后向每孔的细胞内加入不同浓度的胰蛋白酶和/或胰蛋白酶抑制剂进行激发实验.胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶加入细胞前在冰上孵育30min，细胞培养2，8和16h后收集上清液，离心后于-80℃冻存.全部实验为双样，每组实验均重复5次.
1.2.3细胞上清IL8水平检测用人IL8ELISA检测试剂盒（Biosource），检测细胞上清液中的IL8水平，并用酶标仪(MolecularDevices公司)于450nm波长处测定吸光度（A）.
统计学处理：数据以x±s表示，采用SPSS(11.0版)软件进行单因素方差分析，组间方差不齐时采用非参数秩和检验.P
2结果
2.2胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶诱导释放IL8的抑制作用胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶与A549细胞共同培养16h后结果显示：SBTI在浓度为10和30mg/L时可分别抑制胰蛋白酶诱导的A549细胞释放IL8的作用（Fig3）.α1AT在浓度为10mg/L也能抑制胰蛋白酶引起的IL8释放（Fig4）.
3讨论
研究表明，PAR2激活能介导气管平滑肌的收缩、促进炎症性细胞的游走和血管的通透性增加，介
n=5.bP
导嗜酸性粒细胞的浸润［8］，调节血管舒张与收缩，调节消化道和皮肤的功能等［9］.呼吸道上皮细胞PAR2的激活还可导致基质金属蛋白酶（MMP9）［10］、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）［1，2］、酸性粒细胞趋化因子［4］、前列腺素E2（PGE2）、白细胞介素（IL）6等［4］细胞因子的释放，提示PAR2可能参与气道的炎症和重塑.激活PAR2的蛋白酶主要有胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶及凝血因子Ⅶa，Xa［11］.
我们的研究表明，胰蛋白酶对呼吸道上皮细胞IL8的分泌有显著促进作用，表明胰蛋白酶能通过激活PAR积极参与呼吸道的炎症过程，间接证明了PAR在哮喘和慢性阻塞性肺疾病的发病过程中起着一定的作用.胰蛋白酶可引起肺上皮细胞高达5倍的IL8释放，表明它对IL8的释放促进作用是高效的.IL8的释放量高达1.7μg/L，达到了IL8发挥其生理和病理生理功能的浓度.胰蛋白酶抑制剂SBTI对胰蛋白酶诱导IL8释放的抑制作用，表明胰蛋白酶的作用是通过其水解活性实现的，也表明胰蛋白酶抑制剂可能有抗炎作用.α1抗胰蛋白酶对胰蛋白酶诱导的IL8释放也具有抑制作用，它作为机体内源性的胰蛋白酶抑制剂可能在呼吸道的抗炎反应机制中起一定作用.
我们发现，A549细胞系可同时表达PAR14四种受体［12］，而胰蛋白酶既可酶切PAR2又可酶切PAR4从而激活受体，因此，胰蛋白酶引起的肺上皮细胞IL8的释放，是单纯由PAR2或PAR4介导还是PAR2与PAR4同时参与，值得进一步探讨.
