本发明涉及3d-pcr检测领域，具体而言，涉及一种检测egfr基因第19号外显子缺失突变的试剂盒、方法及其应用。
背景技术：
目前，对于低频突变或稀有突变的检测方法主要包括直接测序法、突变扩增阻滞系统(amplificationrefractorymutationsystem，arms)等。其中直接测序法是突变检测的“金标准”方法，包括sanger测序法及高通量测序技术(high-throughputsequencing)又称“下一代”测序技术("next-generation"sequencingtechnology)。arms技术基于实时荧光定量pcr平台，利用特异引物对突变靶序列进行高精准pcr扩增放大，并使用荧光信号对扩增分子进行标记。通过对荧光信号的检测，实现对样品dna中稀有突变的检测。
直接测序法步骤繁琐，试验周期长(一般需2-3天)，对操作人员技术水平要求高，因此难以在大面积推广。更为重要的是测序技术本身灵敏度很低，只能检测15％以上的突变。而对于杂合性突变，即基因dna双链中仅有一条发生突变，而这种突变在检测样本中的比例小于10％，该测序方法根本就无法检出。
基于实时荧光定量pcr的arms法虽然灵敏度较高，但其试剂较为昂贵，其引物最后一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型dna的扩增，所以这种方法存在假阳性的风险较高。且实时荧光定量pcr平台只能进行相对定量，检测过程中需要引入标准品制作标准曲线用以进行标定。而且目前为止，arms-pcr灵敏度最低也只能达到1％，对于某些游离dna的检测并无明显优势。
因此，如何对低频突变或稀有突变进行有效地、高灵敏度地检测，目前尚未有效的解决方案。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种检测egfr基因第19号外显子缺失突变的试剂盒、方法及其应用，以解决现有方法检测egfr基因的缺失突变存在效率低的问题。
进一步地，试剂盒还包括荧光探针组合，该荧光探针组合包括缺失突变荧光探针和野生型荧光探针，缺失突变荧光探针为：5′-fam-aaagccaacaaggaaat-mgb-nfq-3′；野生型荧光探针为：5′-vic-tgtctggcagctgc-mgb-nfq-3′。
进一步地，试剂盒还包括野生型扩增引物对，野生型扩增引物对为：野生型上游引物：5′-aacctcaggcccaccttttct-3′，野生型下游引物：5′-atgtggagatgagcagggtctag-3′。
进一步地，试剂盒还包括dna受体阻滞剂，dna受体阻滞剂的序列为缺失突变体相对于野生型所缺失的序列的互补序列。
进一步地，dna受体阻滞剂的序列为5′-gaattaagagaagca-mgb-3’；优选地，dna受体阻滞剂的工作浓度为10～500nmol/l，更优选为100～500nmol/l，进一步优选为200nmol/l。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测egfr基因第19号外显子缺失突变的方法，该方法包括：采用上述任一种试剂盒，利用3d-pcr的方法对egfr基因第19号外显子缺失突变进行检测，得到检测数据；以及对检测数据进行读取和分析，得到突变结果。
进一步地，试剂盒包括缺失突变扩增引物对、野生型扩增引物对、荧光探针组合以及dna受体阻滞剂，采用上述任一种试剂盒，利用3d-pcr的方法对混合物进行检测，得到检测数据；优选地，样品dna模板的最低检测浓度为10～66ng，优选为30ng；优选地，缺失突变扩增引物对、野生型扩增引物对和dna受体阻滞剂的工作浓度为10～500nmol/l，更优选为100～500nmol/l，进一步优选为200nmol/l；优选地，荧光探针组合中，野生型荧光探针的浓度为10～500nmol/l，更优选为150nmol/l；优选地，缺失突变荧光探针的浓度为10～1000nmol/l，更优选为450nmol/l。
进一步地，3d-pcr的方法包括依次进行变性、退火以及延伸的步骤，其中，退火步骤中的退火温度为56～60℃。
