1、细胞培养系列方法实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。细胞的冻存与复苏【实验用品】（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（2）试剂：PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMS）O、双抗（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、酒精灯、水浴锅、CO2培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作台。试剂
3、等。（6）将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4,0.5h-20，1h-80，过夜转入液氮灌中细胞的复苏1）准备水浴锅，调温度至37。打开离心机。2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。5）1000r/min离心5min，弃上清液。6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。7）按5*105个/ml的细胞浓度，将细胞接种在培养瓶中，置于培养箱中培养。8）24h
5、结果及分析】经复苏刚接种的细胞是悬浮于培养基中的。复苏成功的细胞24h左右可贴壁，48h后即可开始生长、增殖。复苏不成功的细胞，将继续悬浮于培养液中，不能贴壁。细胞的传代培养实验用品】1）材料：原代培养的肝细胞、原代培养的外周血淋巴细胞2）试剂：PBS液、DMEM培养基（含10%小牛血清）、0.25%胰蛋白酶消化液3）设备：25ml培养瓶、吸管、离心管、酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置显微镜、超净工作台、C02培养箱【实验方案】1.贴壁细胞的传代培养（1）用吸管吸出原代培养的肝细胞培养瓶中培养液。（2）向瓶内加入适量的PBS液，轻轻摇动后倒掉。（3）每
6、25ml的培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶消化液1ml，消化液的量以覆盖整个细胞培养面为宜，置于37的培养箱环境中。轻轻摇动培养瓶，在倒置显微镜下对培养细胞进行观察，当细胞胞质回缩、细胞间隙增大时，迅速将消化液吸出。（4）加入PBS液于培养瓶中，轻轻转动培养瓶，然后用吸管将溶液吸出，加入含血清的培养液终止消化。（5）用吸管吸取培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的部位应均匀，可按从上到下、从左到右的顺序进行，保证瓶底各个部位的细胞均能被吹到。此外，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。（6）将吹打后的细胞置于倒置显微镜下观察，当发现原
7、贴壁的细胞均已悬浮于培养液中，成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止吹打。（7）收集细胞悬液于离心管中，1000r/min，离心5-8min，去除上清。（8）细胞计数，按照1*105-1*106个细胞的密度接种细胞于新培养瓶中。2.悬浮细胞的传代（1）将原代培养的外周血淋巴细胞连同培养液一并转移到离心管中。（2）800-1000r/min离心5min，去除上清液。（3）加新的培养液到离心管中，吸管吹打、制悬。根据细胞的数量多少，将细胞悬液按1:2或1:3的比例分别接种于新的培养瓶中。【注意事项】（1）消化过程中需根据培养细胞形态的变化来严格控制消
9、增殖、细胞的数量增多，在接种的肝细胞或肝细胞团周围可见新生细胞长出，这些细胞内含物少而较为透明，胞体轮廓通常较浅。96h以后，培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合，细胞轮廓清晰、可见。细胞转染【实验用品】细胞、6孔板、血清、培养基DMEM、OPTI-MEM、GSK-3/wt的质粒、Lipofectamine2000、GSK-3/wt的质粒、链霉素/青霉素(双抗)、FC(S小牛血清)、PBS(磷酸盐缓冲溶液)、胰酶1.细胞的准备实验前一天，将细胞接种入6孔板中，每孔中培养基的体积为1ml，细胞环境控制在37、5%CO2培养箱中培养24小时。
10、待细胞达到90%丰度时，准备转染，在转染前一晚换新鲜的有血清培养基，使细胞状态良好。2.转染GSK-3/wt的质粒(1)准备无血清培养基DMEM，OPTI-MEM，转染试剂Lipofectamine2000。(2)转染前一小时弃去培养板中的旧培养基，换预先预热的无血清培养基。(3)根据Lip-2000转染说明书算出所需要的Lip-2000的体积，根据各转染质粒的浓度算出各自所需体积见表2。表2所用质粒和转染试剂的量CultureVesselSurfaceAreaPerWell(cm2)RelativeSurfaceArea(vs.24-well)Volumeof
11、PlatingMediumDNA(ug)andDilutionVolume(ul)Lipofectamine2000(ul)AndDilutionVolume(ul)6-well1052ml4.0ugin250ul10ulin250ul(4)将质粒加入OPTI-MEM，轻轻混匀。(5)将Lipofectamine2000加入OPTI-MEM后轻轻混匀后，并计时孵育5分钟(6)将质粒加入Lipofectamine2000中，轻轻混匀后，计时孵育20分钟。(7)20分钟后缓慢将Lipofectamine2000-质粒混合物加入培养孔中。（8）37、5%CO2培