【参考文献】
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关键词：重组人Ⅱ型胰蛋白酶；牛胰蛋白酶：性质；应用
人胰蛋白酶有I型和II型2种类型，根据等电点不同，又分为阳离子型和阴离子型。我们用基因工程方法得到了重组人阴离子型胰蛋白酶原(II型胰蛋白酶)，激活后得到高活性的人源胰蛋白酶。由于胰蛋白酶在溶液中稳定性较差，容易发生自降解，使酶活性下降。本实验研究了重组人II型胰蛋白酶的稳定性及部分性质，并初步研究了酶解激活羧肽酶B酶原及在细胞消化中的应用。
1材料
1.1试剂
牛胰蛋白酶(Sigma)；重组人Ⅱ型胰蛋白酶-(本实验室制备)；苯甲酸-L-精氨酸乙酯(BAEE，Sigma)：其余试剂为进口或国产分析纯。
1.2仪器
T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器公司)：FE20型pH计(梅特勒，托利多仪器公司)；EV265双向电泳仪(PS265-230V，Hoefer)
2方法
2.1Jm值的测定
以BAEE为底物，测定重组人II型胰蛋白酶和牛胰蛋白酶的米氏常数Km。底物BAEE的浓度范围为0.005-0.25mmol／L，用双倒数作图法，以底物浓度的倒数值为横坐标，反应速率即活性的倒数值为纵坐标做图，与x轴交点的负倒数即为Km。
2.2重组人lI型胰蛋白酶的最适温度及最适pH
取3mL底物分别置于4，15，20，25，30，40，55，65，75℃保温1h，加入等量的重组人II型胰蛋白酶，测定酶活性。底物用不同pn的20mmol／L乙酸钠一乙酸，Tris-HCl及GIy-NaOH缓冲液配制。测定重组人II型胰蛋白酶活性，确定最适pH。
2.3重组人ll型胰蛋白酶与牛胰蛋白酶热稳定性和pH稳定性
将重组人Ⅱ型胰蛋白酶1mL分别加入不同pH的缓冲液中，配成200U／mL(0.3mg／mL)溶液。缓冲液分别用50mmol／L乙酸钠-乙酸，Tris-HCl和Gly-NaOH，pH
2.4金属离子及化学试剂对重组人Il型胰蛋白酶与牛胰蛋白酶活性的影响
向重组人Ⅱ型胰蛋白酶液(活性860U／mL)分别加入不同金属离子(Zn2+，Mg2+，Ba2+，Mn2+，Ca2+，Fe2+，Cu2+)1mmol／L，4℃保温1h后测活性。重组人II型胰蛋白酶液(活性750U／mE)分别按1％的量加入EDTA(乙二胺四乙酸)，PMSF(苯甲基磺酰氟)，DTT(二巯基苏糖醇)，SDS(十二烷基硫酸钠)，Tritonx，100，4℃保温1h后测活性。另取牛胰蛋白酶粉末按上述方法配成相同活性溶液。
取重组人II型胰蛋白酶分别加入不同浓度(0.5，1mol／L)氯化钠溶液及尿素(1.2mol／L)溶液配制成活性为1200U／mL溶液。4℃放置24h后测活性。另取牛胰蛋白酶粉末配成相同活性溶液，同法操作。
2.5重组人II型胰蛋白酶酶解羧肽酶B动力学研究
2.6重组人ll型胰蛋白酶消化细胞的初步研究
细胞消化液组成：胰酶0.5mg／mL，EDTA0.04g／mE溶于PBS液中，并用盐酸调为pH7.4。所用溶液均经高温灭菌，或者经0.22岫1滤膜过滤。
A组为牛胰蛋白酶组，AI：800U／mL牛胰蛋白酶酶液200μL，EDTA0.04g／nL；A2：800U／mL牛胰蛋白酶酶液100μL，EDTA0.04g／mL。
B组为重组人胰蛋白酶组，B1：800U／mL重组人II型胰蛋白酶酶液200uL，EDTA0.04g／mL；B2：800U／mL重组人1I型胰蛋白酶酶液100μL，EDTA0.04g／mL；B3：400U／mL重组人II型胰蛋白酶酶液200uL，EDTA0.04g／mL。
c组为专用细胞消化液200μL，活性800U／mL，EDTA0.04g,／mL。
3结果
3.1重组人Il型胰蛋白酶和牛胰蛋白酶Km值的测定
结果见图1。由图1A计算可知，重组人II型胰蛋白酶的Km值为12.7μmogL，Vmax为212.76μmol／min。由图1B计算可知，牛胰蛋白酶Km。值为40μmol／L，Vmax为588.23μmol／min。表现出重组人胰蛋白酶对BAEE有更高的亲和力。