根据本发明的另一方面，提供了一种上述任一种试剂盒在3d-pcr法检测egfr基因第19号外显子缺失突变中的应用。
进一步地，该应用为非诊断目的的应用。
应用本发明的技术方案，采用本申请所提供的19对针对egfr第19号外显子不同缺失突变位点的特异性引物对，当待检测样品存在上述任一种缺失突变时，采用本申请的方法一次即可检测出来，而不需多次检测进行一一排除。因而，当试剂盒中含有上述至少两对特异性引物对时，相比现有技术中单次经仅能检测一个位点相比，也提高了检测效率。当然，当试剂盒中含有的上述特异性引物对的对数越多，其一次检测的效率就越高。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了本申请中探针及引物设计的示意图；以及
图2、图3和图4示出了根据本申请的试剂盒所检测的结果示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有技术中对egfr基因的19号外显子上的缺失突变进行检测时存在仅能对单一缺失突变位点进行检测，因而存在检测效率低的问题。为了更高效、更准确地检测egfr基因第19号外显子上的缺失突变，本申请根据egfr基因第19号外显子不同位点的缺失突变，设计特异性扩增不同缺失突变类型的引物，并通过特异性的fam探针，计数发生缺失突变的dna片段的扩增拷贝数。同时，在野生型egfr基因的第19号外显子对应的缺失突变发生位置设计特异性dna受体阻滞剂，使得野生型中该段退火温度提高，从而阻止野生型片段扩增引起fam信号释放。而采用特异的vic探针来标记野生型。采用上述组合的引物和探针对样品进行检测，能够通过一次实验，检测出可能存在的缺失突变，而无需多次实验分别进行排除，提高了检测效率。而且，尤其适用于通过3d-pcr的方法进行检测，能够进一步将检测灵敏度提高至0.1％。
本申请的具体实验步骤如下：
(一)特异性引物的筛选
设计引物：从ncbi上获得人egfr(nm_005228.3)基因的dna序列，设计出19种上游引物f1-f19和1种下游引物p分别能扩增出包含egfr19号外显子上的19种缺失突变类型，设计出1对上下游引物(wt-f，wt-p)能扩增egfr野生型(wt)序列，这些引物扩增的片段大小均为100bp左右。引物序列如下表1所示。
表1：
引物和dna阻滞剂浓度优化：对筛选得到的引物进行浓度优化，上游引物和下游引物分别设置不同的浓度，终浓度从100nm(1nm为1nmol/l的简写)到500nm，使用qpcr进行验证，结果显示引物和dna阻滞剂工作浓度在200nm时qpcr的ct值出现的最早，因此优化得到最佳引物终浓度为200nm。
扩增循环数优化：根据反应体系中起始的模板拷贝数、引物浓度及最适ct值，用qpcr对扩增循环数进行优化。分别设置循环数为35、40、45，根据溶解曲线分析发现当循环数为40时已出现明显的平台期，扩增曲线优于另外两个循环数的扩增曲线。因此，确定最适扩增循环数为40个循环。
(二)特异性探针和dna受体阻滞剂的筛选
(1)设计探针：针对上述筛选得到的特异性引物，第19号外显子的19种突变位点(c.2239_2253del15，c.2237_2255>t，c.2240_2251del12，c.2239_2258>ca，c.2239_2256del18，c.2239_2247delttaagagaa，c.2240_2257del18，c.2239_2251>c，c.2235_2252>aat，c.2239_2248ttaagagaag>c，c.2238_2248>gc，c.2236_2253del18，c.2236_2250del15，c.2238_2252>gca，c.2240_2254del15，c.2237_2251del15，c.2237_2254del18，c.2238_2255del18，c.2235_2249del15)设计得到与其配合使用的特异性探针和dna受体阻滞剂。
探针的核苷酸序列如下：
野生型荧光探针seqidno:23：5′-vic-tgtctggcagctgc-mgb-nfq-3′
