1.生物信息学在农业模式植物研究领域中的应用
1997年5月美国启动国家植物基因组计划（npgi），旨在绘出包括玉米、大豆、小麦、大麦、高粱、水稻、棉花、西红柿和松树等十多种具有经济价值的关键植物的基因图谱。国家植物基因组计划是与人类基因组工程（hgp）并行的庞大工程［4］。近年来，通过各国科学家的通力合作，植物基因组研究取得了重大进展，拟南芥、水稻等模式植物已完成了全基因组测序。人们可以使用生物信息学的方法系统地研究这些重要农作物的基因表达、蛋白质互作、蛋白质和核酸的定位、代谢物及其调节网络等，从而从分子水平上了解细胞的结构和功能［5］。目前已经建立的农作物生物信息学数据库研究平台有植物转录本（ta）集合数据库tigr、植物核酸序列数据库plantgdb、研究玉米遗传学和基因组学的mazegdb数据库、研究草类和水稻的gramene数据库、研究马铃薯的pomamo数据库，等等。
2.生物信息学在种质资源保存研究领域中的应用
种质资源是农业生产的重要资源，它包括许多农艺性状（如抗病、产量、品质、环境适应性基因等）的等位基因。植物种质资源库是指以植物种质资源为保护对象的保存设施。至1996年，全世界已建成了1300余座植物种质资源库，在我国也已建成30多座作物种质资源库。种质入库保存类型也从单一的种子形式，发展到营养器官、细胞和组织，甚至dna片段等多种形式。保护的物种也从有性繁殖植物扩展到无性繁殖植物及顽拗型种子植物等［6］。近年来，人们越来越多地应用各种分子标记来鉴定种质资源。例如微卫星、aflp、ssap、rbip和snp等。由于对种质资源进行分子标记产生了大量的数据，因此需要建立生物信息学数据库和采用分析工具来实现对这些数据的查询、统计和计算机分析等［7］。
3.生物信息学在农药设计开发研究领域中的应用
现代农药的研发已离不开生物信息技术的参与，随着生物信息学技术的进一步完善和发展，将会大大降低药物研发的成本，提高研发的质量和效率。
4.生物学信息学在作物遗传育种研究领域中的应用
传学和分子生物学的研究积累了大量的基因序列、分子标记、图谱和功能方面的数据，可通过建立生物信息学数据库来整合这些数据，从而比较和分析来自不同基因组的基因序列、功能和遗传图谱位置［15］。在此基础上，育种学家就可以应用计算机模型来提出预测假设，从多种复杂的等位基因组合中建立自己所需要的表型，然后从大量遗传标记中筛选到理想的组合，从而培育出新的优良农作物品种。
5.生物信息学在生态环境平衡研究领域中的应用
在生态系统中，基因流从根本上影响能量流和物质流的循环和运转，是生态平衡稳定的根本因素。生物信息学在环境领域主要应用在控制环境污染方面，主要通过数学与计算机的运用构建遗传工程特效菌株，以降解目标基因及其目标污染物为切入点，通过降解污染物的分子遗传物质核酸dna，以及生物大分子蛋白质酶，达到催化目标污染物的降解，从而维护空气［16］、水源、土地等生态环境的安全。
美国农业研究中心（ars）的农药特性信息数据库（ppd）提供334种正在广泛使用的杀虫剂信息，涉及它们在环境中转运和降解途径的16种最重要的物化特性。日本丰桥技术大学（toyohashiuniversityoftechnology）多环芳烃危险性有机污染物的物化特性、色谱、紫外光谱的谱线图。美国环保局综合风险信息系统数据库（iris）涉及600种化学污染物，列出了污染物的毒性与风险评价参数，以及分子遗传毒性参数［17］。除此之外，生物信息学在生物防治［18］中也起到了重要的作用。网络的普及，情报、信息等学科的资源共享，势必会创造出一个环境微生物技术信息的高速发展趋势。
6.生物信息学在食品安全研究领域中的应用
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2009年，卫生部立项“十二五”八年制规划教材《生物信息学》的编写工作，并将生物信息学列为八年制医学生的必修课。这是中国现代医学教育的一件大事，一方面体现国家对高等医学人才全面发展、提高理工科理论水平的重视程度；另一方面也表明生物信息学理论已经深入到生物医学科研和实际应用层面，理论生物医学研究已经被国内院校所接受，成为生物医学学科群的重要组成部分[1]。
