我所按中国药典2005版微生物限度法及方法学验证法，对32种保健食品进行方法学验证，结果表明其中15个品种（活谓素得而乐胶囊、忘不了3A脑营养胶囊、金舒通胶囊、仙牌灵芝茶、事轻松胶囊、华济堂牌护肝灵胶囊、全虫草胶囊、再高铁儿童成长口服液、血尔口服液、瞳神牌轻亮、养颜鹿胎粉、梦玉胶囊、绅宁宝胶囊、博士伦博视康牌叶黄素片、二月红牌红润片）分别对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有抑菌作用，染菌回收率均低于70%。结果说明：1、采用GB/T4789.1~4789.31~2003食品微生物限度检查法不能真实反应产品质量，因而不宜采用；2、应分别采用培养基稀释法和薄膜过滤法进行方法学验证。3、微生物限度方法学验证的必要性。保健食品的微生物限度检验方法验证浅析关键词方法学验证、微生物限度、回收率、保健食品质量。保健食品的微生物限度检验方法验证浅析一、实验目的确认对保健品进行微生物限度检查时，所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法是否适合于该保健品的微生物限度检查。保健食品的微生物限度检验方法验证浅析样品
20060525保健食品的微生物限度检验方法验证浅析（24）前烈立舒胶囊QLS05222香港奥美制药厂（25）二月红牌红润片20
中天(上海)营养食品有限公司（26）绅宁宝胶囊、香港康恩堂制药有限公司（27）博士伦博视康牌叶黄素片1515、1525、1535德国博士曼大药厂（28）全虫草胶囊2006210西藏天知生物科技开发有限公司（29）觉父胶囊、20050327香港奥美制药厂（30）苦瓜精华素片3117、3500美国GSL科技有限公司（31）宁烈宁胶囊、20050509香港奥美制药厂（32）富威牌剑影胶囊021333北京富威生物科技开发公司保健食品的微生物限度检验方法验证浅析二、培养基胆盐乳糖增菌液批号：040324玫瑰红钠琼脂批号：050316营养琼脂批号：050310营养肉汤批号：041010改良马丁琼脂批号：050520改良马丁琼脂液体批号：040302曙红亚甲蓝琼脂批号：040413葡萄糖肉浸液肉汤批号：040902EMB批号：040413麦康凯批号：050608血营养琼脂批号：050310沙门、志贺菌属琼脂批号：050121胰酪胨大豆肉汤批号：050422DHL批号：0501274-甲基伞形酮葡萄糖苷(MUG)050127GN批号：040224四硫酸钠煌绿增菌液TTB批号：040413
以上培养基均由中国药品生物制品检定所提供，另由本室本室自行配制胆盐乳糖增菌液（小倒管）10ml。保健食品的微生物限度检验方法验证浅析三、菌种
枯草杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(F)44102]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]
弗氏志贺菌（Shigellaflexneri）[CMCC(F)51573]乙型溶血性链球菌（β－Hemolyticstreptococcus）[CMCC(F)32210]沙门氏菌（Salmonellaparatyphi）[CMCC(B)50094]保健食品的微生物限度检验方法验证浅析四、方法验证1、菌液制备：（1）取经37℃培养18-24小时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、乙型溶血性链球菌、福氏痢疾肉汤培养物1ml+9ml盐水10倍稀释至10-5~10-7为50~100CFU/ml，做活菌计数备用。（2）取经25℃培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml+9ml盐水10倍稀释至10-5为50~100CFU/ml，做活菌计数备用。（3）取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3~5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用标准比浊管比浊，与浊度相当后，取1ml+9ml盐水=10-1，逐管10倍稀释为10-4约50~100CFU/ml，做活菌计数备用。保健食品的微生物限度检验方法验证浅析菌液的检验
a取金黄色葡萄球菌50~100cfu/ml，接种胆盐乳糖增菌培养基中，置35培养经24~48小时，阴性菌对照菌组为阴性（未生长）。
b取大肠埃希菌50~100cfu/ml，接种亚酸盐肉汤增菌培养基中置35培养经24~48小时，阴性菌对照菌组为阴性（未生长）。保健食品的微生物限度检验方法验证浅析五、结果菌落计数
金葡菌10-6枯草杆菌10-5大肠杆菌10-6忘不了3A脑营养82.4常规法已通过常规法已通过活谓素得而乐胶囊82.6常规法已通过常规法已通过再高铁儿童成长口服液常规法已通过40.6常规法已通过养颜鹿胎粉常规法已通过38.2/金舒通胶囊常规法已通过70.2常规法已通过仙牌灵芝茶常规法已通过70.0常规法已通过事轻松胶囊常规法已通过100.0常规法已通过华济堂牌护肝灵胶囊82.975.997二月红牌红润片0.5ml/皿100.00.0、11.1常规法已通过全虫草胶囊0.5ml/皿常规法已通过85.9、92.6常规法已通过富威牌剑影胶囊0.5ml/皿常规法已通过常规法已通过100.0表3回收率小于70％的品种采用培养基稀释法
（0.2-0.5ml/皿）回收率（%）
保健食品的微生物限度检验方法验证浅析从表3中结果看出活谓素得而乐胶囊、忘不了3A脑营养、金舒通胶囊、仙牌灵芝茶、事轻松胶囊、华济堂牌护肝灵胶囊等6个品种采用培养基稀释法0.2ml/皿，全虫草胶囊和富威牌剑影胶囊采用培养基稀释法0.5ml/皿，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌回收率均超过70%，使细菌正常生长，可采用培养基稀释法测定。再高铁儿童成长口服液，养颜鹿胎粉经培养基稀释法（0.2ml/皿）测定，对枯草杆菌回收率仍低于70%；二月红牌红润片采用稀释法进行检测（0.5ml/皿）枯草杆菌回收率不稳定，均低于70%，故用薄膜过滤法进行方法学验证。而对回收率很低品种，血尔口服液、瞳神牌轻亮胶囊、梦玉胶囊、绅宁宝胶囊、博士伦博视康牌叶黄素片，可直接采用薄膜过滤法进行方法学验证。保健食品的微生物限度检验方法验证浅析表1—6结果
目前，保健食品按国标GB/T4789.1~4789.31~2003食品卫生微生物学检验方法进行检验，该标准中仅提供了一般检验方法，并没有提供方法验证的内容和要求。而保健食品中一些成分和添加剂的使用往往对微生物的生长具有抑制作用，仅依据国标（GB/T4789.1~4789.31~2003）方法无法去除这些因素对检验结果的影响，从而无法保证结果的科学、可靠。为此采用2005版中国药典微生物限