缺失突变荧光探针seqidno:24：5′-fam-aaagccaacaaggaaat-mgb-nfq-3′。
dna受体阻滞剂的序列seqidno:25为5′-gaattaagagaagca-mgb-3’。
探针浓度优化：使用上述筛选的引物和优化的浓度200nm，dna模板浓度为30ng。尝试各种不同的探针浓度，使用3dpcr分别进行检测，最终确定当vic探针浓度150nm、fam探针浓度450nm时得到扩增效率最高，点图效果最好。因此，最优选的探针终浓度为vic探针浓度150nm、fam探针浓度450nm。
最佳tm值筛选：使用上述筛选得到的最适探针、引物和模板浓度，在不同tm值(分别为56℃、58℃、60℃、62℃)条件下进行3dpcr实验，最终确定当tm值为60℃时得到的扩增效率最高，点图效果最好。因此，最佳tm值确定为60℃。
(三)最低检测限
根据检测需求，在检测最低突变频率方面需要达到0.1％。因此，本申请在特定突变频率下，反应终体系中核酸浓度的最低检测限进行性能评估，最终确定的最低检测浓度与已经设定好的0.1％突变检测频率共同设定为最低检测限。
在确定最低上样量的过程中选取3个梯度进行试验，其上样量为30、20、10ng，每种上样量平行检测5次，分别计算阳性检出率。
以上样量为自变量，阳性检出率p(p＝实际检出阳性数量/5)为因变量，利用spss进行probit回归处理，得到阳性检出率在95％时的上样量值(n)和95％ci，得到一个取值范围n1<n<n2。
在(n1，n2)范围内选取任意两个或者多个值作为上样量(取值由高到低)，平行检测20次，直至阳性检出率<95％时。最终确定在突变检测频率为0.1％时的最低检测浓度为30ng。
(四)特异性和灵敏度
本实验中用来检测vic探针的阴性参考品为含野生型egfr基因的dna片段；用来检测fam探针的阳性参考品为含有egfr19del的dna片段。以这两种dna片段为模板，用3dpcr系统对探针的特异性和灵敏度进行测试(具体参考样品如下表2)。
特异性检测：用最终确定的反应终体系分别对编号为n-h的阴性参考品n-h和编号为n-lc的阴性参考品各检测10次，检测结果全部判定为阴性，具体见下表2。
表2：
灵敏度检测(对19种阳性位点)：用最终确定的反应终体系分别对不同突变频率的阳性参考品各平行检测3次，检测结果全部判定为阳性，且检测突变频率在各个阳性参考品的突变频率置信区间内，具体结果见表3。
表3：
附：上表中的p表示positive，阳性。
采用本申请提供的上述引物和探针，通过3d数字pcr的方法能够准确地检测血浆游离dna中egfr基因的第19号外显子中缺失突变情况，这与现有的基于实时荧光定量pcrarms方法相比，有以下优点：
本申请的引物及taqman探针能特异性的识别匹配靶序列，不存在假阳性的风险。而arms方法中，引物最后一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型dna的扩增，存在假阳性的风险。
而且，3d数字pcr技术与传统的实时荧光定量pcr方法完全不同。3d数字pcr的处理方式是将样品处理分割成多个单独的实时荧光定量pcr反应；这些反应之中的一部分含有靶标分子(阳性)，而另外的则不含靶标分子(阴性)。在经过pcr扩增和信号分析后，根据阴性反应的比例对样品中的靶标分子数目进行绝对计数，而不必参照标准品或内源性对照。
在整个工作流程中，密封式的芯片设计，使得样本之间保持完全隔离，可以有效地防止样品交叉污染，减少移液过程，简化操作步骤；同时也避免了微滴式系统可能面临的管路堵塞问题。
根据本申请的上述实验结果，当采用上述19对针对egfr第19号外显子不同缺失突变位点的特异性引物对，当待检测样品存在上述任一种缺失突变时，采用本申请的方法一次即可检测出来，而不需多次检测进行一一排除。因而，当试剂盒中含有上述至少两对特异性引物对时，相比现有技术中单次经仅能检测一个位点相比，也提高了检测效率。当然，当试剂盒中含有的上述特异性引物对的对数越多，其一次检测的效率就越高。