3.2最适温度及最适pH的确定
pH对测定活性有很大的影响，pH7.6时酶活性最高，所以pH7.6为胰酶测活的最适pH。见图3。
3.3重组人II型胰蛋白酶与牛胰蛋白酶的热稳定性及pH稳定性
重组人II型胰蛋白酶及牛胰蛋白酶在不同pH条件下活性变化见图5。由图5可见，2种酶的变化趋势基本相同。pH过低或过高都使2种酶活性降低，重组人Ⅱ型胰蛋白酶pH8～9时活性最稳定。牛胰蛋白酶对pH的耐受性要强，pH7～10时牛胰蛋白酶活性只有较小的损失。
3.4金属离子及试剂对胰蛋白酶活性的影响
各种试剂对酶活性的影响见表1。牛胰蛋白酶活性随着EDTA浓度上升丧失增多，1mmol／LEDTA就能使重组人II型胰蛋白酶活性丧失80％。EDTA使酶活性丧失是因酶液中钙离子被EDTA螯合，表明重组人II型胰蛋白酶活性中心的钙离子对酶活性的发挥有至关重要的作用。二者不同可能与牛胰蛋白酶含ca2+有关。PMSF对酶活性有抑制作用，因为PMSF是丝氨酸蛋白酶抑制剂，这也表明胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，活性被抑制。DTT对2种酶的活性也有很大的影响，尤其是对重组人II型胰蛋白酶。1％SDS和0.1％Triton-X100能使酶活性彻底丧失，使蛋白质发生变性。高浓度的NaCl(如0.5mol／L和lmol／L)和低浓度的Urea(如lmol／L和2moFL)对重组人II型胰蛋白酶活性没有影响。表1不同试剂对牛胰蛋白酶及重组人胰蛋白酶活性的
3.5重组人11型胰蛋白酶及牛胰蛋白酶用于羧肽酶原B的酶解激活
用重组人Ⅱ型胰蛋白酶酶解的羧肽酶B的最终比活性是用牛胰蛋白酶酶解样品的1.5倍。由图6可见，重组人离子型胰蛋白酶酶解羧肽酶原B在速率上优于牛胰蛋白酶。由图7可见，羧肽酶原B在加入胰蛋白酶后，逐步酶解为羧肽酶B。所以，我们通过基因工程方法制备的重组人胰蛋白酶在某些方面已经达到甚至超过了市场同类产品。
3.6重组人Il型胰蛋白酶消化细胞初步研究结果
细胞消化效果见图8。经过胰蛋白酶消化作用后，原来贴壁生长的T3细胞从培养瓶壁上脱离，细胞形态从扁平状变成球状，T3细胞之间出现空隙。细胞生长状态良好。
4讨论
胰蛋白酶原具有自身活化和自身降解的特性，在真核系统中表达，很难得到完整的胰蛋白酶原，并且其活化为有活性的胰蛋白酶会对宿主细胞造成一定的毒性。因此，在毕赤氏酵母中天然牛胰蛋白酶没有成功表达。
【关键词】急性胰腺炎尿胰蛋白酶原-2血淀粉酶诊断临床分析
1资料与方法
1.1一般资料
所有患者的血、尿标本均应该在急诊室内采集，先抽取5ml的空腹静脉血，从发病后第3天开始每隔2天进行采集，每次采集应该在2h内完成。应用免疫层析法检测尿胰蛋白酶原-2，试剂由芬兰OYMediaBiochemical公司提供。试纸条有结合在蓝色的乳胶粒上和结合在膜上的两种尿胰蛋白酶原-2抗体；血淀粉酶是采用酶动力学法来判定，仪器是日立7180生化分析仪，试剂由中生北控生物公司提供。
1.3诊断标准
根据中华医学会外科分会推荐的诊断标准诊断急性胰腺炎患者。尿胰蛋白酶原-2检测，如果试纸上同时出现2条蓝色线，浓度>50ug/L时判为阳性，只出现1条蓝色线（参照线）判为阴性。血淀粉酶检测血清AMS的参考上限为100U/L。
1.4统计学处理
选用软件SPSS10.0对观察的数据进行统计学处理，使用t对计量数据进行检验，χ2对计数资料进行检验，P
42例急性胰腺炎组的尿胰蛋白酶原-2中有39例阳性，测阳性率为92.9%，血淀粉酶中有32例阳性，测阳性率为84.2%。其他急腹症组的尿胰蛋白酶原-2的测阳性率为4.8%，只有2例阳性；血淀粉酶的阳性率为26.3%，阳性10例。尿胰蛋白酶原-2的敏感性和特异性分别为92.1%、91.2%，而血淀粉酶的敏感性和特异性分别为81.2%、77.5%，急性胰腺炎组的尿胰蛋白酶原-2及血淀粉酶检测阳性率均明显高于其他急腹症组，尿胰蛋白酶原-2的敏感性和特异性均明显优于血淀粉酶，差异具有统计学意义（P
