Dr.赛流式小课堂一文看懂老司机的流式细胞表面染色技巧！

流式细胞表面染色主要针对活细胞进行染色，不需要对细胞固定和破膜。

染色流程主要包含以下四步

第一步样品制备

在往期Dr.赛流式小课堂中，我们给大家介绍了几种流式样本制备的方法。可

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问

我需要准备多少细胞来做流式细胞表面染色呢？

答

在单次流式染色体系中，细胞悬液体积通常为100μL，建议细胞数量为106个。可以根据设置的对照组和实验组数目来确定染色所需的细胞悬液体积和细胞量。

第二步Fc受体封闭（可选）

这里带大家回顾一下Fc受体封闭的具体操作流程：

对于含有106个细胞的100μL细胞悬液，加入Fc受体封闭试剂，置于冰上或室温预孵育10-20分钟。封闭之后一般无需清洗即可进行流式抗体染色。

注：小鼠样本用0.5-1μL抗小鼠CD16/32抗体；人源样本用20μL人Fc受体抑制剂。

第三步抗体染色

染色体系

如第一步“样品制备”所述，一个流式染色体系通常为100μL细胞悬液，包含1X106个细胞。抗体染色buffer通常推荐使用商业化的流式染色缓冲液（eBioscience流式染色缓冲液，货号00-4222-57）或者是含有一定浓度牛血清白蛋白或胎牛血清的PBS。

我应如何确定抗体用量呢？

通常来说商品化的流式抗体提供建议用量，可先根据建议用量进行尝试。以赛默飞的CD86抗体（货号：12-0862-82）为例（如下图所示），该抗体建议用量为0.125μg/test。该抗体的浓度为0.2mg/mL，因此在100μL细胞悬液中加入抗体的体积为0.625μL。或者以推荐的抗体用量为基础，使用自己的样本进行抗体滴定，来找到一个更合适的抗体用量。

孵育条件

抗体染色的具体流程

将准备好的样本置于冰上待用。

将推荐量的各种一抗在适当体积的流式细胞术染色液中混合并加入细胞中，使最终的染色体积为100μL（即50μL细胞样品+50μL抗体混合物），或者直接向含有细胞的100uL体系中分别加入所需量的抗体，轻轻地脉冲涡旋混合。

2-8°C或冰上避光孵育30至60min。

加入1mL流式细胞术染色液洗涤细胞，在室温下400-600xg离心5分钟，弃上清。

重复上一步。

[可选]如果染色当天无法上机检测，可以将100μL样品与100μLIC固定液（货号00-8222-48）混合，从而将样品保存在IC固定液中；或者加入1步固定/裂解液（货号00-5333-54）。样品在这些缓冲液中可于2–8°C避光保存3天。

将细胞重悬于合适体积的流式染色缓冲液中（可根据仪器要求以及经验灵活调整重悬的体积）。

第四步细胞死活染色（可选）

如果仅做表面染色，不涉及胞内靶标的染色，可使用7-AAD、PI、SYTOX系列等核酸染料进行死活染色，染色时根据说明书用量在上机前添加即可，无需洗涤。但是核酸类死活染料不兼容后续的样品固定。此外，如果流式抗体偶联NovaFluor染料，也不建议使用这类核酸染料。更多关于如何选择合适的死活染料，请

我们完成了以上染色步骤，后续就可以对样本进行上机检测了。同样，扫一扫下方二维码，查看全血样品的流式细胞表面染色步骤。

扫码了解更多全血样本流式染色步骤

Question&Answer

抗体染色涉及到大分子染料时，我应该使用何种buffer配制抗体呢？

在使用两种或两种以上的SuperBright,BrilliantViolet,BrilliantUltraViolet或其他聚合物染料偶联的流式抗体时，请同时在染色体系中添加SuperBrightCompleteStainingBuffer（产品货号：SB-4401-42）或BrilliantStainBuffer（产品货号：00-4409-75），以降低染料聚合导致的非特异性染色。

如果您使用了NovaFluor偶联的流式一抗，请同时在100μL染色体系中添加5μLCellBloxPlusBlockingBuffer（货号：C001T06F01）。在对巨噬细胞使用偶联了花菁染料（Cyaninedye）的抗体染色时，也需在染色体系中添加这一Buffer。

没有荧光直标的流式抗体怎么办？

对于没有荧光直标的流式抗体，有以下几种解决方案：

（1）选择一款荧光标记的二抗，此时需要考虑二抗与一抗的种属和亚型搭配。如果做多重染色，则需要同时注意该二抗不会识别其它直标的流式一抗。

（2）如果是生物素标记的一抗，可以使用荧光标记的链霉亲和素。

（3）自行将流式抗体标记荧光基团。赛默飞有可用于标记抗体的试剂。如果您在选择方面有疑问，请

这里还有流式染色细胞表面课程

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流式细胞术是重要的细胞分析方法学，赛默飞世尔科技的Gibco、Invitrogen和ThermoScientific产品品牌可提供从流式仪器到抗体和试剂的流式整体解决方案。其中InvitrogeneBioscience陪伴着每一代流式科学家和技术人员获得成果、共同成长，这些年来我们一起见证以Anti-FoxP3为代表的流式抗体深受喜爱、更多种类的流式荧光染料欣然上市以及现在有着更丰富的产品和工具，满足高校研究院、生物技术公司、药企等从早期基础研究到临床转化和生产等不同阶段的需求，加速生命科学行业的进程发展。