胡冰1,王华1,张冬冬1,于春艳2,刘恒明3
(1.大连海洋大学水产与生命学院辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心,辽宁大连116023;2.国家海洋环境监测中心,辽宁大连116023;3.大连海洋大学海洋科技与环境学院,辽宁大连116023)
关键词：纳米TiO2;Cu(Ⅱ);Zn(Ⅱ);小球藻;新月菱形藻;毒性
近年来,沿海地区经济和工业的迅速发展,有毒重金属元素随工农业废水排放进入水环境,部分近岸海域重金属污染状况日益严重。海洋生态系统中的重金属污染可以引起生态系统中各级生物的不良反应,甚至危害生态系统中各类生物的生存[5]。Zn和Cu是藻类生长所必须的微量元素,但高浓度Zn能导致细胞膜通透性增加并引起细胞形态变异[6],高浓度Cu是一种典型的细胞抑制剂[7]。
微藻是水生生态系统中最重要的初级生产者,微藻的种群结构可以影响水域生态系统的物质循环和能量流动[8]。关于单一毒物对微藻的毒性作用已有较多研究[9],但在实际的水环境中,微藻可能受到多种毒物的共同作用。当纳米材料与重金属污染物在水环境中共存时,可能对微藻产生联合毒性作用,但目前有关纳米材料与重金属共存对海洋微藻联合毒性作用的研究较少。本研究中,以小球藻Chlorellasp.和新月菱形藻Nitzschiaclosterium为受试生物,选择TiO2纳米颗粒、重金属Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)作为毒物,考察不同浓度TiO2纳米颗粒、重金属Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的单一急性毒性,以及TiO2纳米颗粒和Cu(Ⅱ)、TiO2纳米颗粒和Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的联合毒性,研究结果可为纳米材料的环境安全性评价提供参考资料。
1.1材料
小球藻Chlorellasp.和新月菱形藻Nitzschiaclosterium由大连海洋大学藻种间提供。
纳米TiO2(P25,Degussa),含量＞99.5%,粒径约为20nm,混晶型。CuSO4·5H2O和ZnSO4·7H2O均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。
1.2方法
1.2.1试验液的配制纳米TiO2、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)的储备液均用超纯水配制而成,浓度均为1g/L,使用时稀释至试验所需浓度。试验用海水为经沙滤的大连市黑石礁近岸表层海水,盐度为30,pH为8.0,煮沸后使用。本试验中所用自然海水中Cu(Ⅱ)的本底值为0.16μg/L,Zn(Ⅱ)的本底值为0.28μg/L。
1.2.2微藻培养将处于指数生长期的小球藻与新月菱形藻接种到含有康威营养盐[10]的海水中,培养温度为(20±1)℃,明暗周期为12h∶12h,光照强度约为3000lx,每天摇瓶3次。小球藻起始密度约为1×106cells/mL,新月菱形藻起始密度约为2×105cells/mL。
1.2.3纳米TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的单一毒性试验参照微型(单细胞)藻类毒性试验方法[11],采用96hEC50(引起50%微藻生长被抑制的毒物浓度)作为评价指标。在预试验基础上,将纳米TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的浓度均设为3.0、6.0、9.0、12.0、15.0mg/L,空白对照组不加任何毒物,每个试验组设置3个平行。自接种之日起每隔24h取样一次,用血球计数板计数,记录96h的微藻生长情况。
采用SPSS19.0软件通过概率单位法[12]计算出各个毒物的EC50值,通过单因素方差分析法(ANOVA)对3种毒物的EC50数据进行分析,显著性水平设为0.05。
1.2.4纳米TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)的联合毒性试验对纳米TiO2和重金属的联合毒性评定采用Marking相加指数AI(Additiveindex)法[11]。以纳米TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的单一急性毒性试验为基础,按TiO2和Cu(Ⅱ)以及TiO2和Zn(Ⅱ)浓度比均为1∶1接种藻液,进行联合毒性试验。每隔24h取样计数。
用SPSS19.0软件的Probit过程计算出TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对两种海洋微藻的EC50。计算公式为
M=am/a1+bm/b1。
其中:M实际联合毒性生物学作用之和;a1和b1分别为纳米TiO2和重金属Cu(Ⅱ)或Zn(Ⅱ)单独暴露时的毒性;am和bm分别为纳米TiO2和重金属混合暴露下,溶液达到相同毒性时纳米TiO2和重金属的浓度。将M转换为纳米TiO2和重金属联合毒性的相加指数AI,当M≤1时,AI=1/M-1;当M≥1时,AI=1-M。通过AI可以确定纳米TiO2和重金属联合毒性的作用类型,当AI=0时,纳米TiO2和重金属联合毒性为加和作用;当AI＞0时,纳米TiO2和重金属联合毒性作用为协同作用,AI加1即为混合物的毒性增大系数;当AI＜0时,表示纳米TiO2和重金属联合毒性作用为拮抗作用,AI减1后绝对值的倒数即为混合毒物的毒性增大系数。
2.1纳米TiO2、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的单一毒性
图1纳米TiO2、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)对小球藻的EC50Fig.1EC50ofTiO2nanoparticles,Cu(Ⅱ)andZn(Ⅱ)toChlorellasp.