生物信息学是一门新兴的交叉学科，有非常明显的理工科特性，即在有良好的生物医学背景下，注重数学思维和计算机操作能力，这对于我们目前以医学专业学习为主的高等医学教育产生一定的挑战。如何在有限的学时基础上，完成生物信息学教学任务的同时，让学生初步掌握科研、临床中应用生物信息学的能力，形成理工科处理医学问题的思维，是目前在八年制学生中开展生物信息学教学迫切需要研讨的问题。笔者作为主讲教师于哈尔滨医科大学完成了两轮八年制生物信息学教学任务，通过教学过程、课后调研及考试分析，总结了八年制学生对学习生物信息学的一些认识和学习期间遇到的问题，在这里共同探讨，以便于推进医学院校生物信息学的教学工作，培养更高理论和实践层次的医学人才。
一、授课对象
课程面向临床医学八年制学生93人、基础医学八年制（基地班）学生60人，学生入学录取分数高于生源地重本线50分以上。开课时两个专业的学生均处于大学三年级，已经学完高数、计算机基础等理工基础课，分子生物、细胞生物等生物学基础课，以及组胚、生理等医学基础课，开课学期同时学习遗传、免疫、病理和药理学课程；部分学生参加PBL教学，已经完成呼吸、消化、循环系统的知识学习。
二、教材和课程内容选择
面向两个轨道分别开展《医学信息分析方法》（36学时）和《生物信息学概论》（56学时）两门课程。两个轨道均以人民卫生出版社规划教材《生物信息学》2010年第一版为主讲教材[2]，结合临床医学和基础医学的学科特点，采取教师自主选择内容的方式讲授。
在基础专业中强调生物医学研究数据资源、计算生物医学方法和实验设计手段，系统讲解生物信息学在生物医学研究中的理论和实践技术。讲授内容涉及序列数据资源与分析方法、分子进化、基因表达与调控、蛋白质组学信息学、网络系统生物学、遗传和表观遗传计算分析、疾病的计算系统生物学等较全面的生物信息学方法和理论，要求学生能够在生物医学研究中贯穿理工科分析思维，不仅能熟练运用相应的网络资源和软件工具，还能对生物信息学方法理论有一定了解，熟悉不同方法的扩展性应用。理论和实践课基本按照2比1分配，实践课程根据内容需要选取生物学或医学问题进行全程模拟实验。
三、考试形式和分析
现阶段，两个八年制专业的生物信息学教学以必修考查课形式进行，采取开卷考试、实验报告和标书设计三种考核方式，以便于了解学生对本门课程的学习和对生物信息学研究思想的领悟情况。
开卷考试试题均为主观题，其中理论基础题考查概念、重要的研究思路和经典的研究方法；案例分析题要求学生能够在学过的或书本上的知识基础上，联系生物医学知识进行案例分析，选取相应的方法解决特定的问题；思维拓展题给定学生主题词，由学生进行以生物信息学方法为工具的课题流程设计。考试结果表明学生能够通过学习了解基本的生物信息学方法，并具备初步运用新方法解决实际问题的能力，但考试也反映出，大学三年级学生还具有一定的科研思维局限性，不能够完全把握课题设计过程的创新性和可靠性原则。
实践能力考查主要通过实验报告进行，实验报告要写明研究问题名称、实验数据、处理方法、处理结果和结果分析讨论。通过实验报告的提交，学生基本能够就相应的问题自主选择数据、进行一般性软件分析，并能够对实验结果进行知识面内的讨论和思考，得出符合问题要求的结论。
标书设计作为课后实践，要求学生就自己感兴趣的研究方向进行课题设计。设计内容可以为生物信息学方法研究，也可以以生物信息学为工具进行生物医学问题的探讨和分析。大多数学生能够通过文献查阅、原先具备的生物医学知识总结，发现有意义的生物医学问题，设计内容具有现实意义和一定创新性的，部分课题还有较好的可行性。很多标书设计也暴露出在三年级开展生物信息学时，学生的临床医学知识还比较欠缺，有时候不能很好的发现具有医学意义或应用价值的课题，也比较难于理解生物信息学在实际应用中的价值。
四、学生反馈和教学心得
通过课堂互动、课程临近结束时进行的问卷调查，笔者进一步了解了学生在生物信息学学习过程中的一些困惑，及一些意见和建议。主要问题如下：
