试验于2017年11月22日至2018年6月15日在江苏省盐城市滨海县界牌镇黄河湾科技公司试验基地(34°06′08″N,119°51′16″E)进行。该地区年平均气温为14℃,年平均降雨量为942.6mm,最大为1371.9mm,最少535.8mm,年平均降雨日数为100d左右,多集中在夏季。试验地距离黄河故道7.2km,土壤为砂质碱性土。该地区的冬小麦和夏水稻秸秆均全部还田；本文主要针对第一季稻茬小麦在上季水稻秸秆全部还田条件下经过处理后土壤的理化性质、生物学性质和土壤微生物多样性变化情况进行研究。
试验中使用的有机物料腐熟剂是用实验室保藏菌种复配形成的复合菌剂,包括植物内生真菌枫香拟茎点霉(Phomopsisliquidambaris),编号为B3、黑曲霉(Aspergillusniger)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜂房芽孢杆菌(Bacillusalvei),它们均为能够降解秸秆并对作物有促生功能的有益菌种；通过平板对峙实验表明这四种菌两两之间没有拮抗作用,说明它们可以一起复配制作成复合菌剂。真菌用4℃保藏的斜面进行PDA转接,挑取单菌落真菌菌丝用PDA液体培养基扩繁,28℃,180rpm摇床3d获得种子液；用-80℃甘油保藏的两种细菌进行平板划线法复壮,LB固体培养基培养后挑取单菌落于LB液体培养基中进扩繁,37℃,180rpm摇床2d获得种子液；取各菌株种子液按接种量5%转移到相应的液体培养基中进行放大培养,培养条件同种子液发酵条件,获得发酵液。接着测定菌液中菌体数目,细菌用稀释涂布平板法计数,其中枯草芽孢杆菌为6.15×109菌落数/mL,蜂房芽孢杆菌为6.25×109菌落数/mL；真菌用摇匀烘干称重法,其中B3为3.52×10-2g/mL,黑曲霉为4.1×10-3g/mL。
实验中所用菌剂剂型均为固体菌剂。按照麸皮：锯木屑：稻壳=6：3：1,将其混匀后每400g装灭菌袋,并向袋中加200mL水,拌匀后进行121℃,20min灭菌处理,待其冷却后接入50mL菌种发酵液单独发酵,整个过程均在超净工作台完成。接种完成后真菌放在28℃培养箱培养,待真菌菌丝长满整个发酵袋视为发酵完成；细菌则放在37℃培养箱培养,待有机物料质地粘稠视为发酵完成。最后将发酵好的四种菌等量混匀,按照60kg/hm2标准均匀撒入田间。
土壤总DNA用试剂盒提取(FastDNASpinKit),PCR体系为50μL,其中真菌进行18SrRNA扩增,引物为NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′,GCFung5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCC/GCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG-3′,扩增条件为94℃变性4min；94℃30s,55.5℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环,最终再72℃延伸10min；细菌进行16SrRNA扩增,引物为517R:5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′,357f-GC:5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC/GGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′,扩增条件为94℃变性4min；94℃1min,65℃退火1min,20个循环,72℃延伸1min。扩增好的PCR样品进行DGGE,其中真菌DGGE使用浓度为20%—50%的变性胶,在60℃下电泳10h,然后剥胶进行EB染色,最后扫胶成像进行后续分析；细菌DGGE使用浓度为35%—65%的变性胶,操作同真菌。
2018年6月15日小麦成熟时,沿各处理小区对角线取1m2样方,每个处理取三组重复,一共15个样方(5处理×3重复)。实时分数每个样方中小麦总穗数,随后从每个样方中随机抽取30株小麦进行穗粒数统计,通过加权平均值确定不同处理的小麦穗粒数。千粒重则是将样方中所有小麦脱粒后带回实验室,数小麦千粒于55℃烘箱进行72h烘干称重所得。
本实验的所有数据均采用SPSS16.0进行统计分析,柱状图用origin8.6软件制作,DGGE聚类用GelComparⅡ软件制作。文中数据通过单因素方差(one-way)分析,Turkey法检验数据差异显著性,其中P<0.05。
总之,从本季田间处理结果来看,土壤改良培肥基质和复合菌剂联合配施对试验区土壤的培肥效果最好。但长期来看,进行技术推广,必要考虑经济效益,此时联合配施的成本太高,收益较低,不利于推广。反观CMA+CF处理,其对试验区土壤的培肥效果在土壤纤维素酶活、土壤微生物量碳以及细菌多样性中优于联合配施,小麦产量与联合配施相比也无显著差异,且复合菌剂用量较少,价格实惠。综上所述,秸秆还田条件下,添加复合菌剂是最优培肥措施,在中低产农田中具有较高的推广价值。