化学防治是防控农业有害生物的有效措施，在保障粮食安全方面有着不可或缺的地位。据统计，全球每年由病虫害导致的作物产量损失在30%～40%，使用化学农药可至少挽回30%的产量损失。化学农药具有使用方便、防治速度快、防治效果好等优点，但长期或不合理使用可能引致防治对象对农药产生抗性、农药对非目标生物的毒副作用以及环境污染等一系列问题。因此，寻找高效且安全的新型绿色农药是农药行业发展的重要方向。
纳米材料具有纳米尺度下的小尺寸效应、界面效应以及良好的生物兼容性等特点，其作为dsRNA载体可以增强dsRNA在环境中的稳定性和进入目标生物组织或细胞的能力，进而提高靶向递送效率，是解决核酸农药外源施用难的有效手段。近年来，随着纳米材料的快速发展和dsRNA高效合成技术日渐成熟，基于纳米材料的核酸农药纳米递送系统在有害生物防治方面取得了一系列重要的进展。鉴于此，本文对核酸农药的应用方式与挑战、产业化进展、基于纳米材料的核酸农药纳米递送系统及其国内外应用研究进展进行综述，并对核酸农药纳米递送系统的前景和面临的挑战进行展望，旨在为核酸农药在农业有害生物绿色防控中的推广应用提供参考。
1核酸农药的应用方式与挑战
1.1转基因植物核酸农药
转基因植物核酸农药可以通过转基因作物生产传递针对害虫致命基因的dsRNA或者小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA），从而赋予作物自身防御病虫害的能力。转基因作物可以通过植物细胞产生dsRNA/siRNA，而后经过食物链进入靶标生物体内，打破dsRNA/siRNA稳定供应的限制，从而触发持续的RNAi反应。转基因作物自身表达dsRNA或者siRNA的转基因植物核酸农药在有害生物管理方面具有成本低、稳定表达和高特异性等诸多优势。
目前，新型的叶绿体转基因技术可以让dsRNA稳定地在叶绿体中积累而不会被自身的RNAi元件（Dicer酶）切割降解，其克服了基于常规细胞核转基因技术的转基因植物核酸农药会被植物自身RNAi系统识别切割，进而影响RNAi效率和防控效果的应用难题。然而，转基因植物核酸农药仍具有一定的局限性，例如：许多作物无法进行基因改造；在水稻、小麦和玉米等主要粮食作物上难以开发叶绿体转化方案。此外，转基因作物的农产品在大多数国家具有较低的市场公众接受度，对其潜在的环境风险需要进行严格的风险评估。
1.2可喷洒核酸农药
随着对核酸农药研究的不断深入，关于叶面喷施核酸农药进行有害生物防治的研究越来越多。2001年，Tenllado等首次报道了叶面应用dsRNA可成功干扰辣椒轻斑驳病毒（peppermildmottlevirus，PMMoV）、苜蓿花叶病毒（alfalfamosaicvirus，AMV）和烟草蚀纹病毒（tobaccoetchvirus，TEV）对烟草Nicotianatabacum的侵染。Koch等研究表明，在大麦Hordeumvulgare叶片表面喷洒靶向3个禾谷镰刀菌Fusariumgraminearum麦角甾醇生物合成基因（CYP51A、CYP51B、CYP51C）的dsRNA（CYP3-dsRNA），可有效抑制禾谷镰刀菌的生长。Wang等发现，灰葡萄孢菌Botrytiscinerea在侵染植物时可以将siRNAs（主要由灰葡萄孢菌Dicer蛋白BcDCL1和BcDCL2产生）传递到植物细胞中，以沉默宿主免疫基因；在植物表面应用靶向灰葡萄孢菌DCL1和DCL2基因的siRNA或dsRNA可削弱这种沉默，进而显著抑制灰霉病。李本杰等在马铃薯Solanumtuberosum叶面上施用针对马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata肌动蛋白基因的dsRNA，能够有效防治该类害虫28d以上。Andrade等用靶向亚洲柑橘木虱Diaphorinacitri精氨酸激酶基因的dsRNA处理柑橘Citrussinensis叶片，发现柑橘木虱取食后会因精氨酸激酶基因的表达受到干扰而死亡。