1、课程理论性强，计算强度大
学生们普遍反映生物信息学与他们学习的其他课程不一样，生物医学课程偏向于文科性质，主要靠记忆，而生物信息学理科特性很强，需要深入理解分析。另外学生的数理知识有限，感到有些算法比较难，根本听不懂。
2、课程内容多，课时少
许多学生通过学习对生物信息学产生了浓厚的兴趣，真切感受到生物信息学对于他们未来的学习、科研和临床工作将有很大帮助，但是课时太少，不能够在现有课时下理解全部理论。
3、实践课时少，计算机能力薄弱
绝大多数学生都认为生物信息学需要通过理论结合实践的方法来学习才能更好的掌握。现有的实践课程只能完成基本的教学任务，对于众多的研究工具和研究方法只有感性认识。另外大家在实践中也感觉到自身的计算机知识很有限，在高通量数据处理面前力不从心，影响对问题的分析能力。
4、课程开课偏早，背景知识不全
很多学生反映三年级时，八年制学生还没有进行统计学、临床各学科的培养，知识背景不足，很难理解生物信息学中重要的算法公式，也很难对医学问题进行更为深入的思考。
学生们的反馈基本上反映出他们在学习生物信息学时所遇到的困难。笔者所在教研室教师（包括多名规划教材的参编者）共同进行了深入探讨，认为应当根据学生意愿向学校申请①增加理论课课时，分别由24和36增加为28和44学时；②增加实践课课时，分别由12和20增加20和28学时；③适当降低理论难度，减少不必要的数学理论推导，提请学校为八年制学生增设概率统计和计算机编程课程。
生物信息学的理工科特性决定了生物信息学课程在医学教育中开展的难度。虽然医学院校学生课业重、训练强度大，但是现代生物医学发展趋势告诉我们，生物信息学必然在未来的生物医学研究中处于关键地位[3]。不断改进教学手段、加强教学过程的趣味性，更为全面的贯彻以疾病和问题为中心的教学理念，培养理工医结合的现代化医学人才是生物信息教学工作者共同的努力方向，这些理念在不久的将来也会随着教学实践的不断深入而在新版《生物信息学》出版时得到进一步体现。
参考文献
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关键词合成生物学；医药；能源；实践
再现。
1合成生物学与其他学科的关系
1.1合成生物学与系统生物学
合成生物学的出现是与系统生物学的发展密不可分的。从哲学思维上，二者都遵从系统论，生物系统的整体功能不可分割。系统生物学将在基因、蛋白质、代谢物等多维分子水平获得大量的细胞行为知识和建立生物网络，为合成生物学提供理论和模型。合成生物学可为系统生物学的定量分析提供模式生物。
1.2合成生物学与生物信息学、化学
如果把基因组测序看成阅读和解码遗传信息的过程，那么合成生物学就是人工书写和编程过程，是测序的逆过程。这个过程对生物信息学提出了更大的挑战，与所有的工程学一样，合成生物的设计和优化过程中需要用新的算法进行模拟和测试。合成生物的过程是以原料核酸的高速合成为基础的，因此需要高效、低成本的化学合成技术提供支持。目前，常规化学方法合成一个碱基核苷酸商业化价格是2元左右，而新方法有望把成本降到更低。
1.3合成生物学与基因工程
二者既有联系，也有区别。就操作对象和主要技术手段而言，二者相同，都是以基因为对象，都需要核酸酶和连接酶作为剪切和组装的工具，也都需要载体来承载基因，进行扩大繁殖和保存。然而仅采用基因工程技术，只能在较小的范围内对已经存在生命进行改造，合成生物学研究将降低关键技术成本，解决基因操作的经济性问题，从而在工程领域将得到广泛应用。
2医药与能源创新发展中的合成生物学技术
创新药物的发现是整个新药研究中最富创造性的环节。20世纪70年代之后，DNA重组技术、基因组学、蛋白质组学、生物信息学及生物芯片技术的研究成果为新药研究提供了指导性的理论知识和多样化的实验手段，极大地促进了新药的研制和产业化。
2.1DNA重组技术与创新药物研究