图2纳米TiO2、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)对新月菱形藻的EC50Fig.2EC50ofTiO2nanoparticles,Cu(Ⅱ)andZn(Ⅱ)toNitzschiaclosterium
此外,由图1和图2还可知,纳米TiO2对小球藻和新月菱形藻24hEC50分别为45.843、17.591mg/L,48hEC50分别为39.973、17.457mg/L,72hEC50分别为11.793、13.406mg/L,96hEC50分别为11.655、13.693mg/L。以上结果表明,在24h、48h,纳米TiO2对新月菱形藻的毒性强于对小球藻;但在72h、96h,纳米TiO2对小球藻的毒性强于对新月菱形藻。张宁等[13]研究发现,纳米TiO2(粒径为20～35nm)对小球藻Chlorellasp.、中肋骨条藻Skeletonemaceaecostatum、微囊藻Microcystissp.、斜生栅藻Scenedesmusobliquus、莱茵衣藻Chlamydomonasreinhardi的72hEC50为10～26mg/L,毒性表现为叶绿素a和可溶性蛋白质含量下降,脂质氢过氧化物含量积累。朱小山等[14]研究发现,纳米TiO2(粒径为20nm,锐钛矿型)对斜生栅藻的96hEC50为15.262mg/L。Hund-Rinke等[15]研究了纳米TiO2对近具刺链带藻Desmodesmussubspicatus的毒性,结果表明,6hEC50为14mg/L。Wang等[16]研究表明,纳米TiO2(平均粒径为21nm)浓度≥10mg/L时会抑制衣藻Chlamydomonassp.的生长。本试验研究结果基本与上述研究结果相类似。
Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)是工业发达地区近岸海域海水中常见的重金属污染物。Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)对牟氏角毛藻Chaetocerosmuelleri[17]、三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum[18]、栅藻Scenedesmussp.[19]的毒性顺序均为Cu(Ⅱ)＞Zn(Ⅱ)。在本试验中,对两种海洋微藻的毒性强弱顺序也均为Cu(Ⅱ)＞Zn(Ⅱ),与已有的研究报道一致。
2.2纳米TiO2+Cu(Ⅱ)、纳米TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的联合毒性效应
纳米TiO2在水中易于吸附其他污染物,使其对水生生物的毒性发生变化[21-22]。Hartmann等[23]研究发现,粒径为30nm的TiO2能快速吸附水中的Cd(Ⅱ),并增加对绿藻生长的抑制,说明Cd(Ⅱ)有效浓度的减少不一定意味着重金属的毒性减弱。但是,辛元元[9]研究发现,纳米TiO2与重金属Cd(Ⅱ)共存时,因其可吸附水中的Cd(Ⅱ),从而降低了对绿藻的毒性。本研究中运用Marking相加指数法求得纳米TiO2和重金属联合毒性的相加指数AI,结果见表2。由于纳米TiO2和重金属联合毒性的AI值均为负数,可见TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻24h至96h的联合毒性效应均为拮抗作用,即TiO2+Cu(Ⅱ)和TiO2+Zn(Ⅱ)对海水中小球藻或新月菱形藻的毒性效应,均小于它们分别单独作用所产生的毒性效应。本研究表明,纳米TiO2和重金属离子共同存在于海水中时,对两种海洋微藻的毒性作用会有所降低。
表1TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的EC50Tab.1JointEC50ofTiO2+Cu(Ⅱ)andTiO2+Zn(Ⅱ)toChlorellasp.andNitzschiaclosteriummg/L
微藻microalgae溶液solution24hEC5048hEC5072hEC5096hEC50小球藻Chlorellasp.TiO2+Cu(Ⅱ)TiO2+Zn(Ⅱ)12.15612.92011.66112.83310.21311.8469.28711.084新月菱形藻NitzschiaclosteriumTiO2+Cu(Ⅱ)TiO2+Zn(Ⅱ)13.36415.72312.95215.58311.05313.33410.63212.954
表2TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻的联合毒性相加指数AITab.2JointAIvaluesofTiO2+Cu(Ⅱ)andTiO2+Zn(Ⅱ)toChlorellasp.andNitzschiaclosterium