2核酸农药的产业化进展
2.1转基因植物核酸农药
2.2可喷洒核酸农药
3纳米材料介导的核酸农药纳米递送系统
图1纳米材料介导的dsRNA/siRNA传递系统示意图
3.1纳米材料的优势
（1）提高转染效率。据报道，由介孔二氧化硅纳米颗粒、层状双氢氧化物纳米片和碳纳米管等纳米材料负载DNA或RNA，可在没有机械辅助（例如基因枪、超声波、涡旋和电穿孔等）条件下穿透植物细胞和病原菌细胞的细胞壁，从而产生瞬时或稳定的转化。纳米材料介导的转化方式已成功应用于烟草、玉米、拟南芥、洋葱等作物，展现出普适性。
（3）增加dsRNA稳定性。纳米材料可以将dsRNA包裹在其表面或内部，其本身的尺寸和结构可以提供物理屏障，防止dsRNA与酶相互作用，从而增强dsRNA的稳定性。例如，Ma等利用一种星状阳离子聚合物纳米载体（starpolycation，SPc）对dseGFP进行负载后形成dsRNA/SPc复合物，RNaseA酶和昆虫血淋巴处理不会造成复合物中dseGFP的降解，表明该纳米载体对dseGFP提供了强有力的保护作用。Christiaens等发现，鸟苷酸聚合物作为纳米载体可以防止外源dsRNA在甜菜夜蛾Spodopteraexigua碱性肠道中的降解，证明了该类纳米材料对核酸具有高效保护性。此外，纳米材料还可以克服昆虫肠道围食膜、植物表皮以及昆虫体壁等障碍，进而显著提升RNAi效率和病虫害控制效果。
3.2核酸农药的负载
3.3细胞摄取与内体逃逸
细胞摄取是影响核酸农药对宿主细胞有效生物利用度的重要因素。核酸农药纳米递送系统可以利用细胞壁间的孔洞（例如花粉孔、叶面气孔）直接穿过细胞壁。表面带有正电荷的核酸农药纳米递送系统可以与带有负电荷的细胞膜表面结合，在胞吞作用下进入细胞质，完成跨膜转运。因此，具有正电荷的阳离子纳米载体材料较中性或阴离子纳米载体材料更容易被细胞摄取，表现出更高的细胞转染效率。中国农业大学沈杰研究团队发现，dseGFP/SPc处理可显著上调Sf9细胞的Chc基因（编码网格蛋白的包被凹坑和囊泡表面结构的主要多肽）、AP2S1基因（编码AP2异四聚体复合物的σ亚单位，AP2复合物是网格蛋白包被小泡的核心成分，促进膜蛋白的内吞作用）、Arf1基因（ARF蛋白通过募集各种辅助蛋白构成运输囊泡，是内吞作用中的关键蛋白）等关键基因的表达，激活网格蛋白介导的内吞通路，从而增强细胞对dsRNA的摄取；进一步采用质子泵抑制剂（抑制网格蛋白介导的内吞作用）巴佛洛霉素A（bafilomycin-A，BafA）体外处理Sf9细胞后，dseGFP/SPc无法激活细胞内的RNAi效应；该研究证明了网格蛋白介导的内吞作用是细胞摄取SPc介导的dsRNA递送的主要途径。
核酸农药纳米递送系统通过内吞作用被内化形成内吞囊泡，若其不能从内体及时逃逸，则会与内体一起进入溶酶体中从而降解，从而限制核酸农药的细胞生物利用度。目前研究表明，大多数RNA纳米递送系统内体逃逸的重要机制为“质子海绵效应”，即RNA纳米递送系统进入内体后，为缓冲内体内的酸性环境而吸收大量质子，大量质子涌入内吞囊泡导致内体的渗透性水肿胀，最终导致内体破裂，完成内体逃逸。值得注意的是，阳离子脂质纳米颗粒具有独特的内体逃逸机制，它们通过识别并结合内体膜上的磷脂分子，从而破坏内体的稳定性，完成内体逃逸并释放所负载的dsRNA/siRNA。纳米递送载体或可以促进核酸农药的内体逃逸。例如，Ma等通过激光共聚焦显微成像技术发现，与裸露的dsRNA相比，dseGFP/SPc孵育的Sf9细胞的晚期核内体中没有dsRNA的积累，表明SPc纳米载体可以促进dsRNA的内体逃逸。