DNA重组技术通过人为的基因拼接，构建携带外源目的基因的表达系统，在宿主细胞中表达外源基因编码的蛋白质、多肽类药物。DNA重组技术为创新药物的研究和产业化提供了全新的技术，开创了现代生物技术药物的新阶段。在微生物药物的制备中，具有良好遗传特性的高产菌株是产业化的关键。重组DNA技术已成功地应用于构建具有特定遗传特性的高产菌株。如将放线菌紫红素的合成基因导入紫红链霉菌，产生了新型抗生素二氢榴菌紫红素；将红霉素抗性基因转入红霉素产生菌，可构建出耐自身产物抑制的高产菌株；将透明颤菌的血红蛋白基因导人金霉素产生菌，工程菌可以在低溶氧条件下正常代谢，达到降低供氧能耗的目的。
2.2蛋白质组学与创新药物研究
蛋白质组学（proteomics）是继人类基因组计划之后又一个引人注目的新兴学科。蛋白质组学是从整体蛋白质水平上，从更贴近生命活动规律的角度去探讨机体生理、病理现象及其本质。人体细胞有3000～10000种以上的蛋白质。蛋白质的种类和数量及其功能状态在同一机体的不同细胞中是不相同的，即使是同一种细胞，在不同时期，其蛋白质的种类和数量也不尽相同。正常和病变状态下细胞内的蛋白质谱存在差异，服药前后的蛋白质谱也存在差异，通过定性和定量地分析蛋白质谱的差异，可以探讨疾病发生的可能机制，发现药物作用的新靶点，从而为研发新药，研究药物作用机制以及指导临床合理用药提供重要的依据。
靶向药物的研制是创新药物研制的主流。据统计，已发展了多种类型的功能或疾病靶标，涉及：肿瘤、血液与造血、免疫调节、心肾系统、胃肠系统、神经系统、内分泌系统及泌尿系统等。据Drew报告（2000年），目前使用的、据认为安全有效的多种疾药的分子靶点483个，按生物化学分类，其中受体45％，酶28％，激素与细胞因子11％，其他为离子通道、核多体等。在分子水平对疾病研究结果显示，潜在的药物靶点数目可能为5000～10000个，均可能作为研制药物的作用靶点。
2.3生物信息学与创新药物研究
生物信息学是生物学、数学、计算机科学和信息科学等多学科交叉产生的崭新学科。生物信息学借助计算机强大的信息储存和信息分析功能处理生物学领域、尤其是基因组学和蛋白质组学研究领域中爆炸性增长的海量数据。生物信息学的核心内容至少包括基因组信息学、蛋白质组信息学和代谢调控信息学三大部分。基因组信息学指对基因信息的获取、处理、存储和分析，目的是确定全部基因的确切位置，以及各DN段的功能。蛋白质组信息学包括对有关细胞或组织中的全部蛋白质的结构、组成、功能、定位以及各蛋白质问的相互作用的信息进行处理和分析，目的是确定各种蛋白质的组成、结构和功能及相互作用。
2.4生物芯片技术与创新药物研究
生物芯片（biochip）是近年来生命科学、微电子学和生物信息学结合交叉领域的重大进展。生物芯片分为DNA芯片、RNA芯片、蛋白质芯片、抗体芯片、PCR芯片及药物传输芯片等。生物芯片通过原位化学合成或机械点样构成高密度探针微阵列。比如DNA芯片可在1cm2的玻璃或硅片衬底上，集中排列数万至数十万个DNA探针。从理论上讲，十至数十个这样的芯片就可以全面检查一个人的基因，从而发现结构异常或功能异常的基因。生物芯片主要用于基因序列测定，分析基因组突变和单核苷酸多态性突变位点，同时也用于测定特定基因的表达水平和比较同源基因的表达差异，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分的准确、快速和大信息量的检测。生物芯片技术的发展为疾病的临床诊断和个性化治疗开辟了全新的途径，同时为创新药物的高通量筛选（highthroughputscreening，HTS）提供了强有力的技术支撑平台。
3结束语
合成生物学为很多领域的研究提供新视角：生物学家用它来重建不同层次的研究对象，由此加深对生命活动和生命过程的理解；化学家用它创造新分子化合物；物理学家用它来发现自然状态下分子的运动行为；工程技术人员则用它进行药物、生物材料和生物能源等工程设计并简单、低廉、高效地制造，满足人类和社会发展的需要。
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一、正在出现的技术