2讨论
急性胰腺炎是临床上常见的急腹症之一，对患者的正常生活带来很大的困扰，由于该病起病比较急，进展快，早期诊断对于急性胰腺炎的治疗非常重要，目前临床上比较常用的是血淀粉酶的测定，但是胆石症、急性胃肠炎、急性胆囊炎、急性阑尾炎以及肠梗阻患者的血淀粉酶含量也会上升，因此其敏感性和特异性远远不足以应对临床的需求，近年来尿胰蛋白酶原-2凭借其较强的特异性和敏感性在临床诊断急性胰腺炎中得到广泛应用，并且筛选、诊断的准确率和很高。
胰蛋白酶原主要有胰蛋白酶原-1和胰蛋白酶原-2两种类型，主要是由胰腺生成的，其中胰蛋白酶原-2是其主要形式之一，胰蛋白酶原-2的作用机制是：一般机体在正常的情况下由于受到胰腺腺泡内胰蛋白酶的抑制在进入十二指肠前是不会被激活的，但是一旦患者的机体防御功能受到袭击，特别是急性胰腺炎病情发作时胰蛋白酶原就很容易被激活，因为肾小管很难对尿胰蛋白酶原-2进行重吸收过程从而导致血清中的胰蛋白酶原-2浓度明显增高。
本文主要分析探讨尿胰蛋白酶原-2以及血淀粉酶对急性胰腺炎诊断的特异性以及敏感性，研究尿胰蛋白酶原-2的临床诊断价值，结果表明尿胰蛋白酶原-2诊断准确率高，操作简单，是一种很好的筛选、诊断急性胰腺炎的方法，值得在临床上广泛应用和推广。
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[关键词]胰腺癌；血清胰蛋白酶原-2；CA199；CA50；CA242
收集2009年12月～2011年6月总医院、2011年6月～2012年2月北京市石景山医院就诊内、外科未经治疗的胰腺癌住院患者25例为胰腺癌组，其中男14例，女11例，平均年龄（66.36±12.98）岁，入组前均未行手术及放化疗治疗，均由术后病理或影像学资料+长期随访证实。随机选取同期于总医院及石景山医院体检中心进行健康体检的35例为健康对照组，其中男20例，女15例，平均年龄（43.54±11.28）岁，均无明显上消化道症状及胰腺疾病病史；并排除其他肿瘤患者及孕妇、酗酒者、药瘾者。本研究获得上述两家医院伦理委员会伦理审查批准。
1.2标本采集与检测
留取清晨空腹静脉全血4ml，标本经1000×g离心后去上层血清分装至Eppendorf（EP）管冻存于-70℃，检测前1天将冻存标本于4℃冷藏室解冻，检测前取出放置室温（20℃）1h，应用标准ELISA操作流程（双抗体夹心法）检测，采用全自动多功能酶标仪及相应检测统计软件进行分析，胰蛋白酶原-2及CA199、CA242、CA50检测试剂盒由北京永瀚星港生物技术有限公司惠赠，酶标仪为全自动多功能酶标仪（OLY-MPUS5421全自动生化分析仪）。
1.3统计学处理
应用SPSS16.0统计学软件处理数据，绘制受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC曲线），找出最佳截断点（ROC曲线上最左上方的点，此时灵敏度及特异度均较高，或根据文献设定的临界值选取临界点），因数据呈非正态分布，采用中位数、四分位数间距描述各组结果。
各肿瘤标志物ROC曲线如图1。
图1各肿瘤标志物ROC曲线
胰蛋白酶原-2：AUC=0.988，P
2.1血清胰蛋白酶原-2鉴别正常人和胰腺癌的灵敏度和特异度
以点SEN0.960（1-SPE0.086）为最佳临界点，其对应的临界值为1.85ng/ml，ROC曲线下面积为0.988（P
表1两组血清胰蛋白酶原-2含量的检测值（ng/ml）
M：中位数；QL-QU：四分位数间距；Min-Max：最小值-最大值
2.2CA199鉴别正常人和胰腺癌的灵敏度和特异度
当前通常以37U/ml作为胰腺癌诊断临界值，本试验选取最接近点SEN0.88（1-SPE0.171），相应临界值为37.20U/ml，ROC曲线下面积为0.906（P
表2两组血清CA199含量的检测值（U/ml）
2.3CA50鉴别正常人和胰腺癌的灵敏度和特异度