3.4核酸农药的释放
核酸农药纳米递送系统具有生物活性的本质是基于dsRNA/siRNA的RNAi作用。因此，dsRNA/siRNA必须从纳米载体中释放出来才能激活RNAi途径，抑制靶标生物特异mRNA的表达，最终发挥核酸农药的生物效应。然而，目前关于dsRNA/siRNA从纳米载体中的释放机制研究报道相对较少。
2001年，Moret等研究发现，肝素、硫酸软骨素等生物体内的聚阴离子可以解离稳定的DNA与PEI复合物PEI-DNA，释放DNA。2004年，Okuda等首次在体外证明了PEI-DNA复合物在细胞质中的解离，并且发现阳离子含量比例低的阳离子聚合物类纳米材料-DNA复合物可以自主释放DNA；该研究表明，具有较高亲和力的生物体内聚阴离子可以通过竞争结合，导致PEI-DNA的解离，并将DNA释放到细胞质中。然而，这种竞争性的置换过程通常是非常缓慢的。
纳米材料响应细胞内刺激而造成的核酸农药纳米递送系统结构崩解是另一种诱导核酸农药释放的机制。该类纳米材料自身的物理或化学性质可以在生物细胞内环境因素的刺激下发生响应性改变，如胞浆pH值和氧化还原性的改变从而诱导递送系统结构崩解。例如：聚(β-氨基酯)（poly(β-aminoester)s）是一种基因递送常用的阳离子聚合物，其解离速率取决于环境pH和组成聚合物的链构象；含有二硫键（S－S）的核酸纳米递送系统在组织或细胞中谷胱甘肽的氧化还原刺激下，其二硫键被催化断裂，进而响应释放装载的核酸分子。
3.5基于纳米材料递送核酸农药的应用进展
表1基于纳米材料的核酸农药递送系统
3.5.1基于脂质的纳米材料
基于脂质的纳米材料是一类用途极为广泛的非病毒类核酸载体材料，在各种生理环境下具有稳定的纳米结构，并且可以轻松地与各种生物膜结合，从而能够有效地递送核酸分子。脂质通常被定义为疏水性或两亲性分子，在结构组成上包括一个亲水性的头部和一个疏水性的尾部，以及它们之间的连接物。基于脂质的纳米材料通常含有一定的脂质成分，如磷脂、胆固醇或聚乙二醇组分等。由于合成方法、脂质成分、形态结构等存在差异，目前用于核酸递送的脂质纳米材料可划分为脂质体与脂质纳米颗粒两种类型（图2）。
图2脂质体（左）和脂质纳米粒（右）的示意图
3.5.1.1脂质体
脂质体是由脂质自组装成有序排列的双分子层封闭囊泡，具有亲水的内部空腔结构（图2左）。脂质体由于其良好的生物相容性、生物降解性、低毒性以及递送亲水和亲脂性药物的能力，已成为促进小分子和大分子传递的强大药物载体。Lin等将靶向德国小蠊Blattellagermanica微管蛋白基因（α-tubulin，Tub）的dsRNA（dsTub）封装进脂质体中，发现脂质体可以有效防止该dsTub在中肠中的降解，饲喂dsTub/脂质体复合物的基因沉默效率达60%，显著提高了dsTub处理害虫的死亡率。类似地，Castellanos等利用脂质体2000封装靶向ATP酶（vATPaseA）和肌肉肌动蛋白（act-2）的dsRNA，饲喂新热带区褐臭蝽Euschistusheros上述复合物，14d后可以导致45%和42%的试虫死亡，相较于裸露的dsRNA和dsRNA/EDTA处理，dsRNA/脂质体系统具有更好的递送效果。尽管脂质体作为核酸农药载体有很大优势，但其合成方法较复杂，并需要使用大量的有机溶剂，这可能会不利于其大规模生产。
3.5.1.2脂质纳米颗粒