Klingler(Lncytepharmaceuticals，PaloAlto，CA，USA)强调基因组学正推动制药业进入信息时代。随着不断增加的序列、表达和作图数据的产生，描述和开发这些数据的信息工具变得对实现基因组研究的任务至关重要。他谈到了Incytepharmaceuticals对大规模基因组数据和生物信息学的贡献。
Lipshutz(Affymetrix，Santaclara，CA，USA)描述了一种利用DNA探针阵列进行基因组研究的方法，其原理是通过更有效有作图、表达检测和多态性筛选方法，可以实现对人类基因组的测序。光介导的化学合成法被应用于制造小型化的高密度寡核苷酸探针的阵列，这种通过软件包件设计的寡核苷酸探针阵列可用于多态性筛查、基因分型和表达检测。然后这些阵列就可以直接用于并行DNA杂交分析，以获得序列、表达和基因分型信息。Milosavljevic(CuraGen，Branford，CT，USA)介绍了一种新的基于专用定量表达分析方法的基因表达检测系统，以及一种发现基因的系统GeneScape。为了有效地抽样表达，特意制作片段模式以了解特定基因的子序列的发生和冗余程度。他在酵母差异基因表达的大规模研究中对该技术的性能进行了验证，并论述了技术在基因的表达、生物学功能以及疾病的基础研究中的应用。
二、基因的功能分析
Overton(UniversityofPennsylvaniaSchoolofMedicine，Philadelphia，PA，USA)论述了人类基因组计划的下一阶段的任务——基因组水平的基因功能分析。这一阶段产生的数据的分析、管理和可视性将毫无疑问地比第一阶段更为复杂。他介绍了一种用于脊椎动物造血系统红系发生的功能分析的原型系统E-poDB，它包括了用于集成数据资源的Kleisli系统和建立internet或intranet上视觉化工具的bioWidget图形用户界面。EpoDB有可能指导实验人员发现不可能用传统实验方法得到的红系发育的新的药物靶，制药业所感兴趣的是全新的药物靶，EpoDB提供了这样一个机会，这可能是它最令人激动的地方。
Sali(Rockefelleruniversity，NewYork，NY，USA)讨论了同源蛋白质结构模建。比较蛋白质模建（comparativeproteinmodeling）也称为同源模建（homologymodeling），即利用实验确定的蛋白质结构为模式（模型）来预测另一种具有相似氨基酸序列的蛋白质（靶）的构象。此方法现在已经具有了足够的精确性，并且被认为效果良好，因为蛋白质序列的一个微小变化通常仅仅导致其三维结构的细微改变。
Babbitt(UniversityofCalifornia，SanFrancisco，CA，USA)讨论了通过数据库搜索来识别远缘蛋白质的方法。对蛋白质超家族的结构和功能的相互依赖性的理解，要求了解自然所塑造的一个特定结构模板的隐含限制。蛋白质结构之间的最有趣的关系经常在分歧的序列中得以表现，因而区分得分低（low-scoring）但生物学关系显著的序列与得分高而生物学关系较不显著的序列是重要的。Babbit证明了通过使用BLAST检索，可以在数据库搜索所得的低得分区识别远缘关系（distantrelationship）。Levitt(Stanforduniveersity，PaloAlto，CA，USA)讨论了蛋白质结构预测和一种仅从序列数据对功能自动模建的方法。基因功能取决于基因编码的蛋白质的三级结构，但数据库中蛋白质序列的数目每18个月翻一番。为了确定这些序列的功能，结构必须确定。同源模建和从头折叠（abinitiofolding）方法是两种现有的互为补充的蛋白质结构预测方法；同源模建是通过片段匹配（segmentmatching）来完成的，计算机程弃SegMod就是基于同源模建方法的。
三、新的数据工具
Riley(MarinebiologicalLaboratory，WoodsHole，MA，USA)在讨论大肠杆菌蛋白质的功能同时，特别提到了GPEC数据库，它包括了由实验确定的所有E.coli基因的功能的信息。该数据库中最大比例的蛋白质是酶，其次则为转运和调控蛋白。