微藻microalgae溶液solution相加指数AIjointadditiveAIvalues24h48h72h96h小球藻Chlorellasp.TiO2+Cu(Ⅱ)TiO2+Zn(Ⅱ)-0.168-0.191-0.309-0.322-0.737-0.952-0.708-0.912新月菱形藻NitzschiaclosteriumTiO2+Cu(Ⅱ)TiO2+Zn(Ⅱ)-0.770-0.926-0.752-1.005-0.884-0.948-0.853-0.920
表3TiO2+Cu(Ⅱ)、TiO2+Zn(Ⅱ)对小球藻和新月菱形藻联合毒性的增大系数Tab.3JointaugmentationcoefficientofTiO2+Cu(Ⅱ)andTiO2+Zn(Ⅱ)toChlorellasp.andNitzschiaclosterium
微藻microalgae溶液solution增大系数jointaugmentationcoefficient24h48h72h96h小球藻Chlorellasp.TiO2+Cu(Ⅱ)TiO2+Zn(Ⅱ)0.8560.8400.7640.7560.5760.5120.5850.523新月菱形藻NitzschiaclosteriumTiO2+Cu(Ⅱ)TiO2+Zn(Ⅱ)0.5650.5190.5710.4990.5310.5130.5400.521
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ToxicityofTiO2nanoparticles,Cu(Ⅱ)andZn(Ⅱ)toChlorellasp.andNitzschiaclosterium
HUBing1,WANGHua1,ZHANGDong-dong1,YUChun-yan2,LIUHeng-ming3(1.EngineeringResearchCenterofShellfishCultureandBreedinginLiaoningProvince,CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian116023,China;2.NationalMarineEnvironmentalMonitoringCenter,Dalian116023,China;3.CollegeofMarineScienceandEnvironment,DalianOceanUniversity,Dalian116023,China)
Abstract：ThetoxicityofTiO2nanoparticlesandCu(Ⅱ),Zn(Ⅱ)onChlorellasp.andNitzschiaclosteriumwasinvestigatedusingtheaquatictoxicologymethod.Theoneway-toxicitytestshowedthatthe96hEC50valueofTiO2nanoparticleswas11.655mg/LforChlorellasp.and13.693mg/LforNitzschiaclosterium.The96hEC50valueofCu(Ⅱ)was10.197mg/LforChlorellasp.and10.330mg/LforNitzschiaclosterium,andthe96hEC50valueofZn(Ⅱ)was11.033mg/LforChlorellasp.and13.583mg/LforNitzschiaclosterium.TheEC50ofjointtoxiceffectofTiO2+Cu(Ⅱ)andTiO2+Zn(Ⅱ)wasdecreasedwithelapseoftheexperiment.The96hEC50valueofTiO2+Cu(Ⅱ)andTiO2+Zn(Ⅱ)onChlorellasp.was9.287mg/Land11.084mg/L,respectively.ForNitzschiaclosterium,the96hEC50valueofTiO2+Cu(Ⅱ)andTiO2+Zn(Ⅱ)was10.632mg/Land12.954mg/L,respectively.TheadditiveindexmethodreleavedthatthejointtoxicityofTiO2+Cu(Ⅱ)andTiO2+Zn(Ⅱ)onChlorellasp.andNitzschiaclosteriumbothwereantagonism.
Keywords：TiO2nanoparticle;Cu(Ⅱ);Zn(Ⅱ);Chlorellasp.;Nitzschiaclosterium;toxicity
中图分类号：S949
文献标志码：A
收稿日期：2014-12-09
基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目(2014020149)
作者简介：胡冰(1990—),男,硕士研究生。E-mail:872268519@qq.com
通信作者：王华(1973—),男,博士,副教授。E-mail:wanghua@dlou.edu.cn