本申请的上述试剂盒，根据实际需要还包括缺失突变荧光探针和野生型荧光探针，以便于采用荧光探针来分别标记突变和正常对照，从而检测突变频率。具体的缺失突变荧光探针和野生型荧光探针可以根据现有荧光探针及上述特异性扩增引物对进行合理设计。缺失突变荧光探针与缺失突变扩增引物对之间的设计原则是：探针位置在引物对中间，特异性锚定突变序列，而缺失突变荧光探针在dna受体阻滞剂的阻滞下，不能对野生型的扩增片段进行标记，进而特异性标记缺失突变的扩增片段。而野生型荧光探针与野生型扩增引物之间的设计原则是探针在扩增引物对中间，探针特异性结合在选定的野生型序列位置。按照上述原则及现有的荧光标记可以设计合适的荧光探针。
在本申请一种优选的实施例中，试剂盒还包括dna受体阻滞剂，dna受体阻滞剂的序列为缺失突变体相对于野生型所缺失的序列的互补序列。优选地，dna受体阻滞剂的序列为5′-gaattaagagaagca-mgb-3’。更优选地，该试剂盒还包括缺失突变荧光探针和野生型荧光探针，缺失突变荧光探针为：5′-fam-aaagccaacaaggaaat-mgb-nfq-3′；野生型荧光探针为：5′-vic-tgtctggcagctgc-mgb-nfq-3′。
采用本申请的上述荧光探针和dna受体阻滞剂与本申请的上述缺少突变扩增引物对配合使用，能够更有效、更准确地检测efgr基因的第19号外显子中的缺少突变。
上述试剂盒中，野生型扩增引物对可以根据缺少突变引物对的设计位置，在非缺少突变位置进行合理设计，也可以利用现有的与上述缺失突变扩增引物对能够配合使用的野生型扩增引物对。在本申请一种优选的实施例中，上述野生型扩增引物对为：野生型上游引物：5′-aacctcaggcccaccttttct-3′，野生型下游引物：5′-atgtggagatgagcagggtctag-3′。采用本申请的上述野生型扩增引物对与本申请的上述缺失突变扩增引物对配合使用，具有检测更准确更高效的优势。
基于上述研究结果，在本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种检测egfr基因第19号外显子缺失突变的方法，该方法包括采用上述任一种试剂盒，利用3d-pcr的方法对egfr基因第19号外显子缺失突变进行检测，得到检测数据；以及对检测数据进行读取和分析，得到突变结果。
通过利用本申请的上述试剂盒对样品dna进行检测，能够对至少两种缺失突变中的任意一种一次性地检测出来，在最佳实施例中，能够对19种可能的缺失突变中的任意一种在一次检测中检测出来，不仅提高了检测效率，而且采用3d-pcr的方法进行检测，提高了检测灵敏度，当突变低至0.1％时仍可检测出来。
上述方法中，将样品dna模板、扩增引物对及荧光探针组合混合，得到混合物的步骤中，按照实验需要合理确定各自的用量配比。为了进一步提高检测精确性，在本申请一种优选的实施例中，试剂盒包括缺失突变扩增引物对、野生型扩增引物对、荧光探针组合以及dna受体阻滞剂，采用上述任一种试剂盒，利用3d-pcr的方法对混合物进行检测，得到检测数据；优选地，样品dna模板的最低检测浓度为10～66ng，优选为30ng；优选地，缺失突变扩增引物对、野生型扩增引物对和dna受体阻滞剂的工作浓度为10～500nmol/l，更优选为100～500nmol/l，进一步优选为200nmol/l；优选地，荧光探针组合中，野生型荧光探针vic探针的浓度为10～500nmol/l，缺失突变荧光探针fam探针的浓度为10～1000nmol/l。
将样品dna模板的最低浓度、扩增引物对和两种荧光探针的浓度分别控制在上述优选范围内，有助于提高引物和探针对样品dna的检测灵敏度和检测准确性。
上述检测方法中，3d-pcr反应的步骤采用现有的3d-pcr操作步骤，并根据上述各扩增引物对及探针的具体序列，设置合适的退火温度即可。具体的，包括依次进行变性、退火以及延伸的步骤，优选其中退火步骤中的退火温度为56～60℃。退火温度在该温度范围内，特异性及扩增效率均较高。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了上述任一种试剂盒在3d-pcr法检测egfr基因第19号外显子缺失突变(19del)中的应用。该应用包括科研目的的检测应用，而不包括诊断目的的应用。