Candlin(PEappliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)介绍了一种新的存储直接来自ABⅠPrismdNA测序仪的数据的关系数据库系统BioLIMS。该系统可以与其它测序仪的数据集成，并可方便地与其它软件包自动调用，为测序仪与序列数据的集成提供了一种开放的、可扩展的生物信息学平台。
Glynais(NetGenics，Cleveland，OH，USA)认为生物信息学中最关键的问题之一是软件工具和数据库缺乏灵活性。但是，软件技术的发展已得到了其它领域如金融业和制造业的发展经验的借鉴，可以使来自不同软件商的运行于各种硬件系统的软件共同工作。这种系统的国际标准是CORBA，一种由250多个主要软件和硬件公司共同合作开发的软件体系。联合使用CORBA和Java可以开发各种通过一个公用用户界面访问任何种类的数据或软件工具的网络应用软件，也包括生物信息学应用软件。Overton不同意Glynias的这种想法，他强调说CORBA仅对软件集成有用，不兼容的数据库软件可能是计算生物学所面临的最困难问题，一些制药公司和数据库仓库最近资助了一项用OCRBA链接不同的数据库的计划[2，3]。
四、制药先导的发现
Burgess(Sturcturalbioinformatics，SanDiego，CA，USA)讨论了填补基因组学和药物设计之间鸿沟的蛋白质结构中的计算问题。在缺乏主要疾病基因或药物靶的精确描述数据的情况下，药物设计者们不得不采用大规模表达蛋白质筛选方法；而结构生物信息学则采用一种更为实用有效的计算方法直接从序列数据中确定靶蛋白质的活性位点的精细结构特征，它利用一种集成专家系统从现实的或虚拟的化学文库中进行迅速的计算筛选，可以达到一个很大的规模。
Elliston(Genelogic，Columbia，MD，USA)讨论了治疗药物开发中发现新的分子靶的过程，着重讨论了基因发现方法。他认为，随着日益临近的人类基因组测序的完成，几乎全部基因的特征将在序列水平得到揭示。但是，对基因的认识将有赖于更多的信息而不仅仅是序列，需要考虑的第一类信息是转录表达水平信息，而Genelogic公司的GeneExpress就是一个由mRNA表达谱、转录因子位点、新基因和表达序列标签组成的数据库。
Liebman(Vysis，Downessgrove，IL，USA)介绍了Vysis公司开发的计算和实验方法，这些主法不仅用于管理序列数据，而且被用于以下用途：分析临床数据库和自然—突变数据库；开发新的算法以建立功能同源性（区别于序列同源性）模拟生物学通路以进行风险评估；药物设计的靶评估；联系复杂的通路特性以便识别副作用；开发疾病发展的定性模型并解释临床后果。
Ffuchs(Glaxowellcome，ResearchTrianglePark，NC，USA)讨论了生物信息学更为广义的影响：它不仅影响到新药物靶基的发现，还对改善药物开发的临床前期和临床期的现状极具重要性。众所周知，涉汲数以千计病人的临床试验（可能是药物开发最为花钱的部分）的设计不论多么仔细，也不能为正确的药物选择正确的病人。而在基因组水平划分病人群体的方法可以大大改善发现新药的效率。Fuchs介绍了一种将病人的基因型和表型标志结合起来以改善临床前期和临床期药物开发过程的系统GeneticinformationSystem.他强调将遗传学和生物信息学数据同化学、生物化学、药理学和医学数据连接起来的集成信息管理和分析方法是极其重要的。
Green(HumanGenomeSciences，Rockville，MD，USA)介绍了他的测序工作中采用的数据管理工具。基于EST的测序方法所面临的挑战是，在对几百个cDNA克复测序之后，产生的数据堆积如山。由于大多数人类基因都是用这种方法发现并在么有数据库中分类编排的，面临的识别开放读框、重叠序列的重叠图谱、组织特异表达和低丰度mRNA基因的任务是令人生畏的。HumangenomeSciences公司开发了一些可用户化数据库工具，在同一个数据库中可包括以下功能：WWW上访问和检索数据，序列拼接，临视潜在药物靶基因的研究进展等。这些能够管理多项任务——从注释基因序列到成功开发基因产物进入药物发现的流程——的软件工具，极其可望从一种基于基因组知识的药物发现方法中得到新的药物靶。
