β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，β-GC)、醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，ADH)、脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)对红茶香气的形成起着重要作用。β-GC作为一种水解酶，可将糖苷类物质水解成游离态香气，而LOX则将亚麻酸、亚油酸等脂肪酸类物质氧化形成β-氢氧化物，再经脂氢过氧化物裂解酶(hydroperoxidelyase，HPL)催化形成顺-3-己烯醛，最终经ADH的催化还原作用形成顺-3-己烯醇(青叶醇)，再经氧化降解形成小分子的醛、酮、酸等化合物，成为构成红茶香气的物质之一[7-8]。
保靖黄金茶发源于湖南省湘西自治州保靖县葫芦镇黄金村，内含物质丰富，制成的红茶茶黄素、氨基酸、糖类物质含量高，近年来，成为湖南省主要种植及红茶加工的茶树品种。但由于饮茶和消费的影响，黄金茶红茶兴起较晚，加工工艺有待优化，产品品质参差不齐[9]。因此，本研究以保靖黄金茶加工的红茶为研究对象，探究在红茶不同加工过程中β-GC、ADH、LOX的活性及各种香气组分含量的变化，以期进一步丰富保靖黄金茶红茶的品质理论，为其加工过程中的品质调控提供科学依据。
样品加工流程：
取样：于鲜叶、萎凋、揉捻、发酵等4个加工过程取样，取样后将样品迅速用液氮固定、置于-80℃贮存待进一步分析。
5424R型Eppendorf台式高速冷冻离心机，艾本德生命科技有限公司；BiotekEpoch全波长酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；移液枪、96孔板、AE240型Mettler电子分析天平，瑞士Mettler仪器有限公司；DK-S24型恒温水浴锅，上海精宏有限公司；全自动样品快速研磨仪，上海净信实业发展有限公司；QP2010型GC-MS，日本岛津公司；手动SPME进样手柄、50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取头，美国Supelco公司；ADH试剂盒、LOX试剂盒、β-GC试剂盒，苏州科铭生物技术有限公司。
1.3.1β-GC、ADH、LOX活性测定
样品前处理：用离心管称取0.1g试样置于快速研磨仪进行研磨。
酶活性测定：LOX、ADH、β-GC3种酶活性的测定均按照试剂盒步骤操作。
1.3.2香气检测
采用固相微萃取-气质联用技术(solid-phasemicroextraction/GC-MS，SPME/GC-MS)进行分析。
前处理：固相微萃取头经240℃老化45min后备用。称取2g粉碎后的茶样，装入15mL萃取瓶中,以四氟乙烯封口，于80℃恒温水浴中平衡10min，吸附50min后，在250℃下解析5min。
GC条件：石英色谱柱(0.25μm×60.0m×0.25mm)，柱温箱温度：60.0℃，不分流进样，进样量1μL，进样温度250℃，样品流速1.96mL/min，升温程序60℃保留5min，3℃/min升至140℃保留5min，10℃/min升至230℃保留5min，10℃/min升至260℃保留5min，载气为高纯度He。
MS条件：温度200℃，色谱接口温度220℃，电子轰击离子源，质核比范围：45～500m/z。
采用MicrosoftExcel2019、SPSS26软件进行数据归类、分析和计算，Origin2019、GraphPadPrism8.0进行作图。
a-β-GC活性；b-ADH活性；c-LOX活性图1红茶加工过程中纤β-GC、ADH、LOX的酶活性变化Fig.1Changesofβ-GC,ADHandLOXenzymeactivitiesduringblackteaprocessing
本试验共检测到263种香气组分，包括53种醇、53种烯烃、70种烷烃、36种酯、14种酮、17种醛和20种其他类化合物，其中，鲜叶、萎凋、揉捻、发酵等工序中分别检测出138、136、137、122种香气成分。如图2所示，整个加工过程中香气成分以醇类为主，揉捻叶样品中醇类挥发物所占比例最高，其中芳樟醇、香叶醇、四氢-α,α,5-三甲基-5-乙烯基呋喃-2-甲醇、反式-橙花叔醇、苯乙醇相对含量较高；烯烃类在鲜叶中所占比例最高，然后逐渐降低，经揉捻工序后含量略有上升，发酵后又有所下降。值得注意的是，具有花香气味的α-法尼烯是所有样品中含量最丰富的烯烃，其含量显著高于其他样品。酯类所占比例仅次于醇类，在鲜叶中含量最高。令人惊讶的是，在加工过程中，酯类的比例变化与醇的相似，在加工过程中含量变化趋势为从降低到升高再降低；醛类在萎凋叶中比例最低，在发酵叶中比例最高；酮类物质的含量从鲜叶开始至整个加工过程中逐渐升高，并在整个生产过程中保持稳定。此外，烷烃类化合物在鲜叶和萎凋叶中比例较高，揉捻和发酵时含量下降且趋于稳定，从萎凋到揉捻，烷烃类化合物含量降幅约为30%。