脂质纳米颗粒（lipidnanoparticles，LNPs）在广义上是指以脂质形成的纳米颗粒，是用来描述一种不同于脂质体的特定类型的纳米颗粒。从组成上，LNPs与脂质体的主要成分大致相同，都含有脂质和胆固醇，但形成LNPs的脂质必须包含可电离脂质，而脂质体则对此没有严格的限制。从各成分比例上看，LNPs与脂质体之间存在较大的差异，尤其是中性辅助脂类（胆固醇、磷脂等）的用量，LNPs需要物质的量之比（摩尔比例）在30%～40%的辅助脂类，才能有效封装dsRNA/siRNA。从形貌来上，LNPs没有脂质体的亲水空腔，相反，其内部具有胶束结构（图2右）。中国农业科学院烟草研究所任广伟团队采用PEI修饰的LNPs封装昆虫生长发育关键基因，即保幼激素受体基因（Methoprenetolerant，Met）的dsRNA，成功制备了Met3@PEI@LNPs纳米复合物（385nm，-36.9mV），其细胞转染效率达到96.4%；饲喂法生物测定结果表明，在仅为对照组25%的dsRNA浓度下，Met3@PEI@LNPs处理的草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda干扰效率仍高达91.7%，显著控制了草地贪夜蛾种群数量。与脂质体相比，LNPs具有更高的动力学稳定性和生物利用度，且易于大规模生产。
3.5.2聚合物纳米材料
聚合物纳米材料（polymernanoparticles，PNPs）是指由小分子化合物通过聚合反应形成的具有纳米尺度（1～1,000nm）的一类胶体材料，具有较高生物安全性、广泛结构多样性和良好生物降解性。因具有易于合成、结构多样、高转染效率和生物相容性等特性，PNPs成为了非病毒类核酸分子递送载体的主要材料，被广泛应用于基因治疗和核酸农药递送领域。
3.5.2.1壳聚糖
通过将壳聚糖与三聚磷酸钠（tripolyphosphate，TPP）、叶酸、聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）、聚乙烯亚胺和葡聚糖硫酸盐等交联剂结合，可进一步提高其对dsRNA/siRNA的保护能力，并提高转染效率和沉默效率。例如，Dhandapani等将壳聚糖与TPP交联，合成了粒径小于200nm载有dsRNA的纳米复合物（CS-TPP-dsRNA），其使埃及伊蚊的死亡率提高到60%以上，而同样条件下，dsRNA-壳聚糖纳米复合物（CS-dsRNA）的死亡率仅为35%。Lyu等将松香改性的PEG与壳聚糖交联（rosin-modifiedpolyethyleneglycolandchitosan，ROPE@C）（418nm，+26.5mV）负载褐飞虱Nilaparvatalugens（Brownplanthopper，BPH）体内几丁质合成酶基因A（ChitinsynthetaseA，CHSA）的dsRNA（dsNlCHSA），得到了dsNlCHSA/ROPE@C纳米递送系统（图3）。点滴法测定结果表明，dsNlCHSA/ROPE@C可以使CHSA的相对表达量降低54.3%，BPH的死亡率为65.8%。
图3dsRNA/ROPE@C/APG纳米递送系统示意图
总的来说，CNPs及其衍生物价格低廉、可生物降解、含量丰富、可大规模生产，是递送核酸农药的理想材料之一。然而，CNPs及其衍生物提高RNAi效率的能力似乎是特异性的，因此在纳入基于RNAi的控制策略之前，需要对目标物种进行有效性测试。
3.5.2.2树枝状阳离子聚合物
树枝状阳离子聚合物是一类由重复单元组成超分支球状结构的阳离子聚合物。树枝状阳离子聚合物的内部也有大量叔胺基，这些叔胺基可以在酸性细胞内体中被质子化，从而启动“质子海绵效应”。因此树枝状阳离子聚合物具有高负载率和高转染效率的特点。
图4基于SPc的核酸农药递送系统用于害虫防治
总的来说，SPc材料作为核酸农药载体具有巨大的应用潜力，但应继续优化和开发新的配方，提高对非靶标生物的特异性，以降低环境安全与人类健康的风险。
3.5.2.3胍类聚合物
