实验内容4.染色标本的制备—革蓝染色
实验目的与要求
医学微生物学实验课是该专业课程的重要组成部分，指导学生上好实验课是教学过程中的重要环节，学习实验课的目的是：
1.使学生加深理解并巩固理论知识，学习和掌握有关的实验操作技术，为以后的医学专业课学习打好基础：
2.在实验中，培养学生观察、思考和分析问题的能力，主动参与实验的动手能力及独立工作的能力。训练学生严格的科学作风、严肃白的科学态度和严密的工作方法。
3.培养学生在集体工作环境中互帮互让，团结协作，共同完成好实验的精神品德。
为了达到上述目的，提高实验课的教学效果，特提出以下要求：
1.实验课前做好预习，明确本次实验课的内容及其原理、方法及注意事项；
3.详细讨论实验结果，提倡同学之间互帮互学，并紧密联系理论课内容。要注意不论实验结果与理论符合与否，都有讨论的价值，并分析其原因，有可能的话还应重复实验；
4.严格遵守实验室规则，在微生物学实验课上，要树立“有菌观点”，严格掌握和不断完善无菌操作技术。
实验室规则
一、进入实验室须穿工作服、戴工作帽。除必要的书籍文具外，其它个人物品一律不得带入实验室。
二、在实验室内，禁止饮食、吸烟及与学习无关的其它活动，不得大声喧哗或嘻戏。
三、未经老师许可，不得擅自搬动实验器材及示教物品，不准随意摆弄和旋转实验仪器上的开关及旋扭等。
四、按照实验要求，在老师的指导下，主动安排要进行的实验，认真进行实验操作，严格遵守无菌操作规程，争取顺利地完成实验。
五、实验中使用完毕的器材和试剂，必须放回规定的位置。废弃物必须按规定进行处理或归放于指定的容器内，不能随便乱丢乱放。
六、实验中万一有菌液打翻、有菌材料污染桌面或衣物、割破手指等意外情况，应及时报告老师进行处理，切勿自作主张不按规定处理。
七、爱护实验室内一切设备、挂图、仪器。注意节约使用消耗材料及药品试剂，注意用电安全及节约水电。
八、实验结束，要清理桌面，将实验器材放回原处。值日同学要搞好实验室的清洁卫生，保持室内整齐，离开实验室前要关好门窗、水、电，并将手洗干净。
九、未经许可，不得将实验室内任何物品带出实验室。
实验一细菌形态学观察技术
将细菌培养物或含菌标本材料制备的染色标本片，置显微镜油镜头下，可以观察到细菌的形状、大小、结构、排列及染色特性等，了解这些特征有助于鉴别各种细菌。
一、显微镜油镜头的使用与保护
【使用原理】
用油镜观察标本、是在使用高倍镜的基础上，采用同玻璃折光率相似的油状物（如香柏油、液体石腊等），滴加在标本与油镜头中间，以避免光线散射，提高显微镜的清晰度和分辨能力。使观察物象更加清楚明了。
【操作方法】
1.调试：打开电源，先采用低倍镜，使视野达到清晰光亮。
2.加油：双手向上转动粗螺旋，使镜筒上升，将标本片固定于载物台上，使染色面对准集光器央，加镜油于标本面，调换油镜头对准标本面。
3.调焦点：用左手向下轻转粗螺旋，使镜筒下降，同时眼睛从右侧观察下降程度，待镜头入油后接触上玻片，用眼观目镜，反转粗螺旋，使镜筒慢慢上升，待看到模糊物象时，改用细螺旋上下调节，使物像达到完全清晰为宜（一般转动细调节前后半圈）。
4.观察：观察时只使用细调。需改换视野时，右手操纵推进器，左手转动细螺旋，做到配合自如。并养成左眼观察，右眼绘图的习惯。
【油镜头的保护】
油镜头使用完结后，必须用擦镜纸滴加少量二甲苯将油擦洗干净（二甲苯用量宜少，以免镜片间粘胶溶解）。下降集光器，半接物镜转成“八”字，再下降镜筒，轻触镜台表面，双手平持显微放入镜箱，避免直射日光，置于干燥处，以防受潮。
【注意事项】
1.使用直筒显微镜观察标本时，必须两眼同时睁开，训练使用左眼观察，右眼绘图。如用油镜头观察，勿将镜身歪斜，避免镜油流出片面。
2.观察染色标本时，光线宜强，可上升集光器，开大光圈。观察不染
色标本时，光源宜弱，可下降集光器，缩小光圈。
3.使用完毕，一定擦去镜油。
二、细菌不染色标本
不染色的细菌和标本镜检，虽可观察细菌在自然生活状态下的大小、形态、活动等，但主要用于观察细菌的动力。
（一）悬滴法
【材料】
1.细菌：枯草杆菌8~12小时肉汤培养物。
2.凹玻片，盖玻片，凡士林等。
【方法】
1.取凹玻片一张，于凹窝周围涂少许凡士林（见图1）。
图1悬滴法
2.用接种环沾取枯草杆菌8~12小时培养物，置于盖玻片中央。
3.反转凹玻片，使凹窝对准盖玻片中央，盖于其上，轻压后，迅速翻转玻片，使盖破片面向上。
4.标本片置于显微镜载物台上，先用弱光线，低倍镜找物象，再改换高倍镜观察，密切注意，勿压破盖玻片。
5.观察：细菌在镜下为灰色半透明体，并呈现真运动，如在明亮的海洋中，深入浅出游来动去。
（二）压滴法
用途同悬滴法。
2.载物玻片：盖玻片等。
1.取无油污物玻片1张。
2.用接种环沾取枯草杆菌8~12小时肉汤培养物置于载物玻片中央。
3.加盖玻片于菌液表面，观察方法同悬滴法。
三、细菌染色标本片的制备（操作）
由于细菌个体微小，基本上无色透明，故将其用适当染料染色观察，方能显示它的形态、大小、构造及染色特性等，在细菌和鉴别上有重要意义。
1.葡萄球菌大肠杆菌18~24小时普通琼脂斜面培养物。
2.革兰染色液。
3.生理盐水，载物玻片，接种环等。
（一）细菌涂片的制作
1.涂片：取清洁无油污载物玻片一张，接种环沾取生理盐水1~2环置于玻片中央，再将接种环火焰灭菌待冷后，沾取葡萄球菌或大肠杆菌菌苔少许，混于生理盐水中，轻轻涂成均匀薄膜。
2.干燥：室温自然干燥，也可将涂面向上，远离火焰上方微加温干燥（切勿加热过度，以防将标本烧枯）。
3.固定：标本干燥后，通过酒精灯火焰三次（约2~3秒钟），以杀死细菌并使之固定于玻片上。
4.染色：可根据不同的染色要求，用相应染色液进行染色。
（二）革兰染色法：涂片的制备方法同前，革兰染色方法可分为四步。
1.初染：于涂抹面上滴加结晶紫染液数滴，覆盖整个涂面，室温作用一分钟。用自来水轻轻冲洗，甩干水分。
2.媒染：滴加鲁戈碘液，室温作用一分钟，自来水冲洗，甩干水分。
3.脱色：将载物玻片浸于95%酒精缸中，上下提取，边提边看，见涂面无色素下流为止（约30秒钟）。自来水冲洗，甩干水分。
4.复染：加稀释复红染液染30秒钟，自来水冲洗，吸水纸吸干玻片水分。
5.加油镜检：染色片待干后，于油镜下，调强光视野观察，呈紫色的为革