下面将结合具体的实施例进一步说明本申请的有益效果。
需要说明的是，下列实施例按照附图1所示的原理设计引物、探针及dna受体阻滞剂，此外，如无特殊说明，所用试剂均来自lifetechnologies公司。
实施例1
采集第19号外显子存在缺失突变(下面简写为19del)的3例阳性样本的外周血血浆dna作为待检样品，具体样品名称、突变基因及类型、提取量及使用量见下表4。
表4：
1.配制pcr混合体系
在超净台中，将在冰上融化完全的野生型荧光探针vic、缺失突变荧光探针fam、19个缺失突变的上游引物的混合物、19个缺失突变的下游引物(为同一下游引物)、3dmastermixv2分别混匀30s，瞬时离心，待用；每份样品的反应液的加入量见下表5，将配置好的pcrmix混匀30s，瞬时离心。
表5：
2.芯片压制
取14.5μl的反应液全部加入刷头下部的加样孔。按压黑色上样(loading)按钮，芯片上样仪(chiploader)会将刷头内的反应液均匀涂抹在芯片上。
3.pcr扩增
将加样完成的芯片放入适配器中，并做标记，将适配器放入pcr仪中，准备检测，按下表6设置程序反应。
表6：
4.下机数据分析结果
pcr扩增结束后，将芯片置于芯片阅读仪器(chipreader)中进行数据读取，采用3d数字pcr分析软件进行分析，最终确定样本是否发生了第19号外显子缺失突变及突变发生的频率。
分析结果见表图2、图3、图4以及表7。其中，图2至图4示出了上述三个样本的散点图显示结果，表7示出了三个样本的突变检测结果。从表7可以看出本申请的方法能够准确的检测出阳性样本中egfr基因的第19号外显子的缺失突变及相应突变频率。
表7：
实施例2
采集第19号外显子存在缺失突变(下面简写为19del)的3例阳性样本的外周血血浆dna作为待检样品，具体样品名称、突变基因及类型、提取量及使用量与表4相同。
在超净台中，将在冰上融化完全的野生型荧光探针vic、缺失突变荧光探针fam、缺失突变的上游引物的混合物(去除第10对引物的上游引物)、缺失突变的下游引物(去除第10对引物的下游引物)、3dmastermixv2分别混匀30s，瞬时离心，待用；每份样品的反应液的加入量见下表8，将配置好的pcrmix混匀30s，瞬时离心。
表8：
将加样完成的芯片放入适配器中，并做标记，将适配器放入pcr仪中，准备检测，按上表6设置程序反应。
分析结果见表9示出了三个样本的突变检测结果。从表9可以看出本申请的方法在去除1对引物对后，仍能够准确的检测出阳性样本中egfr基因的第19号外显子的其他缺失突变及相应突变频率。
表9：
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：相比现有的arms方法中，引物最后一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型dna的扩增，存在假阳性的风险，本申请的针对不同缺失位点设计的特异性扩增引物及taqman探针能特异性地识别、匹配靶序列，不存在假阳性的风险。
而且，利用上述引物、探针等组合，采用3d数字pcr的方法进行检测与传统的实时荧光定量pcr方法完全不同。3d数字pcr的处理方式是将样品处理分割成多个单独的实时荧光定量pcr反应；这些反应之中的一部分含有靶标分子(阳性)，而另外的则不含靶标分子(阴性)。在经过pcr扩增和信号分析后，根据阴性反应的比例对样品中的靶标分子数目进行绝对计数，而不必参照标准品或内源性对照。检测准确性高，且灵敏度高。
此外，在整个工作流程中，密封式的芯片设计，使得样本之间保持完全隔离，可以有效地防止样品交叉污染，减少移液过程，简化操作步骤；同时也避免了微滴式系统可能面临的管路堵塞问题。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>天津诺禾医学检验所有限公司
<120>检测egfr基因第19号外显子缺失突变的试剂盒、方法及其应用