3.5.3多肽纳米材料
多肽是一类由多个氨基酸通过肽键共价连接的化合物。基于天然多肽的纳米载体通常具有安全无毒、可生物降解等特点，已成为核酸农药载体材料的研究热点之一。
3.5.3.1支链两亲性肽胶囊
支链两亲性肽胶囊（branchedamphiphilicpeptidecapsules，BAPCs）是由两亲性氨基酸自组装成双层分隔的超分子纳米囊泡，具有与脂质体类似但更加稳定的结构。Avila等在赤拟谷盗和豌豆蚜的饲料中分别加入靶向内质网未折叠蛋白反应信号通路基因（BiP和Armet）的dsRNA/BAPCs复合物，可以显著抑制靶标基因的表达，从而影响内质网蛋白质折叠，若同时饲喂BiP-dsRNA和Armet-dsRNA与BAPCs的复合物可导致赤拟谷盗3龄幼虫75%的死亡率。此外，与单独喂食裸BiP-dsRNA相比，喂食BiP-dsRNA/BAPCs复合物的豌豆蚜可提前6～9d死亡。该项研究表明，BAPCs纳米材料增强了口服dsRNA的给药效果并改善了RNAi效应。Wessel等最近的一项研究证明了BAPCs可被一种常见的土壤真菌构巢曲霉Aspergillusnidulans降解，从而减少了这些纳米颗粒对环境的潜在影响。目前，口服BAPCs对其他害虫中产生RNAi效应的潜力仍需进一步的研究证明。
3.5.3.2细胞膜穿透肽
细胞膜穿透肽（cellmembranepenetratingpeptides，CPPs）是一种具有穿透生物膜系统功能的短肽的统称。CPPs可以作为siRNA、蛋白质、附加肽和其他生物小分子的载体，增加细胞对dsRNA的摄取并协助其在细胞内的内体逃逸。在CPP家族中，富含精氨酸的Tat肽（AYGRKKRRQRRR）已被证明可以在昆虫细胞中成功地内化质粒DNA和激素。肽蛋白转导结构域（peptidetransductiondomain，PTD）是Tat肽的一个改进型小分子多肽。该结构域包括血凝素肽的脂质融合特性，它可以在胞吞作用后破坏囊泡膜，将装载的生物分子分散到细胞质中。通过将PTD与dsRNA结合域（dsRNAbindingdomain，DRBD）配对结合，可以形成核糖核蛋白颗粒（ribonucleoproteinparticles，RNPs）来携带dsRNA穿过细胞膜，逃离内体，并诱导沉默。Gillet等发现，RNPs可以增强dsRNA在酸性条件下的耐受性和提高dsRNA在Sf21细胞中的体外转染效率。饲喂棉铃象甲Anthonomusgrandis靶向几丁质合酶Ⅱ（Ag-ChSⅡ）基因的RNPs可以降低Ag-ChSⅡ基因80%的转录水平，显著高于裸dsRNA处理（30%）（图5）。该研究证明了CPPs递送dsRNA到昆虫细胞的细胞质方面的实用性，但目前未见有关CPPs介导的核酸农药递送系统在其他害虫中应用的报道。
图5dsRNA与PTD-DRBD联合口服传递的机制模型
3.5.4碳基纳米材料
碳基纳米材料是指具有独特结构和性质的碳材料。已有研究表明，碳基纳米材料在递送核酸分子方面表现出良好的基因转染效率，与商业脂质体2000相比具有较低的细胞毒性。此外，碳基纳米材料的合成成本廉价且技术成熟，易被多功能化修饰。这些特性使得碳基纳米材料成为一种新兴的核酸传递工具，在核酸农药纳米递送系统领域具有巨大的应用前景。
3.5.4.1碳纳米管
3.5.4.2碳量子点
图6基于碳量子点递送dsRNA来控制植物疫霉菌的可喷洒核酸农药模型
3.5.5层状双氢氧化物