1LimHA，BatttR.TIBTECH，1998;16(3)):104
2Williamsn.Science，1997;277(5328):902
作者简介：赵小英（1973-），女，湖南慈利人，湖南大学副教授
关键词：基因表达；拟南芥；AtWNK9
中图分类号：Q94文献标识码：A
WNK激酶（Withnolysinekinase）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于蛋白激酶家族成员之一，因其家族成员在激酶功能域缺乏保守的赖氨酸而得名该激酶家族成员在通常保守的位于激酶区域第二个亚结构域缺乏一个赖氨酸残基，动物WNK激酶中赖氨酸被半胱氨酸所替代，在植物中常被天冬酰氨（N）或丝氨酸（S）替代，但激酶的生物活性没有发生变化，因此表明WNK激酶是一种特殊的蛋白激酶
生物信息学作为研究过程中的一项技术和开发工具在核酸及蛋白质序列分析及功能预测中发挥重要的作用基因蛋白结构与表达的生物信息学分析结果对后续基因功能研究有重要的指导意义本研究采用生物信息学和生物学实验相结合的手段，对AtWNK9蛋白结构、亚细胞以及基因表达情况进行了分析，这将为进一步研究该基因的功能奠定基础
1材料与方法
11植物材料和载体
拟南芥野生型Col4为哥伦比亚生态型，大肠杆菌DH5α菌株和pA7YFP载体均为本实验室保存
12生物信息学分析
1335S：：AtWNK9YFP融合表达载体构建
以拟南芥野生型Col4为材料，采用RTPCR方法，首先提取总RNA并逆转录为cDNA，然后以此cDNA为模板，利用引物AtWNK9YFPF（ACGCGTCGACATGATGAACAATCTCAGCCATCTT），AtWNK9YFPR（GGACTAGTGTCTTCTTCGTCAGAGTCGTTT）（下划线碱基部分分别为SalⅠ和SpeⅠ酶切序列），通过PCR扩增得到AtWNK9目的基因的全长cDNA序列采用酶切连接的克隆方法，将该片段连接到pA7YFP载体中，构建绿色荧光蛋白与AtWNK9基因融合表达的载体35S：：AtWNK9YFP
14PEG介导的原生质体转化
为确定AtWNK9基因在细胞中表达的具体部位，将上述构建的35S：：AtWNK9YFP进行原生质体转化参照文献[17]的方法，将未抽台前的叶片约90片，切成1mm宽的长条（长度不定），置于500mmol甘露醇溶液中将细条捞出，置于含有纤维素酶和果胶酶的酶解液中，黑暗23℃，40～50r/min解析3h以制备原生质体取约10～20μg35S：：AtWNK9YFP质粒于15mL离心管中，随后依次加入100μL的原生质体和110μLPEG/Ca溶液，轻柔混匀放置20～30min后，去除PEG，用W5溶液（154mMNaCl，125mMCaCl2，5mMKCl，2mMMES）终止反应，然后置于云孔板内23℃黑暗下培养6～18h后，在荧光倒置显微镜下观察和分析AtWNK9的亚细胞定位
15胁迫处理
16实时定量PCR分析
采用TRIGene（GenStar）提取总RNA，按照MaximaFirstStrandcDNASynthesisKit（Fermentas）试剂盒提供的方法，反转录合成cDNA在定量PCR仪（Mx3000P）上，按照SYBRPremixExTaqTM（PerfectRealTime）（TakaRa）定量试剂盒的说明进行定量PCRPCR反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环每个实验至少重复3次，持家基因ACTIN2作为分子内标本研究采用的定量PCR引物见表1
2结果
21AtWNK9蛋白结构分析