从鲜叶状态到发酵结束，香气组成和相对含量均有明显差异，最显著的变化趋势是烷烃类成分、烯烃类和酮类化合物成分相对含量的急剧降低以及香气组分中醛类、酯类等成分的持续增加。导致这种变化的直接原因可能是加工过程中，糖苷水解、类胡萝卜素、氨基酸或脂质降解等释放的挥发性化合物使不同类别的香气成分发生降解或生成[4]。
图2红茶加工过程中的香气类别的变化Fig.2Changesinaromacategoriesduringblackteaprocessing
通过GC-MS技术分离鉴定到主要的47种香气成分，如表1所示，其中醇类12种、酮类7种、醛类8种、酯类7种、烷烃类3种、烯烃类化合物7种和其他化合物3种。这47种香气组分中有23种成分具有相同变化趋势，其中11种在加工过程中相对含量逐渐升高，分别为苯甲醇、异香叶醇、α-衣兰油烯、苯甲醛、反式-2-壬烯醛、反-2-辛烯醛、β-环柠檬醛、甲基庚烯酮、3,5-辛二烯-2-酮、α-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯。12种在加工过程中相对含量降低，分别为6-异辛醇、芳樟醇、α-松油醇、2-甲基十四烷、正十三烷、正十四烷、α-法尼烯、(3E,7E)-4,8,12-三甲基三苯甲基-1,3,7,11-四烯、罗勒烯、反式-2-癸烯醛、β-紫罗兰酮、茉莉酸甲酯，其余24种香气组分均呈不规则的变化趋势。
2.3.1醇类的变化分析
醇类化合物主要分为脂肪族醇、芳香族醇和萜烯醇3类，而具有花果香的萜烯醇是红茶香气中的重要成分之一[17]。在本研究中，相对含量较高的醇类有苯乙醇(3.83%～5.08%)、香叶醇(4.13%～9.13%)、反式-橙花叔醇(1.99%～5.64%)、芳樟醇(24.52%～34.38%)等，其中，具有铃兰花香的芳樟醇是红茶中含量较高的香气组分之一，对红茶香型形成有重要作用。鲜叶中，芳樟醇的相对含量为34.15%，在揉捻和发酵时有较大程度的降低，这与杨娟等[18]研究结果不同，这可能是加工工艺和茶树品种不同所致。散发玫瑰香的香叶醇是祁门红茶和福建红茶的特征性香气成分，在鲜叶中相对含量为5.79%，之后呈波动性变化。苯乙醇具有玫瑰香，揉捻叶中含量最高(5.08%)，发酵后降至(4.86%)，但其阈值较高(750～1100μg/L)，对红茶香气形成的影响需进一步研究[19]。竹尾忠一等[20]认为，中国红茶的香型分为三类：第1种是芳樟醇及其氧化物主导型，第2种是香叶醇和芳樟醇综合的中间型，第3种是香叶醇主导型。可以发现，在黄金茶红茶的4个加工阶段中，芳樟醇的相对含量均显著高于香叶醇，初步推测其香气特征可能属于芳樟醇及其氧化物主导型。
2.3.2醛类、酯类的变化分析
表1红茶加工过程中主要香气组分的变化单位：%
Table1Changesofmainaromacomponentsinblackteaduringprocessing
注：-表示未检出，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
2.3.3烯烃类、酮类、烷烃类和其他组分变化的变化分析
烯烃属不饱和烃类物质，广泛存在于植物体内，具有一定的香气，对茶叶香型形成有较大影响[23]。黄金茶红茶加工中，相对含量较高的萜烯类有α-法尼烯(0.18%～0.81%)、(-)-α-荜澄茄油烯(0.17%～0.55%)等，这2类物质常表现为花香、木香[24]。酮类化合物通常具有花香味，是赋予红茶花香特征的物质基础。顺茉莉酮、β-紫罗酮等是红茶的特征香气成分之一，在本研究中顺茉莉酮、β-紫罗酮的相对含量分别为(0.1%～0.14%)、(0.35%～0.99%)。β-紫罗酮具有紫罗兰香气，主要由胡萝卜素氧化降解和热氧化降解产生[25]；鲜叶中，β-紫罗酮的相对含量为0.35%，在后续加工过程中呈逐渐上升状态。表现为强烈而愉快的茉莉香的顺茉莉酮，在揉捻叶中相对含量最高，随后略有下降。AI等[26]的研究表明，在红茶萎凋过程中补充红、橙、黄光可明显提高酮类香气物质的含量。其他被检测到的香气组分有2-甲基十四烷、正十三烷等烷烃类物质及苯乙腈、咖啡碱、(+)-香豆素，这些物质也对红茶香气的形成有一定作用。