层状双氢氧化物（layereddoublehydroxides，LDHs）是一种类似天然水滑石的二维离子层状纳米颗粒，由带正电荷的层板与层间阴离子组成。LDHs的一般组成公式为[M2+(1?x)M3+x(OH)2]x+An?x/n·zH2O，其中M2+和M3+为二价和三价金属离子，An?为层间电荷平衡阴离子。大量研究表明，LDHs具有多用途特性，可以作为一种生物相容性、低毒性的基因和药物载体。LDHs进入植物细胞的方式包括自由扩散和胞吞两种。由于存在植物细胞壁孔径大小的限制，粒径成为LDHs纳米颗粒在植物细胞中成功内化的关键因素。例如，Yong等发现，在50～120nm的粒径范围内，粒径为50nm的LDH纳米颗粒在番茄Solanumlycopersicum花粉细胞中表现出最快的内化速率，递送dsRNA至转基因番茄10512i的花粉细胞中可以造成GUS（β-glucuronidase）报告基因的mRNA水平下降89%，显著高于相同剂量的单独dsRNA处理（37%）。
澳大利亚昆士兰大学NeenaMitter与许志平合作开发了一种基于LDHs的RNA农药喷雾制剂——LDH-dsRNA（BioClay），以辣椒轻斑驳病毒和黄瓜花叶病毒（cucumbermosaicvirus，CMV）特异性基因为靶基因，仅叶面喷洒1次BioClay就可以为豇豆Vignaunguiculata提供长达20d的有效病毒防护，30d后仍可以检测到叶片表面的dsRNA。近年来，该团队利用高通量RNAi手段筛选到烟粉虱Bemisiatabaci的致死基因，叶面喷施BioClay在烟粉虱整个生命阶段（卵、若虫、成虫）都有良好的控制效果（图7）。此外，LDH纳米颗粒在湿润的CO2环境下就可以降解，并且在哺乳动物中无毒性。综上所述，LDHs纳米材料在核酸农药纳米递送系统领域具有巨大的应用前景，其在进入植物细胞后的系统保护机制仍需进一步研究。
图7叶面喷施BioClay可防治整个生命阶段烟粉虱（卵、若虫、成虫）
4核酸农药纳米递送系统的安全风险
纳米载体因其“纳米”特性可能会对环境安全和人类健康带来新的威胁。例如，碳纳米管具有致癌性，也会引起生殖和发育毒理学效应，同时在环境中难以降解。肌凝蛋白作为真核生物的关键组成部分，壳聚糖纳米载体负载dsGFP或单独使用均可以显著抑制秀丽隐杆线虫虫体肌凝蛋白的表达。SPc纳米载体自身对非靶标生物黑腹果蝇具有急性毒性，且对其初孵幼虫的寿命、生育能力、攀爬能力和抗逆性均产生了不利影响。因此，需要对纳米载体材料进行严格的安全性评估，分析其潜在风险。
5总结与展望
基于RNAi技术的核酸农药在有害生物防治领域具有巨大的潜力，使用核酸农药控制病虫害将为有害生物综合治理增加新的维度。核酸农药目前已经有产业化的案例。相对于转基因植物核酸农药，可喷洒核酸农药不需要通过转基因植物就可以提供针对有害生物的基因控制，因而更具吸引力，其商业化更易被接受。纳米科技的发展为可喷洒核酸农药的发展提供了新的思路，各种具有特殊物化性质和生物学功能的纳米材料已成功应用于核酸农药的递送。基于纳米材料为载体的核酸农药纳米递送系统可以提高核酸农药在环境中的稳定性和有效促进其在目标生物细胞内的扩散、摄取和内体逃逸，对于核酸农药的高效应用和有害生物绿色防控具有重要意义。
然而，核酸农药纳米递送系统的广泛应用仍受部分因素限制：
（1）靶标基因。如何获得高效、特异致死的靶标基因dsRNA序列是核酸农药纳米递送系统的首要因素。理想的靶标基因可以利用低剂量的dsRNA引起高效的RNAi效应，靶基因的筛选和挖掘是一项费时费力的工作，需要更多的研发投入。
（2）生产成本。开发一类合成简单、价格低廉的纳米载体以及研发一种可大量、低成本、高效合成dsRNA的技术，是核酸农药走向田间大规模应用的前提。中国农业大学沈杰研究团队和美国RNAGri公司在这方面已有创新性技术，未来仍需继续开发多元的技术手段，降低生产成本，促进核酸农药纳米递送系统的大规模生产。
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