运用简单模块构架搜索工具SMART和NCBI中的CDART软件对AtWNK9蛋白进行保守结构域分析，发现AtWNK9在第25到第282个氨基酸区域，包含了一个保守的丝氨酸苏氨酸激酶催化结构域（STYKc）和一个蛋白激酶催化结构域（PKc）（图1（a）），因此，AtWNK9被归类为丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族利用丹麦科技大学（DTU）的CBS服务器上的NetPhos20Server程序对AtWNK9蛋白进行磷酸化位点分析从图中可看出，AtWNK9蛋白氨基酸序列中的17个丝氨酸（S），2个苏氨酸（Thr）和7个酪氨酸（Tyr）蛋白激酶磷酸化位点（图1（b））这说明AtWNK9具有自身磷酸化的特点
22AtWNK9基因亚细胞定位分析
采用WoLFPSORT工具对AtWNK9的亚细胞定位进行预测，得知AtWNK9定位在胞质中；采用TAIR网站中提供的蛋白亚细胞定位数据库SUBA进行预测，得知该基因定位在细胞核中为进一步确定AtWNK9的亚细胞定位，我们采用PEG介导的原生质体转化方法[17]进行了分析研究
首先，采用PCR扩增，得到AtWNK9的全长cDNA序列，大小为1400bp左右（图2（a））用限制性内切酶SaIⅠ和SpeⅠ将该片段和pA7YFP载体进行双酶切，分别得到大小为4900左右和1400bp左右的酶切片段（图2（b））回收酶切片段，用T4DNA连接酶进行连接反应将反应液转化大肠杆菌DH5α，然后对阳性克隆进行PCR和双酶切（HindⅢ和BamHⅠ）鉴定，PCR产物及酶切片段大小与预期片段大小相一致（图2（c），（d）），表明成功构建了35S：：AtWNK9YFP重组质粒随后，以载体35S：：YFP质粒作为对照，将重组质粒35S：：AtWNK9YFP转化拟南芥原生质体，在荧光倒置显微镜下观察融合基因的表达情况（图3）绿色荧光蛋白基因YFP在细胞的所有部位都高效表达（图3（b）），融合基因AtWNK9YFP则仅在细胞核中表达较强（图3（d）），与蛋白亚细胞定位数据库SUBA预测结果相一致，表明AtWNK9编码白
23AtWNK9组织器官表达模式分析
基因的时空表达模式可为预测和研究其生物学
功能提供参考依据根据TAIR网站中eFPBrowser连接提供的数据，对AtWNK9基因在拟南芥不同组织器官中的表达谱进行了分析整理（图4（a））AtWNK9基因在拟南芥植株的根、下胚轴、叶、花等各个组织器官中均有不同水平的表达，在根中的表达量最高此外，AtWNK9在不同部位的叶片、茎、花和花粉中的表达也存在一定的差异但表达水平都比较低（图4（a））为了进一步确定AtWNK9基因在不同组织器官的表达模式，采用实时荧光定量PCR检测了该基因在拟南芥根、莲座叶、茎生叶、茎、花和果荚中的表达情况从图4（b）中可看出，AtWNK9在所有被检测的组织器官中均有表达，其中在根中的表达量最高，约为其它器官中的3～5倍，其次为茎这与eFPBrowser连接提供的数据基本一致，推测AtWNK9可能参与根的生长发育
24AtWNK9基因表达对非生物胁迫的响应
3讨论
对基因的生物信息学分析，可为预测其生物学功能提供参考本研究首先利用生物信息学的手段对AtWNK9的核苷酸及蛋白质序列进行了保守结构域和磷酸化位点分析，发现AtWNK9基因包含与蛋白激酶催化结构域（PKc_）和丝氨酸苏氨酸催化结构域（STYKc）具有高度相似性的结构域，且存在多个磷酸化位点，与WNK激酶家族中其他成员的结构特征一致[23]，因此，AtWNK9具有自身磷酸化特点，这还需作进一步研究
基因的表达部位及表达模式通常与基因的功能有紧密的联系结合生物信息学分析、原生质体转化及荧光定位分析，得知AtWNK9在细胞核中表达，说明AtWNK9基因编码白此外，根据eFPBrowser提供的数据及实时定量PCR分析，证明了AtWNK9基因在拟南芥根中高效表达，这与Wang等的RT～PCR实验结果相吻合，说明AtWNK9可能参与根的生长发育
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