当前通常以20U/ml作为胰腺癌诊断临界值，本试验选取最接近点SEN0.72（1-SPE0.200），相应临界值为19.68U/ml，ROC曲线下面积为0.833（P
表3两组血清CA50含量的检测值（U/ml）
2.4CA242鉴别正常人和胰腺癌的灵敏度和特异度
当前通常以20U/ml作为胰腺癌诊断临界值，本试验选取最接近点SEN0.68（1-SPE0.143），相应临界值为20.45U/ml，ROC曲线下面积为0.834（P
表4两组血清CA242含量的检测值（U/ml）
[参考文献]
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通信作者：祝益民，Email：cszhuyimin@163.com
【关键词】粪弹性蛋白酶-1;胰腺外分泌功能;脓毒症;重症;儿童
Clinicalstudyofthefecalelastase-1levelsincriticallyillchildren
Correspondingauthor：ZhuYiming，Email：cszhuyimin@163.com
以2013年7月至2014年3月入住湖南省儿童医院儿科重症监护病（PICU）的402例重症患儿为研究对象，入选标准：①年龄>28d;②小儿危重病例评分分值≤90，或者小儿危重病例评分分值>90但符合美国危重医学会和美国儿科学会制定的PICU入出院初步指南标准。
分组根据FE-1质量分数分组：>200μg/g为胰腺外分泌功能正常组（A组），100～200μg/g为轻中度胰腺外分泌功能不全组（B组）;<100μg/g为重度胰腺外分泌功能不全组（C组）[6]。
1.2研究方法
1.3FE-1检测方法
粪便储存于-80℃冰箱，检测前置于室温。FE-1的质量分数检测试剂盒购自德国ScheBo.Tech公司。检测原理为双抗夹心的酶联免疫法（ELISA）。粪便于实验前1d提取过夜，使其充分溶解于提取液。次日将粪便提取液稀释，分别加入96孔酶标板，同时进行标准曲线和质控的测定。依照试剂盒检测步骤进行实验，最后于405nm波长读取吸光度值。绘制标准曲线，计算FE-1质量分数（μg/g）。FE-1质量分数正常值为>200μg/g。所有样本由一名实验人员进行检验。
1.4统计学方法
2.1危重患儿一般资料
402例危重患儿中，男性264例（65.67%），女性138例（34.33%）。年龄1个月至13岁8个月，中位数1岁（4个月至2岁）。其中0～1岁203例（50.50%），1～3岁107例（26.62%），4～6岁57例（14.18%），7岁以上35例（8.71%）。根据FE-1质量分数分组，A组（>200μg/g）300例（74.63%），B组（100～200μg/g）52例（12.94%），C组（<100μg/g）50例（12.44%）。三组年龄、性别差异均无统计学意义（χ2=3.386，10.233，P>0.05）。
2.2FE-1水平与胰酶的关系
三组间血淀粉酶≥正常值、血淀粉酶≥正常值2倍、血淀粉酶≥正常值3倍、尿淀粉酶≥正常值比较差异均无统计学意义（P>0.05），而血脂肪酶升高在三组间差异有统计学意义（P<0.01），进一步行三组间两两比较可知，A、B两组间差异有统计学意义（P<0.01），见表1。
2.3FE-1与脓毒症的关系
402例重症儿童中非脓毒症患儿288例（71.64%），脓毒症患儿114例（28.36%），两组FE-1水平差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。进一步将脓毒症患者按严重程度分为一般脓毒症组86例（21.39%），严重脓毒症组16例（3.98%），脓毒性休克组12例（2.99%），随脓毒症程度加重，A组比例下降，B、C组比例上升，严重脓毒症组、脓毒性休克组尤为明显，四组间FE-1水平差异具有统计学意义（P<0.01），见表3。
[2]胡限，祝益民，陈卫坚，等.脓毒症与非脓毒症死亡患儿胰腺功能的病理特征分析[J].中华急诊医学杂志，2014，23（2）：157-162.